Name: Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin, murin dişeti hücrelerini izole etme ve akış sitometrisi analizi için tek hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini. Bu teknik oral immünoloji ve periodontal hastalık araştırmalarında hücre popülasyonlarını incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma AW, AHH genç araştırmacılar (GIF Young) için Alman İsrail Vakfı ve Dr ben İsrail Bilim AHH için Vakfı (No 1418/11) ve (No 1933/12) hibe tarafından desteklenmiştir . AHH ve AW için Diş Hekimliği İbrani Üniversitesi-Hadassah Okulu&#39;nda Cabakoff Araştırma Vakfı Fonu.

Önceden hazırlayın: <ul><li> PBS +% 2 FCS </li><li> Kollajenaz tip II ve DNAz Tip I, 1 mg / ml (örnek başına 1 mi) içinde 2 mg / ml &#39;si ile PBS +% 2 FCS </li><li> Steril cerrahi aletler </li><li> 0.5 M EDTA </li></ul> 1. Üst Dişeti Eksizyon Tekniği <ol><li> Onaylı IACUC rehberlik kullanarak fareler Euthanize. </li><li> Yanaklar ve keskin / künt düz makas ile mandibula ramus dahil olmak üzere ağız boşluğunun her iki kesin. </li><li> Çene aşağı çekin. </li><li> Standart makas ile üçte azı dişleri arkasında hayali bir çizgi 1 mm yumuşak ve sert doku kesin. Makas damak kemiği (Şekil 2A, mavi çizgiler) düzlemine dik yönlendirin. </li><li> Yumuşak ve sert doku kesici (Şekil 2A, mavi çizgiler) arkasında 2 mm insizyon. </li><li> Ağız ön kısmını aşağı çekin. Burun boşluğu bu aşamadan sonra gözlemlenmiştir. </li><li> Makas yerleştirindamak paralel, burun boşluğu içine bir bıçak koymak, diğer bıçak antre de insizyon gerekir. Posterior insizyon (Şekil 2A, yeşil hat) kadar kesin. Maksilla her iki tarafında bu adımı yineleyin. Sonunda maksilla kafatasının geri kalanı (Şekil 2B) ayrılır. </li><li> , Maksilla çıkarın orta sütür (Şekil 2, siyah kesikli çizgi) olarak kesilmiş ve alveol kemiğinin ulaşana kadar her hemi-maksilla damak dokusu kırpın. </li><li> Adson forseps (dişler olmadan) ile ön sınırından dişeti dokuları (iki hemi-üst çene) Peel. </li><li> PBS +% 2 FCS ile bir tabak içinde çıkarıldı dişeti yerleştirin. </li></ol> 2. Dişeti İşleme <ol><li> 1 ml PBS ile bir doku kültürü kabı (35 x 10 mm) eksize dişeti koyun +% 2 FCS, kollajenaz tip II ve DNAz Tip I&#39;in 1 mg / ml, 2 mg / ml &#39; </li><li> N ° 15 steril cerrahi bıçak ile de doku kıyma. </li><li> Trplakadan 15 ml konik bir tüp için doku ansfer. </li><li> 1 ml PBS +% 2 FCS ve aynı test tüpüne transfer ile plaka üzerinde kalan doku / hücre yıkayın. </li><li> 37 az 20 dakika bir çalkalayıcı inkübatör inkübe ° C, 200 rpm (öneri: ön ısıtma inkübatör). </li><li> 37 başka bir 10 dakika ° C, 200 rpm&#39;de 20 EDTA, 0.5 M ul ve inkübe ekleyin. </li><li> 12 PBS +% 2 FCS ile ml ve 4 santrifüj kadar test tüpüne doldurun ° C, 8 dakika boyunca 400 x g (öneri: ön soğuk santrifüj). </li><li> 2 ml PBS +% 2 FCS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> 70 mikron hücre-süzgeç ile örnek filtre ve akışı kaydedin. </li><li> 4 ° C, 5 dakika boyunca 320 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 300 ul PBS +% 2 FCS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Hücreleri (yaklaşık 5-10 x 10 5 hücreleri, tek maksilla beklenen) sayın. </li></ol> 3. Hücre dışı ve Hücre içi AntikorSitometrisi Analiz Boyama Bu ışıklar kapalı, bir başlık içinde çalışmak tavsiye edilir. Bu, sürekli olarak soğuk bir ortamda hücreler tutmak, hem de gerekli olan tüm malzemeleri için çok önemlidir. <ol><li> 100 ul toplam hacim içinde 1 x 10 6 hücre başına her seçilmiş bir antikorun 0.2-0.5 ug eklenmesi ile hücre-dışı moleküllere karşı hücre Leke. </li><li> Vortex kısaca. </li><li> 4 ° C de karanlıkta 15 dakika süreyle inkübe edin </li><li> 2 ml PBS +% 2 FCS ile hücreleri yıkayın. </li><li> 4 ° C, 5 dakika boyunca 320 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Ekleyerek süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire, bilge bırak, 500 ul soğuk BD Cytoperm / Cytofix vorteks ise. </li><li> 4 ° C&#39;de 40 dakika karanlıkta C inkübe edin. </li><li> Vortex kısaca. </li><li> 1 ml soğuk BD Perm hücreler iki kez yıkayın / 4, 7 dakika boyunca 800 xg&#39;de Tampon ve sıkma yıkayın ° C </li><li> 300 ul dışında süpernatant aspire. </li><li> Tarafından hücre içinde hücre Leke100 ul toplam hacim içinde 1 x 10 6 hücre başına her seçilmiş bir antikorun 1 ug eklenmesi. </li><li> Vortex kısaca. </li><li> 4 ° C de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe </li><li> 1 ml soğuk BD Perm hücreler iki kez yıkayın / 4, 7 dakika boyunca 800 xg&#39;de Tampon ve sıkma yıkayın ° C </li><li> 300 ul soğuk BD Perm / Yıkama Tamponu ekleyerek süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. </li><li> Vortex kısaca. </li><li> FACS tüpler için filtreleme süre süspansiyonu aktarın. </li><li> Analizi kadar karanlık ve soğuk bir ortamda tüpler tutun. </li></ol>

<ol><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li>
<li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol%22%5BJournal%5D)">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li>
<li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis%3A+in+situ%2C+in+vivo%2C+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li>
<li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li>
<li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+chemokine+%28MCP-1%2C+MIP-1alpha%2C+MIP-1beta%2C+IP-10%2C+RANTES%29-positive+cells+and+chemokine+receptor+%28CCR5%2C+CXCR3%29-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li>
<li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Buccale%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li>
<li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li>
<li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response%3A+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Tek bir fareden elde edilen üst çeneye gingival dokular, daha önce tarif edildiği gibi 1 hücre dışı ve hücre içi molekülleri ifade etmek için T ve B lenfositlerinin alt gruplar, hem de bunların özelliği analiz etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, eğer nadir hücre popülasyonlarının (örneğin DC için) ilgilendiren, 2-3 fareler havuzu dokulara önerilir. Unutmayın ki, tercih, bu mümkündür sonra damak ve diş eti dokuları ve tüketim diş eti (adım 1.8-1.9 bir değişiklik) her iki kabuğu. Ayrıca çene diş eti de top...

Gingiva diş serviks kısmı çevreleyen yumuşak doku ve alveol (Şekil 1) kapsar. Dişeti daha mukozal epitel ve bağ dokusu (aynı zamanda submukozaya ya da lamina propria olarak da bilinir) ayrılabilir çiğneme mukoza türüdür. Dişeti ve komşu dişlerin anatomik yapısı bakteriler sürekli yerel bağışıklık sistemi meydan plak (biyofilm) ikamet ve geliştirmek için olanak sağlar. Periodontal hastalıkların 2 olarak adlandırılan bir durum - Sonuç olarak, enflamatuar yanıt, bazı durumlarda zararlı olur dişeti, gelişir. Temel olarak, plak indüklenen Periodontal patolojilerin gingivitis ve periodontitis ayrılabilir. Dişeti iltihabı dişeti ile sınırlı yerel inflamatuar yanıt bir geri durumu temsil eder. Periodontitis, diğer taraftan, geri dönüşü olmayan bir yıkıcı bir süreç olduğu bağlanma cihaz (alveol kemiği, periodontalbağ, sement ve diş eti) 3 yok edilir. Dişeti periodontal hastalıklar 4 sırasında olduğu gibi efektör ve endüktif her iki site hizmet etmek için önerilmiştir. İnsan çalışmalar dental plak yanıt olarak, immün efektör hücreleri ve molekülleri dinamik sızmış veya kalkış dişeti 5-7 olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu aktivite, periodontal yıkım 8,9 önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Insan dokuları ile çalışan, bu patolojik sürecin ilgili değerli bilgiler sağlanan çalışmalar tarafından oluşturulan veri büyük, etik, teknik ve deneysel sınırlamalar sahip ise. Transgenik fareler istihdam yoluyla ve in vivo müdahaleler 10 neden-sonuç deneylerine izin deneysel modellerin geliştirilmesi. Sonuç olarak, periodontal hastalık ile ilgili mekanizmalar bilgimizi son yirmi yılda önemli ölçüde artmıştır. Buna rağmen, periodontal hastalıkların karmaşıklığı nedeniyle, oradadoku yıkımı kolaylaştıran yerel immün yanıt niteliği ile ilgili devam eden bir tartışma. Periodontal hastalıklar sırasında dişeti merkezi bağışıklık hücrelerinin işlevini anlayışımızda eksikliği vardır. Bu hastalık, gingivanın hedef dokuda oluşan patolojik inflamatuar etkinliklerini inceleme amaçlı olarak bu nedenle çok önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz Tip II</td><td>Worthington Biyokimya A.Ş.</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu </td><td>Biyolojik Endüstrileri</td><td>04-121-1</td><td>Isı ile Etkisiz</td></tr><tr><td>Vakum Tahrikli</td><td>Filtre Jeti Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 70 & mu; m</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı 35&#215; 10 mm</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c antikoru</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>Klon N418</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45.2 antikoru</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>Klon 104</td></tr><tr><td>Anti-fare CD4 antikoru</td><td>Biyoefsane</td><td>100413</td><td>Klon GK1.5</td></tr><tr><td>Anti-fare CD8a</td><td>antikoru Biyoefsane</td><td>100733</td><td>Klon 53-6.7</td></tr><tr><td>Anti-fare CD3 antikoru</td><td>Biolegend</td><td>100214</td><td>Klon 17A2</td></tr><tr><td>Anti-fare CD326 (Ep-CAM) antikoru</td><td>Biolegend</td><td>118219</td><td>Klon G8.8</td></tr><tr><td>Anti-fare CD207 (Langerin) antikoru</td><td>Imgenex</td><td>DDX0362D</td><td>Klonu 929F3.01</td></tr><tr><td>Anti-fare IA d (MHC-II) antobody</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>Klonu 39-10-8</td></tr><tr><td>LSR II Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Yazılımı V 7.6.5</td><td>Ağaç Yıldızı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murin dişeti hücre İzolasyonu, İşleme ve analiz

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Biz tam olarak izole ve akım sitometri ve moleküler çalışmalar için fare dişeti doku işlemek için bir teknik geliştirdik. Dişeti bu periodontal hastalıklara neden olabilir sözlü biyofilm karşı konağın immün yanıtı yer olduğu için bağışıklık mekanizmaları incelemek için eşsiz ve önemli bir dokudur. Ayrıca, alveoler kemik dokusu için dişetinin yakın da enflamatuvar durumlarda kemik yeniden eğitim sağlayan. Bizim yöntemi daha önce 1 gösterdiği gibi Langerhans hücreleri ve T düzenleyici hücreleri gibi daha nadir hücre popülasyonlarının analizi sağlayan bağışıklık hücrelerinin büyük miktarda verir. Periodontal hastalıklar sırasında alveol kemik kaybı dahil yerel immün yanıtları incelemek için istihdam fareler nedeniyle çeşitli immünolojik ve deneysel araçların durumu avantajlıdır. Bununla birlikte, kendi küçük boyutu ve fare dişeti için nispeten uygunsuz erişim nedeniyle, birçok çalışma thi incelenmesi kaçınılmalıdırs kritik doku. Bu çalışmada açıklanan yöntemi umarım periodontal hastalıklar sırasında sözlü bağışıklık sistemi ve rolünü bizim understating artacak dişeti analizi, kolaylaştırabilir.

Dişeti hücreleri üzerinde akım sitometri analizi örnekleri sunulmaktadır. 2 farelerin toplanmış Dişeti hücreleri bir LSR II akış sitometresinde çalıştırın ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi. Şekil 3A bir yan dağılım (SSC) karşı ileri dağılım (FSC) arsa içinde naif farelerden alınan dişeti hücrelerinin dağılımı göstermiştir. Tespit etmek Ayırıcı stratejisi, (i) lenfositler (ii) monositler / dendritik hücreler ve (iii) granülosit belirtilir. Karşılaştırma amaçla, biz de P. arınmış diş ...

Bu çalışma, bir tek hücre kültürü üretmek için fare ağız boşluğundan gingival dokular izole etmek ve işlemek için etkili bir yöntem açıklanır. Ortaya çıkan hücreler bir başka akış sitometri analizi ve klinik çalışmalar için kullanılabilir.

Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Bu prosedürün genel amacı, daha sonra yapılacak akış sitometrisi analizi için mirin diş etini hassas bir şekilde izole etmek ve işlemektir. Bu işlem, öncelikle diş etinin titiz bir şekilde cerrahi olarak izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, eksize edilen doku, tek hücre süspansiyonu oluşturmak için işlenir.Ardından, antikorlarla hücre dışı ve hücre içi boyama gerçekleştirilir. Son olarak, örnek akış sitometrisi ile analiz edilir. Nihayetinde, akış sitometrisi analizi ile diş etindeki farklı hücre popülasyonlarını ve immünolojik bir hasara maruz kalma sonrası dokuda meydana gelen hücresel değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, OC kimyasındaki veya mono floresan gibi yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda hücreyi analiz etmek için hızlı ve basit bir yöntem olması, birkaç değişkenin eş zamanlı analizine olanak tanıması ve ayrıca çeşitli hücre tiplerinin daha ileri deneyler için ayrıştırılabilmesidir. Bu yöntem, immünoloji alanındaki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, mikroorganizmaların gingival homeostazı nasıl etkilediği ve bir periodontitis deneysel modelinde inflamasyon kaynaklı kemik kaybı ile nasıl ilişkili olduğu gibi. Bu yöntem fikri ilk olarak periodontitis sırasında RI hücrelerinin rolünü ele almaya başladığımızda ortaya çıktı. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü GVA hızlandırma tekniği, küçük boyutu ve MU one J gva'ya erişimin nispeten zor olması nedeniyle öğrenilmesi güç bir tekniktir.Başlamak için metin protokolüne uygun olarak medya çözeltilerini hazırlayın ve cerrahi aletleri sterilize edin. Kurumunuzun hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanmış yöntemlere göre bir fareyi ötanize ettikten sonra; yanaklar ve mandibula ramusu dahil olmak üzere ağız boşluğunun her iki yanını kesmek için keskin, küt uçlu düz makas kullanın ve standart makasları palatin kemik düzlemine dik olarak yönlendirerek mandibulayı aşağı çekin. Yumuşak ve sert dokuları, üçüncü molarların bir milimetre gerisinden geçen hayali bir hat boyunca kesin.Ardından, kesici dişlerin iki milimetre gerisinden yumuşak ve sert dokular içinde bir insizyon yapın. Daha sonra, makasları damağa paralel tutarak burun boşluğunu açığa çıkarmak için ağzın ön kısmını aşağıya doğru çekin. Burun boşluğuna bir kanama kontrol malzemesi yerleştirin ve diğerini vestibülde, posterior insizyona doğru keserek bir insizyon yapmak için kullanın.Maksillayı kafatasıyla bağlantısından ayırmak için insizyon işlemini maksillanın diğer tarafında tekrarlayın. Ardından maksillayı ortadan ikiye kesin ve abs ve forseps kullanarak her bir hemi maksilladan alveolar kemiğe ulaşmak için palatal dokuyu temizleyin. Diş eti dokularını anterior sınırdan soyun ve diş etlerini işlemek için PBS ve %2 fetal dana serumu veya FCS içeren bir plakaya yerleştirin; ardından dokuyu bir mililitre PBS, iki miligram/mililitre tip iki kollajenaz ve bir miligram/mililitre DNAs içeren bir kültür kabına aktarın.15 numaralı steril bir cerrahi bıçakla parçalayın. Dokuyu, 15 mililitrelik konik bir test tüpüne aktarmadan önce iyice kıyın. Plakta kalan doku hücrelerini bir mililitre P-B-S-F-C-S ile yıkayın ve tüpe aktarın.Dokuyu önceden ısıtılmış bir çalkalamalı inkübatörde 37 °C ve 200 RPM'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından 20 µL 0.5 M EDTA ekleyin ve 10 dakika daha inkübe edin. Sonrasında, hacmi 12 mL olacak şekilde P-B-S-F-C-S ekleyin ve örneği 4 °C'de, 400 ×g'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, hücreleri iki mililitre PBS-FCS içerisinde yeniden süspande edin. Akışı dört °C'de ve 320 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, örneği 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 300 µL PBS-FCS içerisinde yeniden süspande edin.Son olarak, düşük sıcaklıktaki bir çeker ocak altında ve ışıklar kapalıyken, 100 µL toplam hacimdeki hücreleri sayın; seçilen her bir antikor için 10⁶ hücre başına 0.2 ila 0.5 µg ekleyin ve kısa süreli vorteksleyin. Örnekleri karanlıkta, 4 °C'de 15 dakika inkübe ettikten sonra, 2 mL PBS-FCS ekleyin ve 320 ×g'de, 4 °C'de beş dakika santrifüjleyin. Hücreleri sabitlemek için süpernatanı aspire edin ve ardından vorteksleyerek, 500 µL soğuk BD cyto perms'i damla damla ekleyerek hücreleri yeniden süspande edin.Hücresel etkiler için tüpleri vortekslemeden sonra 40 dakika boyunca 4 °C'de karanlıkta inkübe edin. Kısaca, ardından 1 mL BD perm yıkama tamponu ekleyin ve 4 °C'de 7 dakika boyunca 800 ×g hızda santrifüjleyin. Yıkama işlemini tekrarladıktan sonra, yıkama tamponunun 300 µL'si hariç tamamını aspire edin.Ardından, toplam 100 µL hacimde hücreleri hücre içi boyamak için, 1×10⁶ hücre başına seçilen antikorun her birinden 1 µg ekleyin. Kısa süre vortexleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Hücreleri daha önce olduğu gibi iki kez yıkayıp tüm süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 300 µL taze soğuk BD perm yıkama tamponunda yeniden süspande edin.Kısa bir vorteks işleminin ardından, süspansiyonu fax tüplerine filtreleyin. Fax analizini gerçekleştirmeye hazır olana kadar tüpleri buz üzerinde veya buzdolabında karanlıkta saklayın. İki naif fareden toplanmış diş eti hücreleri.LSR iki akış sitometresinde çalıştırılmış ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Burada gösterilen yan saçılma (side scatter) ve ön saçılma (forward scatter) grafikleri hücrelerin dağılımını göstermektedir. Lenfositleri, monositleri, dendritik hücreleri ve granülositleri tanımlamak için kullanılan kapılama (gating) stratejisi karşılaştırma amacıyla belirtilmiştir.Bu şekil, deneysel periodontitis ortamında oral gavajdan 21 gün sonra P gingivalis enfekte farelerden saflaştırılmış diş eti hücrelerini gösteren bir faks grafiğidir. Enfekte farelerde, burada gösterilen naif farelere kıyasla çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonlarında bir artış kolaylıkla tespit edilebilir. İşlem görmüş diş etindeki bağışıklık hücreleri, hematopoetik belirteç CD 45 eksprese eden hücreler üzerinde kapılama (gating) yapılarak tanımlanmıştır.Bu hücreler, bu şekilde gösterilen CD3 pozitif T hücrelerine daha da ayrıştırılmıştır. Nötrofiller ayrıca LY6G ve CD11b moleküllerinin ekspresyonuna göre tanımlanmıştır. Son olarak, Langerhans hücreleri ve dendritik hücrelerin epitelyal alt kümesi, MHC sınıf II pozitif CD11c pozitif hücrelerin kapılanması ve EPAM ile RIN CD207 ekspresyonu ile tanımlanmıştır. Bu prosedür takip edilerek ve uygun şekilde uygulandığında, teknikte uzmanlaşıldıktan sonra işlem üç buçuk ila beş saatte tamamlanabilir.Geliştirilmesinin ardından, tek hücreli gen ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların periodontal araştırma alanında, diş eti GVA'sındaki herhangi bir hasara karşı yerel yanıtı incelemelerinin önünü açmıştır. Bu teknik, deneysel periodontitis patogenezinde G GVA'nın immün ve immün olmayan hücrelerinin rolünü aydınlatmamıza olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi analizi için ekstraselüler ve intraselüler vir boyamasına tabi tutulacak tek hücreli bir süspansiyon elde etmek amacıyla idrar GVA'sının nasıl izole edileceği ve işleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-processing-and-analysis-of-murine-gingival-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Farenin tükürük bezi kök hücrelerin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklanmıştır. Yöntemi, enzimatik ve mekanik sindirim istihdam ve hücrelerin kök hücre özelliklerini içeren salispheres izolasyonu izin verir.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Bu video, bir fare modelinden dişeti bağışıklık hücresi ağının izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim, diş eti dokusunu bağlı dişlerden ve kemikten serbest bırakır, bu da mekanik olarak daha fazla sindirilir ve diş etinden bağışıklık hücrelerini serbest bırakır. İzole edilen hücreler immünolojik deneyler için hazırdır.

Murin Diş Bloklarından Dişeti İmmün Hücre Ağının İzolasyonu

Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Bu iletişim kuralı insan diş kökü çıkarılan diş kök hücrelerin geçici genetik mühendisliği açıklar. Uygulanan non-viral değişiklik strateji tedavi kök hücre ürünlerin geliştirilmesi için bir temel olabilir.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

Lakrimal bezi (LG), α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ifade eden iki hücre türüne sahiptir: miyoepitelyal hücreler (MECs) ve perikayt. MECS ektodermal orijinli, birçok glandüler dokularda bulunan, perikayt endodermal kökeni vasküler pürüzsüz Kas hücreleri iken. Bu protokol, murine LGs 'den MECs ve perikaytları yalıtır.

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Mevcut protokol, sürekli büyüyen bir fare kesici dişinden, fare azı dişinden ve insan dişlerinden tek hücreli RNA-seq analizine uygun tek hücreleri izole etmek için hızlı, verimli ve nazik bir yöntem sunar.

Fare ve İnsan Dişlerinden Tek Hücrelerin Hızlı İzolasyonu

Öğrenin, murin dişeti hücrelerini izole etme ve akış sitometrisi analizi için tek hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini. Bu teknik oral immünoloji ve periodontal hastalık araştırmalarında hücre popülasyonlarını incelemeyi sağlar.

Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz

Daha fazla video keşfet