Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Aşağıdaki prosedürün amacı, çeşitli kemik iliği yerleşik popülasyonlarının tümör stroma gelişimine katkılarını belirlemek için multipleks hücresel bileşimlerin veya taklitlerin multispektral sorgulamasını kullanmaktır. Bu, ilk olarak transgenik GFP etiketli bir alıcı farenin, RFP'yi ifade eden kemik iliği kök hücreleri ile nakledilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, ilgilenilen tümör hücreleri aynı alıcıya enjekte edilir ve daha sonra aşılamadan sonra, eksizyon tümörü kesilir, parafin içine gömülür ve immünofloresan antikorlarla etiketlenir.

Daha sonra, spektral kütüphane tamamlandıktan sonra, tümör bölümlerinin görüntülerini elde etmek için kullanılan tüm dalga boylarının bir spektral kütüphanesi oluşturulur. Slaytlar son adımda görüntülenir, ilgilenilen hücresel belirteçlerin boyama modellerinin tanımlanmasına ve ilişkilendirilmesine izin vermek için veri analizi yapılır. Sonuç olarak, tümör mikroçevresi gibi karmaşık dokuların bileşimini daha iyi anlamak için hücre dışı ve hücresel belirteçlerin çoklama etiketlemesine dayalı olarak yeni hücresel varlıklar veya fenotipler tanımlanabilir.

Bu tekniğin standart immünofloresan tekniklerine göre ana avantajı, çoklu spektral analizin aynı slayt üzerinde yedi veya daha fazla floro dörtlüsünü çoğullamanıza izin vererek, tümör mikro çevresinin veya rejeneratif bir dokunun hücresel bileşiminin çok daha kesin ve ayrıntılı bir şekilde sorgulanmasına izin vermesidir. Bu yöntem, tümör mikroçevresinin kökeni ve bileşimi hakkında fikir verebilse de, rejeneratif tıp, gelişimsel biyoloji ve bağışıklık biyolojisi gibi diğer sistemlere uygulanabilir. Bu prosedürü Dr.Spa ile birlikte gösteren, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Chris Booth'tur Bu kurumdaki IU Cook kısıtlaması nedeniyle, fareler üzerinde herhangi bir doğrudan fare manipülasyonunu tartışacağız ancak göstermeyeceğiz.

Bu kemik iliği prosedürleri ve tümör aşılama tekniklerimiz, çocuk ve diğer kök hücreler gibi önceki çalışmalarımızda bulunabilir. 2009 Kemik iliği hücrelerini aynalayıcı arka bacaklardan izole ettikten sonra başlamak için, Resus, hücreleri fare başına 100 mikrolitre PBS başına 2 milyon hücrede askıya alır. Işınlanmış bir alıcı GFP faresinin damarlarını genişletmek için bir ısı lambası kullanın ve fareyi bir kuyruk damarı enjeksiyon kısıtlamasına yerleştirin.

29 gauge iğne konik tarafı yukarı bakacak şekilde kullanarak, hücre süspansiyonlarını sistemik olarak kuyruğa veya retroorbital damara enjekte edin. Enjeksiyon sonrası kuyruğa hafif basınç uygulamak için steril gazlı bez kullanın. Bir fareye 100 mikrolitre PBS enjekte edin, sadece enjeksiyon gününde aşılama kontrolü olarak.

PBS'de ilgilenilen tümör hücrelerini 100 mikrolitre başına 1 milyon hücrede yeniden askıya alın. Karnı% 70 etanol ile sterilize ettikten sonra. Fareyi boynun ve kuyruğun tırnağından tutmak için bir elinizi kullanın ve ardından diğer elinizle iğne eğimli tarafı yukarı kaldırın ve tümör hücrelerini alıcı farenin interperitoneal boşluğuna enjekte edin.

15 ila 30 gün sonra, farelere ötenazi yapın ve tümörü karnından çıkarın. Daha sonra tümörleri 24 saat boyunca% 10 formin içinde sabitleyin. Daha sonra, sonraki boyama prosedürleri için sabit dokuyu beş ila 10 mikrometrelik dilimlere ayırın.

Doku bölümlerini parafine sabitledikten sonra, numuneleri 56 santigrat derecede bir saat pişirin. Ardından slaytları aşağıdaki sıraya göre yıkayın: Son etanol yıkamasından sonra, slaytları iki dakika suda durulayın. Boyama rafını 10 kez suya yavaşça daldırın ve kaldırın.

Daha sonra ısıtmak için sodyum sitrat tamponunu mikrodalgaya yerleştirin. Slaytları sodyum sitrat tamponunda 20 dakika kaynattıktan sonra, numuneleri tamponda 30 dakika soğumaya bırakın. Daha sonra iyonize su ile beş dakika daha yıkayın.

Ardından, büyük su damlalarının akmasına izin vermek için sürgüyü hafifçe vurun, doku bölümünü kurutmamaya dikkat edin. Tümör bölümlerinin etrafındaki bölümleri işaretlemek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın ve ardından doku bölümünün kurumasını önlemek için numunenin üzerine hemen bloke edici tampon yerleştirin. Bir saat sonra, slaytları, gece boyunca dört derecede yavaş dönen bir çalkalayıcı üzerinde bir nem odası kutusunda ilgilenilen birincil antikor ile inkübe edin.

Ertesi sabah, slaytları PBST'de iki kez 10 dakika boyunca bölümler yıkanırken her seferinde hafifçe çalkalayarak yıkayın. İkincil antikorları, bloke edici tampon oranına bir ila 1000 antikorda seyreltin. Daha sonra uygun sekonder antikorlardaki kesitleri, iki saat sonra oda sıcaklığında yavaş dönen bir çalkalayıcı üzerinde alüminyum folyo ile kaplı nem haznesi kutusunda inkübe edin.

Slaytları PBST'de iki kez beş dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın ve ışıktan koruyun. Daha sonra sadece dappy slaydı ve analiz slaytlarını bir dakika boyunca DPI ile boyayın ve inkübasyon sırasında slaytları kapalı tutun. Her numunenin üzerine bir kapak astarı yerleştirerek, her bir kapak astarının kenarlarını tırnak sertleştirici ile kapatın.

Şimdi multispektral görüntülemeyi gerçekleştirmek için, spektral kitaplıktaki spektral aralıkların her biri için uygun pozlama sürelerini elde etmek üzere analiz slaytının ilk görüntüsünü almak için bir yağ objektifi kullanın. Örneğin, bu tablo taslağı, deneyde kullanılan dördüncü kat sayısına dayalı olarak spektral kütüphane protokolleri önerdi. Ardından, bu deney için spektral kitaplıkta arka plan slaydı için lekelenmemiş slaydı görüntüleyin.

Sonraki görüntü, spektral kitaplık için arka plan görüntüsünü elde etmek için boyanmamış slayt. Şimdi her kontrol tek kat dört lekeli slaytı görüntüleyin ve görüntüleri her slayt için kullanılan ikincil antikor adı altında kaydedin. Şüpheli kitaplık tamamlandıktan sonra, tümör dokularının görüntülerini analiz etmek için analiz slaydında ilgilenilen bölgelerin görüntülerini toplayın.

İlk olarak, bilgi yazılımını kullanarak elde edilen nüans görüntülerinin temsili bir ürün yelpazesini içe aktarın. Ardından, program tarafından yönlendirildiği gibi güvenli spektral kitaplığı açın. Ardından, analiz edilecek ilgilenilen doku bölgelerini belirleyin.

DAPI boyamaya dayalı olarak tek tek hücreleri tanımlayın. Sitoplazma, çekirdeğin şekline göre otomatik olarak tanımlanacaktır. Şimdi her bir floresan parametresi için tercih edilen floresan yoğunluğu okumasını seçin ve ardından elde edilen görüntüleri eşleştirin ve yazılımın önerilen algoritmayı kullanarak verileri işlemesine izin verin.

Görüntü işleme bittiğinde, ortaya çıkan dosyaları birleştirin. Daha sonra, bu transgenik kemik iliği nakli fare modelindeki tümörleri analiz etmek ve grafiklemek için bu multispektral görüntüleme tekniği kullanılarak, kemik iliği kökenli stromal tümör bileşenleri, kemik iliği naklinden üç hafta sonra akış sitometrisi ile ayırt edildi. Daha sonra, ilk enjeksiyondan altı hafta sonra, etiketlenmemiş enjekte edilen yumurtalık tümörlerinden kesitler, tek renk kontrol slaytları ile spektral bir kütüphane oluşturulduktan sonra analiz edildi, GFP DPI ve diğer iki belirteç ile boyanmış yumurtalık tümörü bölümünün görüntüleri analiz edildi.

Daha fazla işaretleyici eklemek mümkündür. Örneğin, burada, altı işaretleyici artı bir nükleer leke içeren bir tümör bölümünün spektral kütüphanesi ve beraberindeki görüntü, bilgilendirilmiş yazılım kullanılarak gösterilir. Tümör kesiti içindeki ilgilenilen doku bölgeleri, burada gösterilen temsili görüntülerde gösterildiği gibi sınıflandırılabilir.

Örneğin, bu görüntü, doku segmentlerinin sınıflandırılmasını ve ardından hücrelerin segmentasyonunu göstermektedir. Nükleer leke dpi'sine dayanmaktadır. Floresan etiketlerin miktar tayini daha sonra her hücrenin çekirdeğinde ve sitoplazmasında ölçülebilir ve daha fazla analiz için dışa aktarılabilir.

Doku segmentasyon algoritması, yalnızca florokrom tanımlamasına değil, doku mimarisine dayalı olarak doku alt tiplerini daha fazla tanımlayabilir ve boyamayı farklı doku bölgelerine sınıflandırmak için daha sağlam bir analitik araç sağlar. Bu görüntüde bilgisayar, doku içindeki mimari desenlere dayalı olarak beş alt bölgeyi tanımlamak için eğitildi. Arka plan boş alanla tanımlanır.

Hemolitik tümör, doku içindeki kırmızı kan hücrelerinin bolluğu ile tanımlanır. Tümör, yoğun nüfuslu hücreler tarafından tanımlanır. Yağ, büyük simetrik boş hücresel bölmeler ve çizgili bir desenle tanımlanan kaslar tarafından tanımlanır.

Bu yöntem kullanılarak, bir çift pozitif hücre popülasyonu, belirlenen bir floresan yoğunluk eşiğine dayalı olarak analiz edilebilir. Örneğin, GFP pozitif ve alfa düz kas aktin pozitif hücreleri için, dört rengin ötesinde ek spektral algılama için burada gösterildiği gibi, lütfen beş veya daha fazla probu çoğullamak için bağlantılı ipuçları ve püf noktaları belgelerine bakın. Bu prosedürü denerken, görüntülerin kalitesinin büyük ölçüde kullanılan uygun tek renk kontrol slaytlarına bağlı olduğunu unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, hücresel bölmeler ve tümör mikroçevre dokusu gibi ek soruları yanıtlamak için floresan in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, çok hücreli bileşenlerin çok spektral sorgulaması olan mimik tekniğimizi iyi anlamalı ve bunu tamamlarken, tek bir slaytta birden fazla hücresel hedefin nasıl tanımlanacağına dair kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu hücresel hedefleri nasıl birleştireceğinizi ve tümör stromasının veya rejeneratif dokunun veya ilgilendiğiniz dokunun evrimini iyi bir şekilde nasıl anlayacağınızı.