Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

Bu prosedürün genel amacı, diyabetojenik T hücrelerini transgenik farelerden endojen T ve b hücrelerinden yoksun farelere aktararak farelerde tip bir diyabeti hızlı bir şekilde indüklemektir. Donör farelerden dalak ve lenf düğümlerini toplayarak ve CD dört pozitif T hücresini saflaştırarak başlayın. Daha sonra, saflaştırılmış donör T hücrelerini kaymaz alıcı farelere aktarın.

Daha sonra alıcı fareleri tip bir diyabet gelişimi açısından izleyin. Sonuç olarak, bu protokol diyabet patogenezini incelemek ve diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında terapötik müdahaleleri araştırmak için kullanılabilir. BDC 2.5, CD dört pozitif T hücrelerinin kaymayan alıcılara aktarılması tekniğinin ana avantajı, tip bir diyabetin hızlı ve tekrarlanabilir gelişimidir.

Diyabetojenik CD donörleri için, dört pozitif T hücresi, idrar glikoz ölçümü ile diyabetsiz olduğu belirlenen altı haftalık diyabetik öncesi dişi BDC 2.5 fareleri kullanır. Dalak ve lenf düğümlerini çıkarmak için, kürkü% 70 etanol ile ıslatın, ardından cildi kesin, ön bacakların kasları açığa çıkana kadar cildi geri çekin. Ön uzuvların tabanına yakın bir yerde, her iki tarafta iki lenf düğümü görünür olmalıdır Her lenf düğümünü küçük cımbızla dikkatlice kavrayın ve bağ dokusunu keserek çıkarın.

Ardından, küçük makası kullanarak peritonda bir inçlik bir kesi yapın. Şimdi merkezdeki dalağı nazikçe kavrayın. Bağ dokusunu ve bağlı yağı dikkatlice kesin.

Daha sonra buz üzerinde 10 mililitre DMEM'de dalak, dantel, dalak ve lenf düğümlerini çıkarın. Steril 10 mililitrelik bir şırınga pistonunun ucuyla, lenfoid organları 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden hafifçe bastırın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için.

Hücrelerin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için her süzgeci bir mililitre DMEM ile birkaç kez durulayın. Daha sonra toplanan hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yedi dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücre peletini üç mililitrelik bir CK tamponunda yeniden süspanse edin.

Şimdi her oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Yatmak için, kırmızı kan hücreleri şimdi 12 mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Hücre peletini 10 mililitre DMEM'de bir kez yıkayın.

Daha sonra, hücreleri beş mililitre gerçek boyama tamponunda askıya alıyoruz ve canlı hücrelerin sayısını saymak için bir faz kontrast mikroskobu ve hemo sitometre kullanıyoruz. Şimdi boyama kontrolü başına altı hücreden yaklaşık 10'unu yaklaşık bir kez çıkarın. Ayrıca, aktive edilmemiş transgenik CD dört pozitif T hücresini sıralamak için hücreleri fare monoklonal antikorları ile boyayın.

Tüm bu örnekleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Şimdi hücreleri faks tamponunun boyama hacminin üç katı ile yıkayın ve hücreleri faks tamponunda bir ila iki kez, numuneyi ayırmak için mililitrede 10 ila yedi hücre ve tek leke kontrolleri için 300 mikrolitre olarak yeniden süspanse edin. Ardından, hücre örneğini 35 mikrometrelik bir hücre süzgeci kapağı tüpünden geçirin.

Hücre kümelerini çıkarmak için, numuneleri eğitimli bir operatörle bir hücre sıralayıcı için işleyin Kurulum süresi de dahil olmak üzere yaklaşık üç saat bekleyin, yaklaşık 1,5 kez 10 üzeri sekizinci toplamlar Transgenik naif CD, dört pozitif T hücresi. Fare başına altı hücrenin yaklaşık 2,5 katı, 10'unu bekleyebilirsiniz ve BD Fox Aria gibi bir enstrümanda sıralama hızı saniyede yaklaşık iki kez 10 dördüncü olay olacaktır. Sıralanan hücreleri üç mililitre DMEM'de toplayın.

Sıralanmış hücrelerin mutlak sayısını kaydedin ve yedi dakika boyunca santrifüjleyin. 400 Gs'de, evlat edinen T hücresi transferi için hücre peletlerini steril fosfat tamponlu salin içinde süspanse ediyoruz. 18 gauge bir iğnede bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, faksla saflaştırılmış CD dört pozitif T hücresini nazikçe yeniden süspanse edin.

Bir mililitrelik şırıngayı yükleyin, ardından enjeksiyona hazırlanırken, şırıngaya 27 noktalı yarım gauge bir iğne takın. Düğüm kızağı alıcı fareleri kısıtlayın ve enjeksiyon bölgesini dezenfekte etmek için kuyruklarını %70 etanol ile silin. Daha sonra, fare başına altı saflaştırılmış CD'nin 10'da birini, dört pozitif T hücresini, yanal kuyruk damarlarından herhangi birine enjekte edin.

Kuyruk damarı enjeksiyonlarınızı yaparken pistonu zorlamadığınızdan emin olun. İğne gerçekten damar içindeyse, enjeksiyonunuz T hücresi transferinden beş gün sonra başlayarak neredeyse hiç direnç göstermeden gerçekleşmelidir. Tip bir diyabet gelişimi için nod skid alıcı fareleri günlük olarak izleyin.

Üreticilere ve talimatlara göre reaktif şeritleri kullanarak idrar glikozunu ölçün. Desilitre başına 250 miligramdan daha yüksek iki ardışık idrar glikoz okuması olan farelerin diyabetik olarak kabul edildiğini unutmayın. Tipik bir deneyde, her BDC 2.5 donör faresi, diyabetojenik CD dört pozitif T hücresinin evlat edinici transferinden sonra hücre sıralamasından sonra altı saf transgenik CD dört pozitif T hücresinin yaklaşık iki buçuk katını verir, fareler idrar glikoz konsantrasyonları için izlendi.

BDC 2.5 donör farelerden az sayıda hücrenin evlat edinme transferi, 11. güne kadar kaymayan tüm alıcılarda tip bir diyabeti indükledi. Düzgün yapıldığında, bu teknik organ alımından T hücresi transferine kadar yaklaşık sekiz saat içinde yapılabilir.