Name: Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Öğrenin, insan retina cerrahi örneklerinden RNA saflaştırma ve transkriptomik analiz yöntemini. Sezyum klorür gradyanı kullanılarak retinal dekolman hastalığında gen ifadesi değişiklikleri incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz RNA arıtma protokolü düzenleme katkılarından dolayı Sacha Reichman ve Dominique Santiard-Baron teşekkür ederim.

1. Journal: Cerrahi Blok gelen örnekler yeniden elde etmek Prosedürü Laboratuarda <ol><li> Ekspres kargo şirketi bir ithalat sözleşme alın. </li><li> Laboratuvar (Telefon numarası ve E-posta adresi) olarak kişi gösteren laboratuvarın posta adresi ile (veya 25) nakliye formları 10 doldurun. </li><li> (Veya 25) 10 hazırlayın örnek formlar 10 (veya 25) 1 sayılı. Bu formlar), hastanın bir) anonim kimlik hakkında bilgi vermek cerrahi tarih ve c) herhangi bir ek açıklamalar cerrah eklemek istiyorum b özel boşluk. 10 (veya 25) yastıklı zarflar (150 x 210 mm) hazırlayın. </li><li> (DEPC) H2O (GHCl) ile tedavi edilen dietilpirokarbonat içinde 6 M guanidin klorür, RNaz içermeyen reaktifler 25 (veya 65), her ml kullanılarak hazırlandı. </li><li> Dolgu 10 veya 25 GHCl çözüm 2.4 ml 5 ml steril polietilen yuvarlak alt tüpler sayılı. </li><li> Basın ti daha, bu tüplerin üst kısmı doldurmak için argon gazı kullanılırghtly cerrahi kabininde depolama birkaç yıldır GHCl çözeltisi oksidasyonunu önlemek için kap. </li><li> 50 ml steril polipropilen konik alt tüp vidalı kapaklı her 5 ml tüpler tanıtmak. 50 ml tüp içine 5 ml tüp tutmak için temiz bir kağıt doku parçası kullanın, tüp kapatın. </li><li> Yastıklı zarflar, nakliye formları, örnekleri formları ile bir karton kutu içine bir polistiren raf ve raf 50 ml tüpler yerleştirin. </li><li> Onların okuma kolaylaştırmak için karton kutusunun kapağının iç: talimatları (1,12-1,19 bakınız) yapıştırın. </li><li> Hastanede kişi posta ile karton kutu gönder. </li></ol> Hastanede <ol start="11"><li> Cerrahi odasına cerrahi kabinden karton kutu getirin. Not Dikkat: prosedürü bir bağışıklık sistemi zayıflamış hasta içeriyorsa, karton cerrahi odasına getirildi olmamalıdır. </li><li> Ameliyat sırasında, retina specim yersayılı 5 ml steril polipropilen içine en GHCl çözümü ile dolu. Tüpü sıkıca kapatın. </li><li> Kısaca Tüp tekrar. </li><li> 10 dakika boyunca kan tüpü külbütör tüp yerleştirin. </li><li> Ekteki örnek numaralı formu doldurun. </li><li> İlgili sayılı 50 ml tüp üzerine kimlik numarası bildirin. </li><li> 50 ml tüp içine cerrahi örnek ile 5 ml tüp tanıtmak, kağıt mendil yerine ve tüp vida. </li><li> Ekteki yastıklı zarf birinde tüp ve içine doldurulmuş örnek form tanıtmak. Kapatın. </li><li> Almak için ekspres kargo şirketi arayın. </li></ol> 2. RNA Arıtma Laboratuarda <ol><li> Tüp yukarı ve aşağı hareket ederken 1 dakika bir homojenizatör ile GHCl çözümü ile 5 ml tüp polipropilen numune homojenize. </li><li> 2 M potasyum asetat, pH 5.0, 270 ul ekleyin. Onun bir çalkalayıcı tüpü yerleştirilerek 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanıryatay konumda (420 min-1). </li><li> 20 ° C&#39;de 5000 rpm (6500 xg) 10 dakika santrifüj </li><li> Pelet bozmadan düzgün çözünür fraksiyon aspire. </li><li> Bir 14 ml&#39;lik steril bir tüpe aktarın. </li><li> 100 mM Tris, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1% 5.3 ml ilave edilir. </li><li> Sezyum Klorür (CsCl) 3.2 g ekleyin ve karıştırın tarafından tüp karıştırın. </li><li> , Steril bir 11 ml&#39;lik santrifüj tüpüne polyallomer CsCI / etilen-diamintetraasetik asit (EDTA), 1.8 ml ilave edilir. </li><li> 10 ml&#39;lik steril bir Pasteur pipeti ile, yoğunluk yastık rahatsız etmemek için tüpün kenarına yavaş kaydırarak 1.8 mi CsCI / EDTA üzerine RNA çözeltisi aktarın. </li><li> Rotor içine tüpler (retina gerekirse olmadan tampon içeren ikinci bir tüp) yerleştirin. </li><li> 20 ° C&#39;de 32.000 rpm (225,000 xg) 24 saat santrifüj </li><li> Steril bir Pasteur pipeti ile çözüm üstün parçası kaldırmak, ve atın. </li><li> Kontrol ederken yavaş yavaş çıkarınDNA (viskoz) ikinci bir steril Pasteur pipet ile aspire, ve atın bir an. </li><li> Üçüncü bir steril Pasteur pipeti ile RNA pelet serbest bırakmak için özen kalan çözüm çıkarın. </li><li> Ile tüp bölümü altındaki bir neşter alev sterilize edilmiş, sonra steril bir ters bakışları borunun geri kalan kısmı koydu. </li><li> Tüp ters ve GHCl 160 ul ile ince durulayın. </li><li> 10 dakika pelet kurumaya bırakın. </li><li> 150 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) içinde pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 2 ml steril mikrosantrifüj tüpü içine transfer çözeltisi, daha sonra 30 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) ile kalıntı pelet hasat. </li><li> 150 ul (- 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.5) ilave edilir. </li><li> 3 M sodyum asetat, pH 5.0, girdap tüpün 30 ul ekle. </li><li> Etanol% 100 (-20 ° C), vorteks tüpün 900 ul ekleyin. </li><li> Erime buz tüpü 30 dakika yerleştirin. </li><li> Cen4 ile 15,000 rpm&#39;de 30 dakika tüp ° C trifuge </li><li> Ince çözünür fraksiyon aspire, ve atın. </li><li> 500 ul% 70 etanol (RT), girdap tüp ekleyin. </li><li> 4 az 15.000 rpm (18.000 xg) tüp 20 dakika ° C santrifüj </li><li> Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın. </li><li> Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır. </li><li> 10 dakika için pelet hava kurumasını bekleyin. </li><li> 50 ul DEPC ile tedavi edilen H 2 O içinde pelletini tekrar </li><li> Vorteks şiddetle karıştırın. </li><li> Bir su banyosu içinde 45 ° C&#39;de 15 dakika ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 3. Jel Elektroforez RNA Analizi <ol><li> Bir kimyasal kaput içinde bir agaroz jel dökün. </li><li> Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde, analiz edilecek RNA 2 ul ve örnek hazırlık tampon 6.4 ul ekleyin. </li><li> Ikinci bir 1.5 ml lik tüp içinde, RNA standartları 3 ul ve örnek hazırlık tamponu 9.6 ul ekleyin. </li><li> 65, tüpler 15 dakika ısıtın ° C, Buz koydu. </li><li> RNA örnek tüpü ve RNA standartları tüp boya ile 1 ul EB yükleme tampon boya olmadan 1 ul etidyum bromür (EB) yükleme tamponu ekleyin. </li><li> Bir boya (bromofenol mavisi) jelin alt 2/3 ulaşıncaya kadar akan tampon kimyasal bir başlık içinde 100 V, - 80 altında jel çalıştırın. </li><li> Jel 250 ml iyonu DEPC işlenmiş 2x SSC ile iki kere 15 dakika çalkalayın. </li><li> UV aydınlatma altında dijitalize edilen görüntü almak. </li><li> Üst bant (23S rRNA) ve alt bant (16S rRNA) arasındaki oranı hesaplar. </li></ol> 4. RNA son saflaştırma <ol><li> DEPC ile tedavi edilen H 2 O (gerekirse) ile 100 ul RNA örnek hacmi ayarlayın. </li><li> 100 ul fenol asit (1 mi fenol sodyum asetat, pH 5.2, 50 mM DEPC işlenmiş H2O + 130 ul içinde doyurulmuş) kuvvetli bir şekilde karıştırın. Ekleme </li><li> Oda sıcaklığında 13.000 rpm&#39;de (15000 x g) de 10 dakika santrifüj yapılır. </li><li> RecoveR, yeni bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine sulu faz (üst faz) ve dikkatli bir şekilde aktarılır. </li><li> 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve etanol içindeki 250 ul% 100 (-20 ° C) 10 ul ekle. </li><li> Erime buz içine tüp 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 30 ° C dakika santrifüj </li><li> Dikkatlice aspire çözünebilir fraksiyon ve atın. </li><li> 500% 70 etanol ul (oda sıcaklığı) ve tüp vorteks ekleyin. </li><li> 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 20 ° C dakika santrifüj </li><li> Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın. </li><li> Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır. </li><li> Hava 10 dakika süre ile pellet kuruması beklenir. </li><li> DEPC işlenmiş H 2 O. 50 ul içine pelletini </li><li> Sonra 45 tüp 15 dakika ° C inkübe </li><li> RNA numunesinin üzerine 2 ul 260 nm ve 280 nm&#39;de absorbans (ABS) ölçün. Oranı Abs260/Abs280 hesaplanmıştır. </li> &lt;li&gt; Mağaza -80 RNA örnek ° C (birkaç yıldır istikrarlı). </li></ol> 5. Çözümler ve Temizleme Prosedürleri <ol><li> Potasyum asetat 2 M, pH 5.0: DEPC ile muamele H 2 O., 70 ml içine 19.6 g potasyum asetat çözülür DEPC işlenmiş H 2 O ile 5 durulama ardından, 15 dakika boyunca 1 M NaOH ile içine ıslatarak pH metre prob temizlemek Asetik asit ile pH 5.0 &#39;a ayarlayın ardından DEPC ile muamele H 2 O ile 100 ml hacim ayarlama </li><li> Tris-HCl, 100 mM, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1:% 0.5 M Tris-bazlı bir pH 8.0 40 ml N-Lauroylsarcosine 2 g (bir davlumbaz altında) çözülür. ) DEPC tedavi H 2 O ile 200 ml ses seviyesini ayarlamak CSCL / EDTA: DEPC tedavi H 2 O ile hazırlanan 50 ml 10 mM EDTA pH 7.5 CSCL 96 g Otoklav ve DEPC ile tedavi edilen H 2 O ile 100 ml ses seviyesini ayarlamak PH &lt;7.5 olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Agaroz jel% 1: 62 ml DEPC tedavi H 2 O içinde agaroz 1 g koyun Bir mikrodalga fırında kaynatın. 12.3 M, 18 mlformaldehit, 5x MOPS 20 mi. Bir kimyasal kaput içinde dökün. </li><li> Örnek hazırlık Tampon: hazırlanan hazırlıksız olmak. 5x MOPS, 12.3 M formaldehit ve formamidin 40 ul 16 ul arasında kimyasal bir kaput 8 ul içinde karıştırın. </li><li> EB yükleme tamponu (boya olmadan): hazırlanan hazırlıksız olmak. DEPC işlenmiş H 2 O. ile hazırlanan% 80 gliserol, 20 ul halinde 4 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin </li><li> EB yükleme tamponu (boya ile): hazırlanan hazırlıksız olmak. % 0.25 ksilen cyanol, DEPC ile muamele H 2 O ile% 0.25 bromofenol mavisi ihtiva eden% 80 gliserol, 10 ul içine 2 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin </li><li> Tampon Koşu: 60 ml 5x MOPS için, 12.3 M formaldehit 54 ml DEPC ile tedavi edilen H 2 O 186 ml </li><li> Karıştırarak, 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca% 0.1 v / v dietilpirokarbonatla inkübe damıtılmış su ° C: H 2 O DEPC ile muamele edildi. Otoklav ile sterilize edin. </li><li> Homojenleştiriciyi temizlenmesi: 1 L temizlik çözeltisi, 25 ml (RBS) ekleyin DEPCH2O muamele edilmiş ve karıştırma ile eksen 1 dakika immerge. 60 ° C&#39;de 2 saat inkübe ° C. Alüminyum içine DEPC ile tedavi edilen H 2 O Wrap aracı ile iyice durulayın ve alet kutusuna koydu. Kutusu sarın. Otoklav ile sterilize edin. </li><li> Elektroforez cihazı Temizleme: cihazı, tepsi ve 15-kuyu tarak yıkayın. % 3 hidrojen peroksit oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. % 100 etanol ile bir kez yıkayın. Hava kuru. </li><li> Cam temizlik yemekler: tüm gece cam yemekleri RBS 2% temizleyin, daha sonra 200 ° C&#39;de sterilize edilmeden önce distile su ile durulayın </li></ol>

<ol><li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment%3A+geographical+variation+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).</li>
<li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710(2010).</li>
<li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633(1974).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663(1990).</li>
<li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315(1975).</li>
<li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261(1981).</li>
<li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791(2011).</li>
<li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RETINOBASE%3A+a+web+database%2C+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208(2008).</li>
<li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425(2007).</li>
<li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases%3A+from+clinic+to+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16(2010).</li>
<li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74(2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Cerrahi blok doku kurtarma için bir prosedürün geliştirilmesi retina dekolmanı transcriptome analizi için gerekli olmuştur. Bir cerrahi bu tip acil durumlarda ve göz doktorlarının çalışma, faaliyet zaman biyolojik bir araştırma programına katılmak için çok az zaman var uygulanan olduğunu dikkate almalıyız. Bu retinektomi da istatistiksel numaraları ulaşmak için daha kolay bir şekilde bir ağ ile çalışmak, böylece her hizmet stokastik gerçekleştirilir. Bu ağ olarak, doku toplama standardizasyon biyolojik analiz başarısı g...

Retina dekolmanı temel tedavi amacı (RD) retina pigment epitel hücrelerinden fotoreseptör ayrılması kaynaklanan fotoreseptör hücre hasarı ve retina iltihabı sınırlamak için bir yol bulmaktır. RD sırasında, RPE hücreleri dediferansiye, göç, aktive edilir ve komplikasyonlara yol açabilir kasılma güçleri uygulamakla, müstakil retina yüzeyinde çoğalırlar. RD transkriptomik analizi RD ve cerrahi ile birlikte son görme sonucu geliştirmek dolayısıyla gelecekteki tedavi molekülleri takip modifiye ifade ile hedef genleri tanımlamak için bir yoldur. İyi deoksiribonükleik asit (DNA) olarak ribonükleik asit (RNA) sabit değil bilinen, genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır ikincisi, istikrarı 2 eski 30.000 &#39;den fazla yıllık paleontolojik örneklerinden Neandertal genomunun diziliminin izin vardı. Haberci RNA&#39;ya genomundan genlerin DNA transkripsiyonbüyük gen ifadesinde süreci ve mRNA bir sinyal teşkil için kararsızdır. RNA&#39;lar sinyal sona RNAse enzimler tarafından çok hızlı bir şekilde bozulmuş. Ifade bir araştırma laboratuvarında incelenmiştir önce dokularının organizma izole zaman, RNA&#39;lar çok sık bozulmuş. Bozulmuş RNA analizi gen ekspresyonu için uygun değildir. Laboratuvar personeli ameliyat katılamazlar çünkü, biz kolay bir prosedür geliştirdiği ve sadece cerrah uygun RNAse-ücretsiz bir çözüm içine dokuları kurtarmak için gerektirir. Dokuların RNA stabildir ve bu çözelti, oda sıcaklığında, 72 saat sonra herhangi bir bozulma işareti olmadan analiz edilebilir. Örneklerden RNA&#39;lar laboratuar 3 aktarıldıktan sonra, bir sezyum klorür gradyanı üzerinde ultrasantrifügasyon, bir içeren bir standart yöntem ile saflaştırılır. Daha sonra, RNA kalitesi agaroz jel elektroforezi ve RT-PCR ile incelenmiştir. RNA saflaştırma protokolü vardırDNA ve RNA için farklıdır ve RNA geni ekspresyon çalışmalarında yapısından sinyaller üretecek bir DNA molekülü tarafından kirlenmemesini sağlar kendi yoğunluğuna göre moleküllerin ayrılması avantaj sağlar. Buna ek olarak, sayısal olarak bir hücre içinde en bol RNA olan transferi RNA&#39;lar (tRNA), ribozomal RNA (rRNA) ve haberci RNA&#39;lar (mRNA), olmak bu iki sonuncusu, aynı fiziksel özelliğine göre ayrılır arıtma sürecinin ürünü sonunda. Mikrodizi analitik protokolleri en tRNA, 4-6 tarafından inhibe ters transkriptazlar, ve RNA polimerazlarının kullanımının, çünkü dahil hazırlanmasından tRNA kaldırılması yararlıdır. Cerrahi örneklerden saf RNA standart bir protokol kullanarak etiketli ve bir mikroarray çip melezleşmiştir ve sonuçları iki tamamlayıcı yöntem, yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak ve karşılıklı bilgi ve visuali dayalı yeni bir yöntem kullanılarak analiz edilmektedir edilirWeb-tabanlı sunucu Retinobase 7,8 üzerinde zed.

<table><tbody><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Aventi J-E</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JS-5.3</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>LE 80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW41</td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Biorad</td><td>Pac 3000</td><td></td></tr><tr><td>PolytronTM</td><td>Kinematica</td><td>PT 2100</td><td>Birlikte Verilir PT-DA 2105:2</td></tr><tr><td>Agaroz jel elektroforez cihazı</td> ile <td>Biorad</td><td>MiniGel Cell GT</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme Sistemi </td><td>Biorad</td><td>GelDoc-It Görüntüleyici</td><td></td></tr><tr><td>5 ml steril polietilen tüp</td><td>Greiner</td><td>115261</td><td></td></tr><tr><td>Steril poliallomer santrifüj tüpü </td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal reaktifler</td><td>Sigma</td><td></td><td>Moleküler biyoloji sınıfı (RNase ve DNaz içermeyen ürünler)</td></tr><tr><td>Temizleme Solüsyonu </td><td>VWR</td><td>RBS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroarray çip</td><td>Affymetrix</td><td>İnsan U133 artı 2 dizi</td><td></td></tr></tbody></table>

journal kullanarak İnsan retina cerrahi Örneklerinin transkriptomik analizi

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retina dekolmanı (RD) retina pigment epiteli (RPE) gelen nörosensöriyel retinanın bir ayrılık açıklar. RPE ışığa duyarlı nöronlar, fotoreseptör normal fonksiyonu için gereklidir. RPE, retina dekolmanı hücre dışı sıvı ile dolu bir fiziksel boşluk oluşturur. RD nörosensöriyel retina ve iyonları ve metabolitleri fizyolojik değişim ciddi tedirgin çünkü RPE hem etkileyen hücresel ve moleküler yan etkiler başlatır. Vizyonu için sonucu vizyonu 1 restorasyon iki doku sonuçları hızlı bir reapposition beri dekolmanı süresi ile ilgilidir. RD tedavisi sadece cerrahidir. Vitreus jeli (vitrektomi) çıkarılması retina dekolmanı lehine müstakil alanı çevresinde retina kaldırılması olmayan parçası takip eder. Kaldırılan retina örnekleri res nullius (bir şey) ve dolayısıyla normal atılır.Bu cerrahi örneklerden RNA kurtarmak için, laboratuvara cerrahi blok aktarımı sırasında RNA koruma sağlar prosedürü dergi geliştirdi. Ayrıca sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol saflaştırılmış RNA&#39;lar küresel gen ekspresyon analizi için uygun olduğunu sağlamak için. RNA kalitesi hem RT-PCR ve mikroarray analizi ile doğrulandı. Verilerin analizi RD iltihap ve fotoreseptör dejenerasyonunun bir anda tutulumu görülmektedir.

Prosedür Dergisi (Şekil 1) bize saflaştırılmış RNA için cerrahi blok retina örnekleri kurtarmak ve retina dekolmanı transcriptome analiz etmeyi sağlar. Monosit kemotaktik MCP1 gen CCL2, en upregülasyonu ve gen GNAT1, kısa dalga koni opsin OPN1SW ve homeogene CRX (Şekil 2) iletici çubuk fotoreseptör ifade azalma retina dekolmanı sonuçları. GNAT1, OPN1SW ve CRX eş zamanlı olarak indirgenmesi fotoreseptör dejenerasyonu, çubuk ve koni he...

Biz retina dekolmanı bir transkriptomik analizi için retinektomi gelen retina örnekleri kullanılır. Ayrıca, cerrahi blokları ve laboratuar arasında RNA koruma sağlayan bir işlem geliştirilmiştir. Biz saflaştırılmış RNA mikroarray analizi için uygun olduğunu sağlamak için sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol.

Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Bu prosedürün genel amacı, retina dekolmanında transkriptom analizi yapmak üzere insan retinal cerrahi örneklerinden RNA saflaştırmaktır. Bu işlemi gerçekleştirmek için, cerrahi örneğin toplanması için gerekli olan reaktifler ve malzemeler laboratuvarda hazırlanarak hastaneye gönderilir. Cerrahi işlem sırasında örnek toplanır ve laboratuvara geri gönderilir.Ardından RNA, standart bir sezyum klorür gradyan prosedürü kullanılarak saflaştırılır ve saflaştırılan RNA'nın kalitesi değerlendirilir. Sonuç olarak, mRNA ekspresyon analizi, anahtar genlerin ekspresyonundaki değişikliklerle belirtildiği üzere, retina dekolmanında hem inflamasyonun hem de fotoreseptör dejenerasyonun rol oynadığını göstermektedir. Transkriptomik analizle belirlenen bu süreçlerde, bu yöntemin GTIN klor gibi mevcut orna saflaştırma yöntemlerine göre temel avantajı, ekstraksiyon sonucunda elde edilen orna'nın DNA ile kontamine olmamasıdır.Bu tekniğin uygulamaları, yeni adjuvan tedaviler geliştirmek için teknik imkanlar sağladığından retina dekolmanı tedavilerine kadar uzanmaktadır. Toplanacak her örnek için, beş mililitrelik steril polietilen yuvarlak tabanlı bir tüpü 2,4 mililitre altı molar RNAs free guin klorür çözeltisi ile doldurmak için RNAs free bir pipet kullanın. Tüplerin üst kısmını doldurmak için argon gazı kullanın.Ardından, sızdırmazlığı sağlamak için kapağı hızla ve sıkıca bastırarak kapatın. Bu işlem, cerrahi kabinde birkaç yıllık saklama süresi boyunca guine klorürün oksidasyonunu önleyecektir. Daha sonra, beş mililitrelik tüplerin her birini 50 mililitrelik steril polipropilen, konik tabanlı bir tüpe yerleştirin.Dokuyu ekleyip kapağı sıktıktan sonra, 50 mililitre tüpleri bir polistiren rafa yerleştirin. Ardından rafı ve hazırlanan zarfları, hazırlanan sevkiyat formlarıyla birlikte hastanedeki bir karton kutuya yerleştirin. Karton kutuyu cerrahi dolaptan ameliyathaneye getirin.Cerrahi sırasında, retinal örneği belirli miktarda klorür çözeltisi ile dolu bir tüpe yerleştirin. Tübü sıkıca kapatın. Tübü kısa bir süre karıştırın.Ardından tüpü 10 dakika boyunca kan tüpü sallayıcıya yerleştirin. Beraberindeki örnek formunu hasta kimlik bilgileri, cerrahi tarih ve varsa ek notlarla doldurun. Daha sonra kimlik numarasını ilgili numaralı 50 mililitrelik tüpün üzerine yazın.Ardından, cerrahi örneğin bulunduğu beş mililitrelik tüpü 50 mililitrelik tüpün içine yerleştirin. Kağıt havluyu geri koyun ve tüpü kapatın. Daha sonra, 50 mililitrelik tüpü ve örnek alım formunu uygun destekli zarfa yerleştirip ağzını kapatın.Numune laboratuvara ulaştığında, tüpü yukarı ve aşağı hareket ettirerek, beş mililitrelik tüp içindeki örneği bir poly tron TM homojenizatör ile maksimum ayarda bir dakika boyunca homojenize edin. Numune homojenize edildikten sonra, polisakkaritleri ekstrakte etmek için 270 µL 2 M potasyum asetat ekleyin ve tüpü yatay konumda bir çalkalayıcıya yerleştirin. 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayın, ardından 20 °C'de 6.500 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işleminin ardından, pellet'i bozmadan çözünür fraksiyonu dikkatlice aspire etmek için bir pipet kullanın. Süpernatantı 14 mililitrelik steril RNase'siz bir tüpe aktarın. Süpernatantın yanına, 100 millimolar Tris içerisindeki %1'lik Laurel Sarkosin'den 5,3 mililitre ve 3,2 gram sezyum klorür ekleyin.Sarkozin membranı çözgünleştirecek ve sezyum klorür ise bir gradyan oluşturmak için kullanılacaktır. Tüpü bir dakika boyunca vorteksleyerek karıştırın. Steril 11 mililitrelik bir polimer santrifüj tüpüne 1,8 mililitre sezyum klorür EDTA ekleyin.Ardından 10 mililitrelik steril bir pastör pipeti kullanarak, RNA solüsyonunu tüpün iç yüzeyinden süzülmesini sağlayarak sezyum klorür EDTA solüsyonunun üzerine tabaka halinde ekleyin. Tüpleri bir santrifüje yerleştirin. Gerekirse, dengeleyici olarak retina içermeyen tamponlar içeren ikinci bir tüp kullanın ve 20 °C'de 225.000 G hızında 24 saat boyunca döndürün.Ertesi gün. Santrifüjden sonra, tüpün üst kısmında bir lipid tabakası oluşmuş olacaktır. DNA orta kısımda yer alacak ve RNA tüpün dibine pelletecektir.Steril bir paster pipeti kullanarak üstteki lipid tabakasını dikkatlice çekin ve ikinci bir steril paster pipeti ile atın. Vizkoz DNA aspire edilene kadar çözeltiyi kademeli olarak çekin. Çözeltiyi ve DNA'yı atın.Ardından, üçüncü bir steril pastör pipeti kullanarak kalan çözeltiyi çekip atın. Bu sırada RNA peletini rahatlatmamaya dikkat edin. Şimdi, alevle sterilize edilmiş bir skalpel kullanarak tüpü burada gösterildiği gibi kesin ve üst kısmı atın.Kalan kısmı steril gazlı bez üzerine baş aşağı yerleştirin. Tüpü ters çevirin ve 160 µL guinid klorür ile hassas bir şekilde durulamak için bir pipet kullanın. Peletin 10 dakika boyunca kurumasına izin verin.Pelet kuruduktan sonra, 150 µL tris, EDTA-SDS içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından, 150 µL tris, EDTA ve 30 µL 3 M sodyum asetat ekleyin ve RNA'yı çöktürmek için vorteksleyin. 900 µL buz gibi soğuk, %100 etanol ekleyin.Tüpü vorteksleyin ve 30 dakika boyunca eriyen buz üzerine yerleştirin. Ardından tüpü 4 °C'de 18,000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminden sonra, çok küçük beyaz bir pelet görülebilir veya görülmeyebilir.Pelet görülüp görülmediğine bakmaksızın, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Ardından, fazla tuzu uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 500 µL %70 etanol ekleyip vorteksleyin; tüpü 4 °C'de 18,000 G'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. %70 etanol yıkama ve santrifüj işlemini tekrarladıktan sonra, kalan tüm etanolü uzaklaştırmak için bir P 200 pipet kullanın.Peletin 10 dakika boyunca havada kurumasına izin verin. Peleti 50 µL DEY işlem görmüş su içerisinde yeniden süspande edin ve iki dakika boyunca vorteksleyerek güçlü bir şekilde karıştırın. Ardından, örneği 15 dakika boyunca 45 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.RNA'yı tamamen yeniden süspande etmek için. Son olarak RNA konsantrasyonunu 260 nanometredeki absorbsiyon ile belirleyin ve RNA'yı protokole uygun olarak jel elektroforezi ile analiz edin. Ekli belgede, retinal deplasmanın transkriptomunu incelemek için, retinal deplasmanı olan 18 hasta ve post-mortem retinalar kullanılarak hazırlanan 18 yaş uyumlu kontrolden retinal RNA'yı geri kazanmak ve analiz etmek amacıyla dergi prosedürü uygulanmıştır.RNA daha sonra saflaştırılmış ve bu raporda açıklandığı üzere jel elektroforezi ve rettino base kullanılarak analiz edilmiştir; burada monosit kemotaktik MCP-1 geni CCL2'nin ekspresyonunu temsil eden radar grafikleri gösterilmektedir. Şeklin RD olarak etiketlenen sağ kısmı retina dekolmanı olan hastalardan alınan RNA'ya karşılık gelirken, N olarak etiketlenen sol kısmı ise burada görülebileceği üzere kontrol grubundan alınan RNA'ları temsil etmektedir. Sağdaki RD örneklerinin çoğunda, soldaki kontrollere kıyasla görülen yüksek Ct değerlerinin belirttiği üzere, retina dekolmanı CCL2'nin regülasyonunun artmasıyla sonuçlanmaktadır.Burada görülebileceği üzere, bu artış retina dekolmanı olan hastalarda enflamasyonu göstermektedir. Rod fotoreseptör iletim geni GNAT1'in ekspresyonu, CCL2'nin aksine azalmıştır; sağdaki RD örnekleri için değerler düşüktür. Ayrıca kısa dalga koni opsini OPN1SW ve homeo geni CRX'in ekspresyonunda da bir azalma gözlemlenmiş olup, bu durum retina dekolmanı olan hastalarda hem rodların hem de konilerin fotoreseptör dejenerasyonuna işaret etmektedir. Bu yöntem, retina dekolmanı sonrası gen ekspresyonu değişiklikleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, kalıtsal retina dejenerasyonları gibi hayvan modellerindeki diğer retinal patolojilere de uygulanabilir.Bu yöntemde yeni olan bireyler, nükleik asit bilgisi gerektirdiğinden zorluk yaşayabilirler. Sertifikasyon sonrası RNA işlemleri karmaşık olduğundan, bu yöntemin görsel bir gösterimiyle üzerinden geçilmesi kritik öneme sahiptir.

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Diseksiyon tekniği vitreus, retina ve lens gelen fare göz, santrifüj yoluyla ayrılması ve protein deneyleri ile karakterizasyonu eviserasyon göstermektedir.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

Kağıt kadavra donör oküler Dünya'dan retina dokuları içini temizlemek için basitleştirilmiş bir tüketim kornea tekniği ve açıklar. Tekniği oküler dünyanın diğer dokulara zarar vermeden nakli, cerrahi veya araştırma amaçlı kullanılmak üzere özel tüketim kaliteli dokular için yardımcı olacaktır Burada anlatılan.

Için Basitleştirilmiş Tekniği<em&gt; Yerinde</emİnsan Oküler Globe gelen Kornea ve Retina Doku Eviserasyon of&gt; eksizyonu

Bir retina uyarıcı içinde tek tek elektrotlar doğrudan bitişik retina hücre mimarisini görselleştirmek teknikleri.

Lokalize histopatolojik analizi için bir Retina Protez ile implant İşleme Gözler Teknikleri

İnsan retina fovea, makula ve periferik retina gibi işlevsel ve tatlı farklı bölgelerinde oluşur. Burada, incelemek ve bu farklı retina bölgeler aşağı akım proteomik analiz için toplamak için punch biyopsi ve doku katmanları bir insan gözünün üzerinden el ile kaldırılması kullanarak bir yöntemi açıklanmaktadır.

İnsan Retina ve RPE koroid diseksiyon proteomik analizi için

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE'nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin, insan retina cerrahi örneklerinden RNA saflaştırma ve transkriptomik analiz yöntemini. Sezyum klorür gradyanı kullanılarak retinal dekolman hastalığında gen ifadesi değişiklikleri incelenir.

Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Daha fazla video keşfet