Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, retina dekolmanında transkriptom analizi yapmak üzere insan retinal cerrahi örneklerinden RNA saflaştırmaktır. Bu işlemi gerçekleştirmek için, cerrahi örneğin toplanması için gerekli olan reaktifler ve malzemeler laboratuvarda hazırlanarak hastaneye gönderilir. Cerrahi işlem sırasında örnek toplanır ve laboratuvara geri gönderilir.

Ardından RNA, standart bir sezyum klorür gradyan prosedürü kullanılarak saflaştırılır ve saflaştırılan RNA'nın kalitesi değerlendirilir. Sonuç olarak, mRNA ekspresyon analizi, anahtar genlerin ekspresyonundaki değişikliklerle belirtildiği üzere, retina dekolmanında hem inflamasyonun hem de fotoreseptör dejenerasyonun rol oynadığını göstermektedir. Transkriptomik analizle belirlenen bu süreçlerde, bu yöntemin GTIN klor gibi mevcut orna saflaştırma yöntemlerine göre temel avantajı, ekstraksiyon sonucunda elde edilen orna'nın DNA ile kontamine olmamasıdır.

Bu tekniğin uygulamaları, yeni adjuvan tedaviler geliştirmek için teknik imkanlar sağladığından retina dekolmanı tedavilerine kadar uzanmaktadır. Toplanacak her örnek için, beş mililitrelik steril polietilen yuvarlak tabanlı bir tüpü 2,4 mililitre altı molar RNAs free guin klorür çözeltisi ile doldurmak için RNAs free bir pipet kullanın. Tüplerin üst kısmını doldurmak için argon gazı kullanın.

Ardından, sızdırmazlığı sağlamak için kapağı hızla ve sıkıca bastırarak kapatın. Bu işlem, cerrahi kabinde birkaç yıllık saklama süresi boyunca guine klorürün oksidasyonunu önleyecektir. Daha sonra, beş mililitrelik tüplerin her birini 50 mililitrelik steril polipropilen, konik tabanlı bir tüpe yerleştirin.

Dokuyu ekleyip kapağı sıktıktan sonra, 50 mililitre tüpleri bir polistiren rafa yerleştirin. Ardından rafı ve hazırlanan zarfları, hazırlanan sevkiyat formlarıyla birlikte hastanedeki bir karton kutuya yerleştirin. Karton kutuyu cerrahi dolaptan ameliyathaneye getirin.

Cerrahi sırasında, retinal örneği belirli miktarda klorür çözeltisi ile dolu bir tüpe yerleştirin. Tübü sıkıca kapatın. Tübü kısa bir süre karıştırın.

Ardından tüpü 10 dakika boyunca kan tüpü sallayıcıya yerleştirin. Beraberindeki örnek formunu hasta kimlik bilgileri, cerrahi tarih ve varsa ek notlarla doldurun. Daha sonra kimlik numarasını ilgili numaralı 50 mililitrelik tüpün üzerine yazın.

Ardından, cerrahi örneğin bulunduğu beş mililitrelik tüpü 50 mililitrelik tüpün içine yerleştirin. Kağıt havluyu geri koyun ve tüpü kapatın. Daha sonra, 50 mililitrelik tüpü ve örnek alım formunu uygun destekli zarfa yerleştirip ağzını kapatın.

Numune laboratuvara ulaştığında, tüpü yukarı ve aşağı hareket ettirerek, beş mililitrelik tüp içindeki örneği bir poly tron TM homojenizatör ile maksimum ayarda bir dakika boyunca homojenize edin. Numune homojenize edildikten sonra, polisakkaritleri ekstrakte etmek için 270 µL 2 M potasyum asetat ekleyin ve tüpü yatay konumda bir çalkalayıcıya yerleştirin. 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayın, ardından 20 °C'de 6.500 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından, pellet'i bozmadan çözünür fraksiyonu dikkatlice aspire etmek için bir pipet kullanın. Süpernatantı 14 mililitrelik steril RNase'siz bir tüpe aktarın. Süpernatantın yanına, 100 millimolar Tris içerisindeki %1'lik Laurel Sarkosin'den 5,3 mililitre ve 3,2 gram sezyum klorür ekleyin.

Sarkozin membranı çözgünleştirecek ve sezyum klorür ise bir gradyan oluşturmak için kullanılacaktır. Tüpü bir dakika boyunca vorteksleyerek karıştırın. Steril 11 mililitrelik bir polimer santrifüj tüpüne 1,8 mililitre sezyum klorür EDTA ekleyin.

Ardından 10 mililitrelik steril bir pastör pipeti kullanarak, RNA solüsyonunu tüpün iç yüzeyinden süzülmesini sağlayarak sezyum klorür EDTA solüsyonunun üzerine tabaka halinde ekleyin. Tüpleri bir santrifüje yerleştirin. Gerekirse, dengeleyici olarak retina içermeyen tamponlar içeren ikinci bir tüp kullanın ve 20 °C'de 225.000 G hızında 24 saat boyunca döndürün.

Ertesi gün. Santrifüjden sonra, tüpün üst kısmında bir lipid tabakası oluşmuş olacaktır. DNA orta kısımda yer alacak ve RNA tüpün dibine pelletecektir.

Steril bir paster pipeti kullanarak üstteki lipid tabakasını dikkatlice çekin ve ikinci bir steril paster pipeti ile atın. Vizkoz DNA aspire edilene kadar çözeltiyi kademeli olarak çekin. Çözeltiyi ve DNA'yı atın.

Ardından, üçüncü bir steril pastör pipeti kullanarak kalan çözeltiyi çekip atın. Bu sırada RNA peletini rahatlatmamaya dikkat edin. Şimdi, alevle sterilize edilmiş bir skalpel kullanarak tüpü burada gösterildiği gibi kesin ve üst kısmı atın.

Kalan kısmı steril gazlı bez üzerine baş aşağı yerleştirin. Tüpü ters çevirin ve 160 µL guinid klorür ile hassas bir şekilde durulamak için bir pipet kullanın. Peletin 10 dakika boyunca kurumasına izin verin.

Pelet kuruduktan sonra, 150 µL tris, EDTA-SDS içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından, 150 µL tris, EDTA ve 30 µL 3 M sodyum asetat ekleyin ve RNA'yı çöktürmek için vorteksleyin. 900 µL buz gibi soğuk, %100 etanol ekleyin.

Tüpü vorteksleyin ve 30 dakika boyunca eriyen buz üzerine yerleştirin. Ardından tüpü 4 °C'de 18,000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminden sonra, çok küçük beyaz bir pelet görülebilir veya görülmeyebilir.

Pelet görülüp görülmediğine bakmaksızın, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Ardından, fazla tuzu uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 500 µL %70 etanol ekleyip vorteksleyin; tüpü 4 °C'de 18,000 G'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. %70 etanol yıkama ve santrifüj işlemini tekrarladıktan sonra, kalan tüm etanolü uzaklaştırmak için bir P 200 pipet kullanın.

Peletin 10 dakika boyunca havada kurumasına izin verin. Peleti 50 µL DEY işlem görmüş su içerisinde yeniden süspande edin ve iki dakika boyunca vorteksleyerek güçlü bir şekilde karıştırın. Ardından, örneği 15 dakika boyunca 45 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.

RNA'yı tamamen yeniden süspande etmek için. Son olarak RNA konsantrasyonunu 260 nanometredeki absorbsiyon ile belirleyin ve RNA'yı protokole uygun olarak jel elektroforezi ile analiz edin. Ekli belgede, retinal deplasmanın transkriptomunu incelemek için, retinal deplasmanı olan 18 hasta ve post-mortem retinalar kullanılarak hazırlanan 18 yaş uyumlu kontrolden retinal RNA'yı geri kazanmak ve analiz etmek amacıyla dergi prosedürü uygulanmıştır.

RNA daha sonra saflaştırılmış ve bu raporda açıklandığı üzere jel elektroforezi ve rettino base kullanılarak analiz edilmiştir; burada monosit kemotaktik MCP-1 geni CCL2'nin ekspresyonunu temsil eden radar grafikleri gösterilmektedir. Şeklin RD olarak etiketlenen sağ kısmı retina dekolmanı olan hastalardan alınan RNA'ya karşılık gelirken, N olarak etiketlenen sol kısmı ise burada görülebileceği üzere kontrol grubundan alınan RNA'ları temsil etmektedir. Sağdaki RD örneklerinin çoğunda, soldaki kontrollere kıyasla görülen yüksek Ct değerlerinin belirttiği üzere, retina dekolmanı CCL2'nin regülasyonunun artmasıyla sonuçlanmaktadır.

Burada görülebileceği üzere, bu artış retina dekolmanı olan hastalarda enflamasyonu göstermektedir. Rod fotoreseptör iletim geni GNAT1'in ekspresyonu, CCL2'nin aksine azalmıştır; sağdaki RD örnekleri için değerler düşüktür. Ayrıca kısa dalga koni opsini OPN1SW ve homeo geni CRX'in ekspresyonunda da bir azalma gözlemlenmiş olup, bu durum retina dekolmanı olan hastalarda hem rodların hem de konilerin fotoreseptör dejenerasyonuna işaret etmektedir. Bu yöntem, retina dekolmanı sonrası gen ekspresyonu değişiklikleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, kalıtsal retina dejenerasyonları gibi hayvan modellerindeki diğer retinal patolojilere de uygulanabilir.

Bu yöntemde yeni olan bireyler, nükleik asit bilgisi gerektirdiğinden zorluk yaşayabilirler. Sertifikasyon sonrası RNA işlemleri karmaşık olduğundan, bu yöntemin görsel bir gösterimiyle üzerinden geçilmesi kritik öneme sahiptir.