Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, retina dekolmanında transkriptom analizi için insan retinal cerrahi örneklerinden RNA'yı saflaştırmaktır. Bunun için dergi kullanılarak, cerrahi numunenin toplanması için gerekli reaktifler ve materyaller laboratuvarda hazırlanır ve hastaneye gönderilir. Cerrahi işlem sırasında numune toplanır ve laboratuvara geri gönderilir.

RNA daha sonra standartlaştırılmış bir sezyum klorür gradyan prosedürü kullanılarak saflaştırılır ve saflaştırılmış RNA'nın kalitesi değerlendirilir. Nihayet. mRNA ekspresyonunun analizi, hem inflamasyonun hem de fotoreseptör dejenerasyonunun, anahtar genlerin ekspresyonundaki değişikliklerle gösterilen retina dekolmanı ile ilgili olduğunu göstermektedir. Transkriptomik analiz ile tanımlanan bu süreçlerde, derginin ole olarak da bilinen ekstraksiyondan elde edilen GTIN klor gibi mevcut orna saflaştırmasına göre ana avantajı, orna'nın DNA ile kontamine olmamasıdır.

Bu tekniğin uygulanması, yeni adjuvan tedavilerin geliştirilmesi için teknik araçlar sağladığı için retina dekolmanı tedavilerine kadar uzanır. Toplanacak her numune için, beş mililitre steril polietilen yuvarlak tabanlı bir tüpü 2.4 mililitre altı molar RNA içermeyen bir guine chloride çözeltisi ile doldurmak için RNA içermeyen bir pipet kullanın. Tüplerin üst kısmını doldurmak için argon gazı kullanın.

Ardından, sızdırmaz olduğundan emin olmak için sıkıca bastırarak kapağı hızlı bir şekilde yerleştirin. Bu, cerrahi dolapta birkaç yıl saklandıktan sonra guine klorürün oksidasyonunu önleyecektir. Ardından, beş mililitrelik tüplerin her birini 50 mililitrelik steril polipropilen, konik tabanlı bir tüpe yerleştirin.

Mendil ekledikten ve kapağı vidaladıktan sonra, 50 mililitrelik tüpleri polistiren bir rafa yerleştirin. Daha sonra rafı ve hazırlanmış zarfları, hazırlanan nakliye formlarıyla birlikte hastanede bir karton kutuya yerleştirin. Karton kutuyu ameliyat dolabından ameliyathaneye getirin.

Ameliyat sırasında, retina örneğini miktar ve klorür çözeltisi ile dolu bir tüpe yerleştirin. Tüpü sıkıca kapatın. Tüpü kısaca karıştırın.

Ardından tüpü 10 dakika boyunca kan tüpü rocker'ına yerleştirin. Ekteki numune formunu hasta kimliği, ameliyat tarihi ve ek açıklamalarla doldurun. Ardından kimlik numarasını ilgili numaralı 50 mililitrelik tüpe yazın.

Daha sonra cerrahi numunenin bulunduğu beş mililitrelik tüpü 50 mililitrelik tüpe yerleştirin. Kağıt mendili değiştirin ve tüpün kapağını kapatın. Ardından 50 mililitrelik tüpü ve numune giriş formunu uygun yastıklı zarfa yerleştirin ve kapatın.

Numune laboratuvarda alındıktan sonra, numuneyi beş mililitrelik tüpünde bir poli tron TM homojenizatör ile maksimum ayarda bir dakika boyunca homojenize edin ve tüpü yukarı ve aşağı hareket ettirin. Numune homojenize edildikten sonra, polisakkaritleri çıkarmak için 270 mikrolitre iki molar potasyum asetat ekleyin ve tüpü yatay konumda bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. 10 dakika kuvvetlice çalkalayın, ardından 20 santigrat derecede 6.500 G'de 10 dakika santrifüjleyin.

Döndürme işleminden sonra, peleti bozmadan çözünür fraksiyonu dikkatlice aspire etmek için bir pipet kullanın. Süpernatanı 14 mililitrelik steril RNA içermeyen bir tüpe aktarın. Süpernatantın yanına 5.3 mililitre% 1 ve 100, milimolar tri ve 3.2 gram sezyum klorür içinde Laurel Sarkosin ekleyin.

Sarkozin, zarı çözündürür ve sezyum klorür, bir gradyan oluşturmak için kullanılır. Tüpü bir dakika boyunca girdaplayarak karıştırın. Steril 11 mililitrelik polimer santrifüj tüpüne 1.8 mililitre sezyum klorür EDTA ekleyin.

Daha sonra 10 mililitrelik steril bir papaz pipeti ile RNA solüsyonunu, tüpün iç yüzeyinden aşağı akmasına izin vererek sezyum klorür EDTA solüsyonu üzerine katmanlayın. Tüpleri bir santrifüje yerleştirin. Gerekirse denge olarak retinasız tamponları içeren ikinci bir tüp kullanın ve 20 santigrat derecede 225.000 G'de 24 saat döndürün.

Ertesi gün. Dönüşü takiben, tüpün üst kısmında bir lipit tabakası oluşmuş olacaktır. DNA ortada olacak ve RNA tüpün dibinde peletlenecektir.

İkinci bir steril macun pipeti ile üst lipit tabakasını dikkatlice çıkarmak ve atmak için steril bir macun pipeti kullanın. Viskoz DNA aspire edilene kadar çözeltiyi yavaş yavaş çıkarın. Çözeltiyi ve DNA'yı atın.

Daha sonra üçüncü bir steril pastör pipeti kullanarak kalan çözeltiyi çıkarın ve atın. RNA peletini rahatsız etmemeye özen gösterin. Şimdi alevle sterilize edilmiş bir neşter kullanarak, tüpü burada gösterildiği gibi kesin ve üst kısmı atın.

Kalan kısmı steril gazlı bez üzerine baş aşağı yerleştirin. Tüpü ters çevirin ve 160 mikrolitre guine klorür ile hassas bir şekilde durulamak için bir pipet kullanın. Peleti 10 dakika kurumaya bırakın.

Pelet kuruduktan sonra, 150 mikrolitre tris, E-D-T-A-S-D-S içinde yeniden süspanse edilir. Daha sonra, 150 mikrolitre tris, EDTA ve 30 mikrolitre üç molar sodyum asetat ekleyin ve ardından RNA'yı çökeltmek için girdap yapın. 900 mikrolitre buz gibi,% 100 etanol ekleyin.

Tüpü girdaplayın ve 30 dakika boyunca eriyen buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra tüpü dört santigrat derecede 18.000 G'de 30 dakika santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, küçük beyaz bir pelet görünebilir veya görünmeyebilir.

Peletin görülüp görülmediği, süpernatanı hassas bir şekilde aspire edin ve atın. Daha sonra fazla tuzu çıkarmak için, 500 mikrolitre oda sıcaklığında,% 70 etanol ve girdap, tüp santrifüjü, tüpü dört santigrat derecede 18.000 G'de 20 dakika ekleyin. %70 etanol yıkama ve sıkma işlemini tekrarladıktan sonra, kalan etanolü çıkarmak için bir P 200 pipet kullanın.

Pelet havasını 10 dakika kurumaya bırakın. Peletleri 50 mikrolitre dey arıtılmış su karışımında tekrar süspanse edin, iki dakika boyunca girdap yaparak kuvvetlice karıştırın. Daha sonra numuneyi 15 dakika boyunca 45 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.

RNA'yı tamamen yeniden süspanse etmek için. Son olarak, 260 nanometrede absorbans ile RNA konsantrasyonunu belirleyin ve RNA'yı protokole göre jel elektroforezi ile analiz edin. Ekteki belgede, retina dekolmanı transkriptomunu incelemek için, retina dekolmanı olan 18 hastadan ve postmortem retinalar kullanılarak hazırlanan 18 yaş uyumlu kontrolden retinal RNA'yı kurtarmak ve analiz etmek için dergi prosedürü kullanıldı.

RNA daha sonra saflaştırıldı ve bu raporda açıklandığı gibi jel elektroforezi ve rettino bazı kullanılarak analiz edildi, burada gösterilen monosit, kemotaktik M, CP, bir gen, CCL, iki ekspresyonunu temsil eden radar grafikleri bulunmaktadır. RD olarak etiketlenmiş şeklin sağ kısmı retina dekolmanı hastalarından alınan RNA'ya karşılık gelirken, N olarak etiketlenmiş sol kısım burada görülebileceği gibi kontrollerden alınan RNA'dır. Retina dekolmanı, sağdaki RD örneklerinin çoğunda, soldaki kontrollere kıyasla yüksek C değerleri ile gösterildiği gibi, CCL iki'nin yukarı regülasyonu ile sonuçlanır.

Bu artış burada görüldüğü gibi retina dekolmanı olan hastalarda inflamasyona işaret eder. Çubuk fotoreseptör dönüştürücü gen GNAT bir'in ekspresyonu CCL iki'nin aksine azalmıştır, sağdaki RD örnekleri için değerler düşüktür, kısa dalga koni opsin O PN one SW'nin ekspresyonunda bir azalma ve retina dekolmanı olan hastalarda hem çubukların hem de konilerin fotoreseptör dejenerasyonunu düşündüren homeo geni CRX de gözlenmiştir Bu yöntem sayesinde retina dekolmanı sonrası gen ekspresyonu değişiklikleri hakkında bilgi sağlanabilir. Kalıtsal retina dejenerasyonları gibi hayvan modellerinde diğer retinal patolojilere de uygulanabilir.

Bu yönteme yeni olan kişiler, nükleik asit bilgisi gerektirdiği için mücadele edebilir. Bu yöntemin görsel bir gösterimi, sertifikasyondan sonra RNA'nın zor olduğu bir çalışma olarak kritik öneme sahiptir.