Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, transplantasyon için fonksiyonel doku mühendisliği biyo kompozitleri üretmektir. Bu, üç boyutlu biyomalzeme kompozitlerindeki hücrelere biyofiziksel uyarılar sağlamak amacıyla hassas tek eksenli veya çift eksenli mekanik gerilme uygulanarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak biyoreaktör, yükleme sırasında kuvvet geri bildirimi ve biyo kompozitlerin mekanik testlerini sağlayan bir yük hücresi ile donatılmıştır.

Ardından, yapısal biyokimyasal içerikte makro ölçekli değişiklikler oluşturmak amacıyla biyokompozitler birkaç hafta boyunca kültüre edilir; glikozaminoglikan ve kolajen içeriği, iskele kalınlığı ve denge modülündeki anlamlı farklara dayanarak farklı yükleme türlerinin etkisini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, biaksiyel yüklemenin mühendislik ürünü kıkırdak doku üzerindeki etkilerine dair içgörü sağlayabilse de, kemik ve tendon gibi diğer düşük taşıyıcı dokulara da uygulanabilir; prosedür laboratuvarımızdan Amy May ve Rob Stefani tarafından gösterilecektir. Bu prosedüre başlamak için, burada gösterildiği gibi biaksiyel bir biyoreaktör kurun.

Biyoreaktörün tabanı, 25 santimetre x 30 santimetre x 12,5 milimetre ölçülerinde bir alüminyum plakadan oluşur. Mevcut değişken konumlandırma seçenekleri, farklı şekil ve boyutlardaki doku kültürü plakalarının esnek bir şekilde monte edilmesine olanak tanır. Ardından, yatay platformun yalnızca x ekseni boyunca salınım yaparak dinamik kayma kuvveti sağlaması için platformların tabana monte edildiğinden emin olun.

Dikey sahne ise yalnızca Z ekseni boyunca salınım yaparak dinamik sıkıştırma sağlar. Bir sonraki adım, özel bir polisülfon yükleme plakası üretmektir. Polisülfon malzeme; biyouyumlu olması, kolayca işlenebilmesi ve sterilizasyon kolaylığı nedeniyle idealdir.

Plakayı, hassas işlenmiş dik açılı bir destek braketi aracılığıyla çift eksenli hareketli platforma bağlayın. Taban plakasına takılı olan kinematik durdurucular, kültür plakalarının elle sağlanamayacak düzeyde hassas bir şekilde hizalanmasına olanak tanıyan ince ayar vidalarına sahiptir. Ardından, yazılım için konum geri bildirimi sağlayacak olan step motor aktüatörünü her bir platforma takın.

Burada gösterilen step motor aktüatörleri, 0,1 mikrometre çift yönlü tekrarlanabilirliğe ve 20 nanometre çözünürlüğe sahiptir; bu da 50 milimetrelik hareket mesafesi boyunca üç mikrometreden daha az bir hassasiyete karşılık gelir. Sahne hareketlerini kontrol etmek için Thor Lab'in gelişmiş konumlandırma teknolojisi yazılımı kullanılır. Yazılım, hem kayma hem de sıkıştırma yüklerinin frekans ve genlik parametrelerini bağımsız ve eş zamanlı olarak ayarlamak için step motoru kontrol eder. Ardından, platin ile konstrüksiyonlar arasındaki teması tespit etmek ve yükleme yanıtlarını değerlendirmek için gerekli kuvvet geri bildirimini sağlamak amacıyla, yükleme platini ile hareketli platform arasına minyatür beş poundluk bir yük hücresi yerleştirin.

Yük hücresinin tam ölçeğin %0.15'i ile %0.25'i arasında yüksek doğruluk değerlerine sahip olduğundan ve yük hücresi ekran ünitesinin, bilgisayarda veri toplanmasına olanak tanıyan bir RS 2 32 portuna sahip olduğundan emin olun. Örnekleri 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucukları içinde sabitlemek için, 1.5 mm'lik ara parçalara sahip bir jel döküm sistemi kullanarak 1.5 mm kalınlığında bir agaroz jel kalıbı hazırlayın. Montaj tamamlandıktan sonra, iki cam plaka arasına %4'lük agaroz çözeltisi dökün ve karışımın soğumasını bekleyin.

Ardından üst plakayı çıkarın ve agro slabdan 16 milimetre çapında bir disk kesin. Her bir diskte, her bir kuyu örneği için örneğin yerleştirileceği bir delik açın. Hazırlanan diskleri 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.

Ardından, 2,25 milimetre kalınlığında ve beş milimetre çapındaki doku konstrüktlarını her bir jel tutucuya bastırarak yerleştirin. Örnek, her bir aeros tutucusunun üst kısmından dışarı taşmalıdır. Sonrasında, her kuyucuğa 1,5 mililitre kültür ortamı ekleyin ve kapağı kapatın.

Ardından, örnek yükleme zamanı gelene kadar plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Doku konstrüktlerinin mekanik yüklemesine başlamak için alüminyum plakayı yük hücresine sabitleyin ve steril platin düzeneğini her zaman dikey sahneye takılı tutun. Cihaz arızalarını önlemek için inkübatör düşük nem koşullarında çalıştırılmalıdır.

Ardından, step motor kontrol cihazını ve bilgisayarı açın. Gelişmiş konumlandırma teknolojisi kullanıcı programını açın ve her iki ekranda da grafiksel kontrol sekmesine gidin. Her iki step motoru, en üst ve en sağ konum olarak tanımlanan sıfır konumuna göndermek için home zero düğmesine basın.

Mekanik yükleme sırasında taşmayı önlemek için her kuyucuktan bir miktar medyum çıkararak örnekleri yüklemeye hazırlayın. Ardından, 24 kuyucuklu plakayı biyoreaktöre yerleştirin ve dört ayarlanabilir kinematik konumlandırıcıyı kullanarak plakayı platin ile dikkatlice hizalayın; plakanın düzgünce hizalandığından emin olun. Grafik kontrol sekmesindeki biyoreaktör tabanının ön kısmıyla hizalayın.

Hizalamayı manuel olarak ince ayar yapın. Yatay olarak hareket ettirmek için konum kutusuna tıklayarak hizalamayı düzeltin. Plaka, plaka kuyucuklarıyla hizalandığında, örneklerle ilk temas gerçekleşene kadar plakayı indirmeye başlayın.

Başlangıç konumuna ulaşıldığında, hareket sekanslayıcı sekmesine gidin ve yükle düğmesine basarak istenen hareket sekansını yükleyin veya bu videoya eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi kendi programınızı oluşturun. Ardından, programı başlatmak için çalıştır düğmesine basın. Yazılım, numunelere istenen kondisyonlama rejimini uygulamaları için motorları yönlendirecektir.

Program sona erdiğinde, plakayı doku kültürü plağının üst kısmından kurtulacak şekilde manuel olarak kaldırın. Ardından 24 kuyucuklu plakayı biyoreaktörden çıkarın ve medyayı yenileyin. Son olarak, platini yük hücresinden dikkatlice çıkarın ve ardından cihazları kapatın.

Bu videoda açıklanan çift eksenli biyoreaktörün kullanımı, doku mühendisliği konstrüktleri içindeki hücreler tarafından salgılanan glikozaminoglikan ve kolajen miktarında önemli bir etki yaratmıştır. Koşullandırma, haftada beş gün, günde üç saat boyunca, 1 Hz'de %10 kompresyon gerinimi ve %5 kayma gerinimi ile gerçekleştirilmiştir. 30 günlük kültür süresinin ardından, çift eksenli yüklemeye maruz kalan kondrositler tarafından salgılanan glikozaminoglikan ve kolajen miktarı, kontrol örneklerine göre anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur. Sadece tek eksenli yükleme, glikozaminoglikan miktarını anlamlı şekilde artırmıştır.

Ek olarak, biaksiyel yükleme daha kalın konstrüktlar oluşturmuş ancak konstrüktların elastisitesi üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. Bu dozaj protokolü çağrısı kullanılarak, 30 günlük kondisyonlama ve kültürleme sürecinin ardından, doku konstrüktlarının kesitleri, mavi safran O ve tip iki kolajen dahil olmak üzere tipik kıkırdak belirteçleri ile boyanmıştır. Üç farklı grup; kondisyonlama yapılmayan, uniaxial yükleme uygulanan ve biaksiyel yükleme uygulanan grupları içermektedir.

Tüm gruplar alium Blue ve Saffron O ile pozitif boyanma gösterse de, biaksiyel yüklü örnekler, yüksüz ve tek eksenli yüklü örneklere kıyasla artmış miktarlarda tip iki kolajen göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, geliştirilen doku mühendisliği yapılarına tek eksenli veya çift eksenli yüklerin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.