Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz

Bu prosedürün genel amacı, daha sonra yapılacak akış sitometrisi analizi için mirin diş etini hassas bir şekilde izole etmek ve işlemektir. Bu işlem, öncelikle diş etinin titiz bir şekilde cerrahi olarak izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, eksize edilen doku, tek hücre süspansiyonu oluşturmak için işlenir.

Ardından, antikorlarla hücre dışı ve hücre içi boyama gerçekleştirilir. Son olarak, örnek akış sitometrisi ile analiz edilir. Nihayetinde, akış sitometrisi analizi ile diş etindeki farklı hücre popülasyonlarını ve immünolojik bir hasara maruz kalma sonrası dokuda meydana gelen hücresel değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, OC kimyasındaki veya mono floresan gibi yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda hücreyi analiz etmek için hızlı ve basit bir yöntem olması, birkaç değişkenin eş zamanlı analizine olanak tanıması ve ayrıca çeşitli hücre tiplerinin daha ileri deneyler için ayrıştırılabilmesidir. Bu yöntem, immünoloji alanındaki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, mikroorganizmaların gingival homeostazı nasıl etkilediği ve bir periodontitis deneysel modelinde inflamasyon kaynaklı kemik kaybı ile nasıl ilişkili olduğu gibi. Bu yöntem fikri ilk olarak periodontitis sırasında RI hücrelerinin rolünü ele almaya başladığımızda ortaya çıktı. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü GVA hızlandırma tekniği, küçük boyutu ve MU one J gva'ya erişimin nispeten zor olması nedeniyle öğrenilmesi güç bir tekniktir.

Başlamak için metin protokolüne uygun olarak medya çözeltilerini hazırlayın ve cerrahi aletleri sterilize edin. Kurumunuzun hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanmış yöntemlere göre bir fareyi ötanize ettikten sonra; yanaklar ve mandibula ramusu dahil olmak üzere ağız boşluğunun her iki yanını kesmek için keskin, küt uçlu düz makas kullanın ve standart makasları palatin kemik düzlemine dik olarak yönlendirerek mandibulayı aşağı çekin. Yumuşak ve sert dokuları, üçüncü molarların bir milimetre gerisinden geçen hayali bir hat boyunca kesin.

Ardından, kesici dişlerin iki milimetre gerisinden yumuşak ve sert dokular içinde bir insizyon yapın. Daha sonra, makasları damağa paralel tutarak burun boşluğunu açığa çıkarmak için ağzın ön kısmını aşağıya doğru çekin. Burun boşluğuna bir kanama kontrol malzemesi yerleştirin ve diğerini vestibülde, posterior insizyona doğru keserek bir insizyon yapmak için kullanın.

Maksillayı kafatasıyla bağlantısından ayırmak için insizyon işlemini maksillanın diğer tarafında tekrarlayın. Ardından maksillayı ortadan ikiye kesin ve abs ve forseps kullanarak her bir hemi maksilladan alveolar kemiğe ulaşmak için palatal dokuyu temizleyin. Diş eti dokularını anterior sınırdan soyun ve diş etlerini işlemek için PBS ve %2 fetal dana serumu veya FCS içeren bir plakaya yerleştirin; ardından dokuyu bir mililitre PBS, iki miligram/mililitre tip iki kollajenaz ve bir miligram/mililitre DNAs içeren bir kültür kabına aktarın.

15 numaralı steril bir cerrahi bıçakla parçalayın. Dokuyu, 15 mililitrelik konik bir test tüpüne aktarmadan önce iyice kıyın. Plakta kalan doku hücrelerini bir mililitre P-B-S-F-C-S ile yıkayın ve tüpe aktarın.

Dokuyu önceden ısıtılmış bir çalkalamalı inkübatörde 37 °C ve 200 RPM'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından 20 µL 0.5 M EDTA ekleyin ve 10 dakika daha inkübe edin. Sonrasında, hacmi 12 mL olacak şekilde P-B-S-F-C-S ekleyin ve örneği 4 °C'de, 400 ×g'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, hücreleri iki mililitre PBS-FCS içerisinde yeniden süspande edin. Akışı dört °C'de ve 320 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, örneği 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 300 µL PBS-FCS içerisinde yeniden süspande edin.

Son olarak, düşük sıcaklıktaki bir çeker ocak altında ve ışıklar kapalıyken, 100 µL toplam hacimdeki hücreleri sayın; seçilen her bir antikor için 10⁶ hücre başına 0.2 ila 0.5 µg ekleyin ve kısa süreli vorteksleyin. Örnekleri karanlıkta, 4 °C'de 15 dakika inkübe ettikten sonra, 2 mL PBS-FCS ekleyin ve 320 ×g'de, 4 °C'de beş dakika santrifüjleyin. Hücreleri sabitlemek için süpernatanı aspire edin ve ardından vorteksleyerek, 500 µL soğuk BD cyto perms'i damla damla ekleyerek hücreleri yeniden süspande edin.

Hücresel etkiler için tüpleri vortekslemeden sonra 40 dakika boyunca 4 °C'de karanlıkta inkübe edin. Kısaca, ardından 1 mL BD perm yıkama tamponu ekleyin ve 4 °C'de 7 dakika boyunca 800 ×g hızda santrifüjleyin. Yıkama işlemini tekrarladıktan sonra, yıkama tamponunun 300 µL'si hariç tamamını aspire edin.

Ardından, toplam 100 µL hacimde hücreleri hücre içi boyamak için, 1×10⁶ hücre başına seçilen antikorun her birinden 1 µg ekleyin. Kısa süre vortexleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Hücreleri daha önce olduğu gibi iki kez yıkayıp tüm süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 300 µL taze soğuk BD perm yıkama tamponunda yeniden süspande edin.

Kısa bir vorteks işleminin ardından, süspansiyonu fax tüplerine filtreleyin. Fax analizini gerçekleştirmeye hazır olana kadar tüpleri buz üzerinde veya buzdolabında karanlıkta saklayın. İki naif fareden toplanmış diş eti hücreleri.

LSR iki akış sitometresinde çalıştırılmış ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Burada gösterilen yan saçılma (side scatter) ve ön saçılma (forward scatter) grafikleri hücrelerin dağılımını göstermektedir. Lenfositleri, monositleri, dendritik hücreleri ve granülositleri tanımlamak için kullanılan kapılama (gating) stratejisi karşılaştırma amacıyla belirtilmiştir.

Bu şekil, deneysel periodontitis ortamında oral gavajdan 21 gün sonra P gingivalis enfekte farelerden saflaştırılmış diş eti hücrelerini gösteren bir faks grafiğidir. Enfekte farelerde, burada gösterilen naif farelere kıyasla çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonlarında bir artış kolaylıkla tespit edilebilir. İşlem görmüş diş etindeki bağışıklık hücreleri, hematopoetik belirteç CD 45 eksprese eden hücreler üzerinde kapılama (gating) yapılarak tanımlanmıştır.

Bu hücreler, bu şekilde gösterilen CD3 pozitif T hücrelerine daha da ayrıştırılmıştır. Nötrofiller ayrıca LY6G ve CD11b moleküllerinin ekspresyonuna göre tanımlanmıştır. Son olarak, Langerhans hücreleri ve dendritik hücrelerin epitelyal alt kümesi, MHC sınıf II pozitif CD11c pozitif hücrelerin kapılanması ve EPAM ile RIN CD207 ekspresyonu ile tanımlanmıştır. Bu prosedür takip edilerek ve uygun şekilde uygulandığında, teknikte uzmanlaşıldıktan sonra işlem üç buçuk ila beş saatte tamamlanabilir.

Geliştirilmesinin ardından, tek hücreli gen ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların periodontal araştırma alanında, diş eti GVA'sındaki herhangi bir hasara karşı yerel yanıtı incelemelerinin önünü açmıştır. Bu teknik, deneysel periodontitis patogenezinde G GVA'nın immün ve immün olmayan hücrelerinin rolünü aydınlatmamıza olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi analizi için ekstraselüler ve intraselüler vir boyamasına tabi tutulacak tek hücreli bir süspansiyon elde etmek amacıyla idrar GVA'sının nasıl izole edileceği ve işleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.