Spektrofotometreye Giriş

Spektrofotometre; biyolojik, kimyasal, klinik ve çevresel araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir cihazdır.

Spektrofotometre kullanılarak bir ışık demetinin örneğin içinden geçirilmesi yoluyla, bir kimyasal maddenin ışığı ne kadar absorbe ettiğinin kantitatif olarak ölçülmesine spektrofotometri denir.

Saptanan ışık yoğunluğu ölçülerek, bu yöntemle örnekteki çözünen maddenin konsantrasyonu belirlenebilir.

Numuneye doğru gönderilen ışık demeti, bir foton akışından oluşur.

Fotonlar numunedeki moleküllerle karşılaştığında, moleküller bu fotonların bir kısmını absorbe edebilir; bu durum ışık demetindeki foton sayısını azaltarak tespit edilen sinyalin yoğunluğunu düşürür.

Geçirgenlik, numuneden geçen ışığın oranıdır ve numuneden geçen ışığın yoğunluğunun, gelen ışığın yoğunluğuna oranına olarak tanımlanır. Absorbans, geçirgenliğin ters logaritmasıdır ve spektrofotometrenizin ölçeceği niceliktir.

Absorbans değerinden, bir numunenin absorbansı ile konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki olduğunu belirten Beer-Lambert Yasası kullanılarak numune çözeltisinin konsantrasyonu belirlenebilir. Beer-Lambert Yasasına göre absorbans; bir çözünenin belirli bir dalga boyunda ışığı ne kadar güçlü absorbe ettiğinin bir ölçüsü olan söndürme katsayısı, ışığın numune boyunca katettiği mesafe veya yol uzunluğu ve çözünen konsantrasyonunun çarpımıdır. Genellikle absorbans ölçümü yapmanın amacı, bir numunenin konsantrasyonunu ölçmektir.

Her spektrofotometre; bir ışık kaynağı, yoğun ve düz bir ışık demeti ileten bir lens veya odaklama aygıtı olan bir kolimatör, ışık demetini bileşen dalga boylarına ayıran bir monokromatör ve istenen dalga boyunun seçilmesi için bir dalga boyu seçici veya yarık içerir. Bu videoda ele alınan spektrofotometrelerde kullanılan ışık dalga boyları, ultraviyole ve görünür bölgededir. Spektrofotometre ayrıca bir numune tutucu, absorbe edilen foton miktarını tespit eden bir fotoelektrik detektör ve detektör çıkışını görüntüleyen bir ekrana sahiptir.

Yeni spektrofotometreler, deney parametrelerinin kontrol edilebildiği ve sonuçların görüntülendiği bir bilgisayara doğrudan bağlıdır.

Spektrofotometri yaparken, çalıştığınız biyolojik veya kimyasal çözeltilerin türüne bağlı olarak eldiven giymek gibi uygun önlemleri aldığınızdan emin olun.

Bir örneğin UV-görünür bölge spektrumunu ölçmeden önce cihazı açın ve lambaların ve elektronik aksamın ısınmasını bekleyin.

Analit içermeyen, ancak aynı pH değerine ve benzer iyonik kuvvete sahip aynı çözeltiden bir kör (blank) hazırlayın; küvet ve çözücü bir miktar ışığı saçabildiği için bu adım gereklidir.

Geleneksel spektrofotometre örnek tutucuları, plastik ve kuvars küvetleri tutacak şekilde tasarlanmıştır. Kör çözeltiyi küvete pipetleyin.

Küvetin dış yüzeyindeki parmak izlerini ve döküntüleri sildikten sonra, küveti örnek tutucuya uygun şekilde yerleştirin ve küvet bölmesinin kapağını kapatın.

Açık bir spektrofotometreden yayılan UV radyasyonu gözlere ve cilde zarar verebileceğinden, kapağı kapatmayı asla unutmayın.

Analitin absorbe ettiği optimal ışık dalga boyuna bağlı olarak, örneğe iletilecek istenen dalga boyunu veya dalga boyu aralığını ayarlayın. Ardından, kör örneğin okumasını yaparak cihazı sıfırlayın; bu işlem, arka plan sinyalini örnek tamponunuzdan çıkaracaktır.

Yürüttüğünüz spektrofotometrik deneyin türüne bağlı olarak, örnek ölçümünden önce, örnek analit konsantrasyonunun nihayetinde belirlenebileceği bir standart eğri oluşturmak gerekebilir.

Örneği uygun sıcaklığa ulaşması için bekletin ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek nazikçe karıştırın. Örnek daha sonra cihaz içindeki küvete doğrudan eklenebilir ve okuma yapılabilir.

Örneğiniz üzerinde absorbans ölçümünü gerçekleştirdikten sonra, deneyiniz için uygun hesaplamaya geçin; örneğin konsantrasyon tayini veya enzim aktivite hızı hesaplaması.

Spektrofotometre, birçok biyolojik araştırma laboratuvarında günlük olarak kullanılır.

Spektrofotometrenin yaygın bir uygulaması hücre yoğunluğunun ölçülmesidir. Hücre yoğunluğu ölçümü, rekombinant protein indüksiyonu için optimal sürenin belirlenebileceği bakteriyel logaritmik büyüme eğrilerinin oluşturulmasında faydalıdır.

Spektrofotometre ayrıca kimyasal reaksiyon hızlarını ölçmek için de kullanılabilir. Bu örnekte absorbans, 452 nm'de bir reaksiyon ara ürününün zamanla yok oluşu üzerinden enzimatik bir reaksiyonu izlemek için kullanılır. Bu enzimatik basamağın hızı, verilerin uygun denkleme uydurulmasıyla hesaplanabilir.

Son zamanlarda, mikro hacimli spektrofotometrelerin kullanıma girmesi numune tutucu ihtiyacını ortadan kaldırmıştır. Bu tür spektrofotometreler numuneyi tutmak için yüzey gerilimini kullanır.

Mikro hacimli spektrofotometreler; proteinler ve nükleik asitler dahil olmak üzere biyomoleküller gibi, sınırlı hacme sahip pahalı numunelerin kalitesini ve konsantrasyonunu ölçmek için idealdir.

Bir proteinin 280 nm'deki absorbansı, triptofan, tirozin ve fenilalaninde bulunan aromatik yan zincirlerin içeriğine ve ayrıca sistein-sistein disülfit bağlarının varlığına bağlıdır.

Protein konsantrasyonu, 280 nm'deki absorbansından ve amino asit kompozisyonuna dayalı olan ekstinksiyon katsayısından belirlenebilir.

Hem DNA hem de RNA, konsantrasyonlarının belirlenebildiği 260 nm'de bir absorbans maksimumuna sahiptir. Nükleik asidin saflığı da belirli dalga boylarındaki absorbans okumalarının oranından değerlendirilebilir.

JoVE'nin spektrofotometreye giriş videosunu izlediniz.

Bu videoda, spektrofotometri kavramları ve spektrofotometre bileşenleri dahil olmak üzere bazı temel ilkeleri gözden geçirdik. Ayrıca, spektrofotometrenin adım adım çalıştırılmasını gösterdik ve biyolojik araştırmalardaki kullanımını tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler.