1.10: Spektrofotometreye Giriş

Spektrofotometre, biyolojik, kimyasal, klinik ve çevresel araştırmalarda her yerde kullanılan bir araçtır.

Spektrofotometri, bir kimyasal maddenin bir spektrofotometre kullanılarak numuneden bir ışık huzmesi geçirerek ışığı ne kadar emdiğinin kantitatif ölçümüdür.

Algılanan ışığın yoğunluğunu ölçerek, bu yöntem numunedeki çözünen madde konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir.

Numuneye doğru yayılan ışık demeti, bir foton akışından oluşur.

Fotonlar numunedeki moleküllerle karşılaştığında, moleküller bazılarını emebilir, bu da ışık demetindeki foton sayısını azaltır ve algılanan sinyalin yoğunluğunu azaltır.

Geçirgenlik, numuneden geçen ışığın fraksiyonudur ve numuneden geçen ışığın yoğunluğu ile gelen ışığın yoğunluğu olarak tanımlanır. Absorbans, geçirgenliğin ters logaritmasıdır ve spektrofotometrenizin ölçeceği miktardır.

Absoranstan, numune çözeltisinin konsantrasyonu, bir numunenin absorpsiyonu ile konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki olduğunu belirten Beer-Lambert Yasasından belirlenebilir. Beer-Lambert Yasasına göre absorbans, bir çözünen maddenin belirli bir dalga boyunda ışığı ne kadar güçlü emdiğinin bir ölçüsü olan sönme katsayısının, ışığın numuneden geçtiği uzunluğun veya yol uzunluğunun ve çözünen madde konsantrasyonunun ürünüdür. Genellikle, absorbans ölçümleri almanın amacı, bir numunenin konsantrasyonunu ölçmektir.

Her spektrofotometre, bir ışık kaynağı, yoğun bir düz ışık huzmesi ileten bir mercek veya odaklama cihazı olan bir kolimatör, ışık demetini bileşen dalga boylarına ayırmak için bir monokromatör ve istenen dalga boyunu seçmek için bir dalga boyu seçici veya yarık içerir. Bu videoda tartışılan spektrofotometrelerde kullanılan ışığın dalga boyları ultraviyole ve görünür aralıktadır. Spektrofotometre ayrıca bir tür numune tutucu, emilen foton miktarını algılayan bir fotoelektrik dedektör ve dedektörün çıkışını görüntülemek için bir ekran içerir.

Daha yeni spektrofotometreler, deney parametrelerinin kontrol edilebildiği ve sonuçların görüntülenebildiği bir bilgisayara doğrudan bağlanır.

Spektrofotometri yaparken, çalıştığınız biyolojik veya kimyasal çözeltilerin türüne bağlı olarak eldiven giymek gibi uygun önlemleri aldığınızdan emin olun.

Bir numunenin UV görünür spektrumunu ölçmeden önce, makineyi açın ve lambaların ve elektronik aksamın ısınmasına izin verin.

Aynı çözeltiden, ancak analit içermeyen, aynı pH'a ve benzer iyonik kuvvete sahip bir boşluk hazırlayın; Hücre ve çözücü bir miktar ışık saçabileceği için gerekli bir adımdır.

Geleneksel spektrofotometre numune tutucular, plastik ve kuvars küvetleri tutmak için tasarlanmıştır. Boş çözeltiyi küvete pipetlemeye devam edin.

Küvetin dışındaki parmak izlerini ve dökülenleri sildikten sonra, küveti numune tutucuya düzgün bir şekilde yerleştirin ve küvet bölmesinin kapısını kapatın.

Açık bir spektrofotometreden yayılan UV radyasyonu gözlere ve cilde zarar verebileceğinden kapıyı kapatmayı asla unutmayın.

Analitin emdiği optimum ışık dalga boyuna bağlı olan numunede iletilecek istenen dalga boyunu veya dalga boyu aralığını ayarlayın. Ardından, örnek arabelleğinizden arka planı çıkaracak olan boşluğu okuyarak cihazı sıfırlayın.

Gerçekleştirmekte olduğunuz spektrofotometrik deneyin türüne bağlı olarak, numune ölçümünden önce, numune analitinizin konsantrasyonunun nihai olarak belirlenebileceği standart bir eğri oluşturmanız gerekebilir.

Numunenin uygun sıcaklığa ulaşmasına izin verin ve kabarcıkların oluşmaması için hafifçe karıştırın. Numune, cihazın içinde doğrudan küvete eklenebilir ve bir okuma alınabilir.

Numuneniz üzerinde absorbans ölçümünü gerçekleştirdikten sonra, deneyiniz için uygun hesaplamaya geçin; Örneğin, konsantrasyonun veya enzim aktivitesinin oranının belirlenmesi.

Spektrofotometre, birçok biyolojik araştırma laboratuvarında günlük olarak kullanılmaktadır.

Spektrofotometrenin yaygın bir uygulaması, hücre yoğunluğunun ölçümüdür. Hücre yoğunluğu ölçümü, rekombinant proteinin indüksiyonu için en uygun zamanın belirlenebildiği bakteriler için logaritmik büyüme eğrilerinin oluşturulmasında yararlıdır.

Spektrofotometre, kimyasal reaksiyon hızlarını ölçmek için de kullanılabilir. Bu örnekte, absorbans, zaman içinde 452 nm'de bir reaksiyon ara maddesinin kaybolmasıyla bir enzimatik reaksiyonu izlemek için kullanılır. Bu enzimatik adımın hızı, verilerin uygun denkleme uydurulmasıyla hesaplanabilir.

Son zamanlarda, mikro hacimli spektrofotometrelerin piyasaya sürülmesi, numune tutuculara olan gereksinimi ortadan kaldırmıştır. Bu tür spektrofotometreler, numuneyi tutmak için yüzey gerilimini kullanır.

Mikro hacimli spestrofometreler, proteinler ve nükleik asitler dahil olmak üzere biyomoleküller gibi sınırlı hacimli pahalı numunelerin kalitesini ve konsantrasyonunu ölçmek için idealdir.

Bir proteinin 280 nm'de emilmesi, triptofan, tirozin ve fenilalaninde bulunan aromatik yan zincirlerin içeriğine ve ayrıca sistein-sistein disülfür bağlarının varlığına bağlıdır.

Protein konsantrasyonu, 280 nm'deki absorbansından ve amino asit bileşimine dayanan yok olma katsayısından belirlenebilir.

Hem DNA hem de RNA, konsantrasyonlarının belirlenebildiği 260 nm'de maksimum bir absorbansa sahiptir. Nükleik asidin saflığı, belirli dalga boylarındaki absorbans okumalarının oranından da değerlendirilebilir.

JoVE'nin spektrofotometreyle tanışma sürecini izlediniz.

Bu videoda, spektrofotometri kavramları ve spektrofotometre bileşenleri dahil olmak üzere bazı temel prensipleri gözden geçirdik. Ayrıca spektrofotometrenin çalışmasını adım adım gösterdik ve biyolojik araştırmalarda kullanımını tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler.