Name: Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Öğrenin, farelerde tip 1 diyabeti hızla indüklemek için diyabetojenik CD4+ T hücrelerinin kabul edilmiş transferi yöntemini. Bu protokol, diyabet patogenezini ve terapötik müdahaleleri araştırmak için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr teşekkür ederim. Yararlı yorumlar için Robert Bonneau ve Neil Christensen. Bu çalışma Tıp fonların Pennsylvania State Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Dalak ve BDC2.5 Farelerin lenf düğümleri alınan T Hücre İzolasyonu <ol><li> Diyabetojenik CD4 + T-hücrelerinin vericisi olarak 6 haftalık bir pre-diyabetik BDC2.5 dişi farenin kullanın. Idrar glukoz ölçümü (bkz. aşağıda) tarafından belirlenen Fare diyabet arındırılmış olmalıdır. </li><li> CO 2 boğulma kullanarak her fare Euthanize ve steril koşullar altında dalak, aksiller ve brakiyal lenf düğümleri kaldırın. Dalak kaldırmak için,% 70 etanol ile kürk ıslatın, sonra kesmek ve cilt geri çekin. Dalak farenin sol tarafında koyu kırmızı organı olarak görülebilir. Küçük makas kullanarak periton bir 1 inç kesi olun ve yavaşça küçük bir cımbız ile merkezinde dalak kavramak. Dikkatlice bağ dokusu ve ekli yağ mümkün Döşeme ve dalak çıkarın. </li><li> Buz üzerinde 15 ml konik bir tüp içinde 10 ml Dulbecco&#39;s-Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde dalak ve lenf düğümleri toplayın. </li><li> Inci kullanarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlayınyavaşça 70 mikron hücre süzgeçler (süzgeç başına bir dalak ve süzgeç başına 4-6 lenf düğümleri) aynı 50 ml konik tüp içine aracılığıyla lenfoid organlara basın steril bir 10 ml şırınga pistonu e sonu. </li></ol> Bu işlem sırasında, süzgeç hücreleri kurtarma en üst düzeye çıkarmak için, 1 ml DMEM ile birkaç kez her süzgeç yıkayın. <ol start="5"><li> Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 300-400 xg&#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine 50 ml konik tüp, toplanan hücre transfer edin. </li><li> Kırmızı kan hücreleri lize etmek için, supernatant 5 ml amonyum-klorür Potasyum (ACK) tampon maddesi (pH 7.2) &#39;de hücrelerin yeniden askıya, ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında ACK hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> ACK-hücre süspansiyonu, 10 ml DMEM ekleyin ve yukarıdaki gibi santrifüj tüpü. 10 ml DMEM içinde bir kez hücre pelletini yıkayın. </li></ol> 2. Diyabetojenik CD4 Floresan ile aktive Hücre Ayırma + BDC2.5 fareler ile T hücrelerinin <ol><li> 5 ml FACS s yeniden askıya hücreleritampon temi ve tripan mavi boya dışlama tarafından canlı hücreler (bir faz kontrast mikroskop ve hemasitometre kullanarak) sayısını. </li><li> FACS tamponu kullanarak, 5 x 10 7 hücre / ml hücre süspansiyonu hacmi ayarlanır. ~ 1 çıkarın x 10 boyama kontrolü başına 6 hücre (1 leke, 3 adet tek kişilik lekeleri). Aktif olmayan transgenik CD4 + anti-CD4 T hücreler (APC), bir anti-TCR Vβ4 (FITC), 15 ml lik tüp içinde bir anti-CD62L (PE) monoklonal antikor (mAb) için örnek Leke. Karanlıkta 4, 20-30 dakika için üretici tarafından önerilen mAb konsantrasyonu ° C kullanarak hücre boyama gerçekleştirin. </li><li> &gt; 3X boyama reaksiyon hacmi, FACS tamponu ile ve numune bir leke kontrol yıkayın. (1-2 x 10 7 hücre / numune sıralama için ml ve 300 ul tek leke kontrolleri için) ve buz üzerinde mağaza sonraki kadar 300-400 xg tüp santrifüj, süpernatant kaldırmak ve FACS tampon hücrelerin yeniden askıya adım. </li><li> 35 mikron hücre aracılığıyla hücre örneği geçmeksüzgeç kapaklı tüp hücre kümeleri kaldırmak için. CD4 için örnekleri sıralamak + TCR Vβ4 + CD62L + eğitimli bir operatör ile hücre sıralayıcı hücreleri. 15 ml&#39;lik bir tüp içinde 3 ml DMEM içine kriteri hücreleri toplamak. 2 x 10 4 toplam olay / sn bir tür oranında 1,5 x 10 8 hücre (3 donör farelerden elde edilen hücrelerin yaklaşık sayısı) sıralamak için, kurulum dahil olmak üzere 2.5-3 saat, izin verin. Bekleyin ~ 2.5 x 10 6 sigara aktif transgenik CD4 + hücre sıralama sonra fare başına T hücreleri. </li><li> Sıralama sonunda sıralama kriteri hücrelerinin mutlak sayısı kaydedin ve 300-400 x g 7 dakika onları santrifüj. Süpernatant atılır ve yeniden askıya hücreleri (2 x 10 6 hücre / ml) içinde steril fosfat tamponlu adoptif T hücre transferi tuzlu su (PBS) (Mg2 + / Ca2 + içermez). </li></ol> 3. BDC2.5 fareler ile diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer + T Hücreleri <ol><li> Yeniden askıya FACS-saflaştırılmış CD4 hafifçe, bir 1 ml şırınga ve 18-1 ½ iğne kullanarak +1 ml şırınga T hücreleri ve yükleyin. Enjeksiyon için hazırlanırken, 18-1 yerine ½ iğne bir 27 ile ½ iğne. </li><li> Bu davranış bakım sergilenirken kadar bir ısıtma lambası için 6-8 haftalık dişi NOD.SCID alıcı fareler Açığa. </li><li> Bir süzgeç olarak alıcı farenin sınırlamaya ve enjeksiyon dezenfekte etmek için% 70 (v / v) etanol ile kuyruk silin. </li><li> Lateral kuyruk damar birine 1-2 x 10 6 FACS sıralama kriteri hücre / fare (en fazla 500 ul PBS) enjekte edilir. </li></ol> Piston zorlamayın. Iğne damar uygun bulunuyorsa, enjeksiyon hemen hemen hiçbir direniş ile gerçekleşecek. 4. Hiperglisemi için Alıcı Fare İzleme ve T1D <ol><li> T hücre transferinden sonra beş gün başlayan, NOD.SCID alıcı fareler üreticinin talimatlarına göre reaktif şeritler (Bayer Diastix) kullanarak yüksek idrar glukoz için günlük olarak takip edilmektedir. Birbirini takip eden iki purin ile fareninE şekeri&gt; 250 mg / dl &#39;diyabetik olarak kabul edilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
<li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes%3A+immune+dysregulation+gets+the+NOD%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li>
<li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li>
<li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4%2B+and+Lyt-2%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li>
<li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4%2B+islet-specific+T+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice.+Relative+contributions+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li>
<li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li>
<li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8%2B+cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li>
<li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+maintenance%2C+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines%2Fclones+from+the+nonobese+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li>
<li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+apoptosis+in+T+cell-mediated+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).</li>
<li>Amrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-independent+beta-cell+destruction+by+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+lymphocytes+in+transgenic+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).</li>
<li>Dobbs, C., Haskins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+T+cell+clone+and+of+T+cells+from+a+TCR+transgenic+mouse%3A+TCR+transgenic+T+cells+specific+for+self-antigen+are+atypical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical.</a> J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).</li>
<li>Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+clone+specific+for+pancreatic+islet+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen.</a> Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+is+an+autoantigen+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes.</a> Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).</li>
<li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-dependent+regulatory+circuits+in+immune+inflammation+highlighted+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes.</a> J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li>
<li>Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4%2B+Foxp3%2B+cells+in+BDC2.5NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li>
<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

Tüm fareler Penn State Kurumsal Hayvan Bakım kurallarına uygun ve Kullanım Kurulu Tıp spesifik patojen free (SPF) tesisinin Penn State College ev sahipliği edildi. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Tip 1 diyabetin, NOD farelerinde diyabet veya diyabetojenik T hücresi klonları elde TCRS için transgenik farelerden dalak hücreleri tamamen veya T hücre alt adoptif transfer yoluyla verimliliği değişen alıcı farelerde uyarılabilir. Bu tarifnamede NOD.SCID farelere FACS saflaştırılmış CD62L + BDC2.5 transgenik CD4 + T hücreleri,% 100 aktarma oranı iki hafta içinde alıcı farelerde T1D ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunulmaktadır. BDC2.5 T hücre transferi modelinin özel avantajlar s...

NOD farelerinde kendiliğinden otoimmün diyabet gelişir ve yaygın olarak insan tip 1 diyabetin 1,2 için bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. NOD farelerinde tip 1 diyabetin patogenezi T ve B hücreleri tarafından takip dendritik hücreler ve makrofajlar tarafından Langerhans pankreatik adacık arasında, yaş, 3-4 haftalık başlayarak, infiltrasyonu ile karakterize edilir. Tahribatsız peri-insülit Bu aşama 3 yaş arasında 4-6 ay belirgin diabetes ile sonuçlanan, insülin üreten pankreatik β hücre yavaş ilerleyen yok edilmesini sağlar. 4,5 splenositler, CD4 +, NOD farelerinde diyabet ikinci 6,7 veya CD8 + T hücreleri, 8,9 transferini adacık-reaktif T hücreleri, tip 1 diyabetin patojenezinde merkezi bir rol oynadığını gösteren, bağışıklık sistemi, NOD farelerinde diyabet aracılık ettiği gösterilmiştir. Deneysel koşullara bağlı olarak, diyabet bu çalışmalarda birkaç hafta boyunca, yavaş yavaş alıcı farelerde geliştirilmiştir. Benzer şekilde, çeşitli T hücresi klonları, zaman alıcı ve pahalı bir hesaplayarakdiyabetojenik T hücrelerinin kültürlenmesi, birkaç hafta alıcı farenin 7,10 içine transferinden sonra şeker hastalığı aracılık ettiği bildirilmiştir. CD4 veya CD8-kısıtlı diyabetojenik T hücresi klonları, birkaç laboratuar tarafından türetilen TCRS eksprese eden transgenik farelerin kullanılması ile daha sonra bu farelerin dalak T hücreleri 11-13 alıcıya diyabet aktarmak mümkün olduğunu göstermiştir. Özellikle, BDC2.5 NOD farelerinde kromogranin A, pankreatik beta hücreleri 14-16 bir protein için spesifik olan BDC2.5 TCR için transgenik olan. In vitro-aktif veya verimliliği 11,17-19 değişen yenidoğan veya bağışıklık yetersizliği NOD fareler diyabet transfer açıkça diyabetik veya prediyabetik BDC2.5 farelerin un-aktif tamamen veya fraksiyone dalak hücrelerinde devri. Bu saflaştırılmış CD4 transgenik kullanan basit bir yöntem + yüksek verim ve müteşekkildi de alıcı farelerde T1D endüklemek için, pre-diyabetik BDC2.5 farenin alınan T hücreleri tanımlamakNCY. Naif, adacık antijene özgü CD4 + T hücrelerinin çok sayıda CD4 floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) TCR transjenik Vβ4 zincirini ifade + CD62L + T hücreleri, bu farelerden izole edilmiştir. Saflaştırılmış transgenik sonra T hücreleri fonksiyonel T ve B hücreleri eksikliği ve insülit ve şeker içermeyen 20 vardır NOD.SCID farenin içine aktivasyonsuz aktarılır. Alıcı fareler T hücre transferinden sonra iki hafta içinde hızla gelişir T1D, gösteren idrar glukoz konsantrasyonları için izlenir. Heterojen özgünlükleri ile diyabetojenik T hücreleri aktarmak, bizim protokol FACS-sıralaması CD4 + neredeyse sadece diyabetojenik BDC2.5 TCR ifade T hücreleri kullandığı diğer yöntemler aksine. Homojenlikleri bağlı olarak, transfer T-hücreleri (1x10 ~ 6 hücre / fare) sadece çok az sayıda% 100 görülme az 2 hafta içinde hızlı bir tip 1 diyabetin gelişimi için gereklidir. Bizim protokol bir diğer avantajı irradiatio olanalıcı farenin n bazı diğer yöntemler için olduğu gibi gerekli değildir. Bu yöntemin özel bir potansiyel bir sınırlama hem CD4 ve CD8 T hücresi alt ya da özellikle diyabet ve CD8 T hücrelerinin katkı soruşturma izin olmamasıdır. Açıklanan protokol hedef organa adacık antijen belirli Th hücreleri yuvalandırma müdahalede saf, monospesifik CD4 + T hücreleri, hem de tedavi edici stratejiler aracılığı ile oluşan hızlı bir tip 1 diyabetin gelişimi, çalışmak için yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>BDC 2.5 TCR transgenik NOD fareleri (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcr&#946; BDC 2.5)</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>BAŞINI SALLA. SCID fareleri (NOD. CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Themo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril küçük çift makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril büyük çift makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m hücreli süzgeçler</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; M Hücreli Süzgeç Kapağı Tüpleri</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) tamponu</td><td></td><td></td><td>0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 < dHsub>2O</td></tr><tr><td>BD FACSFlowTM kılıf sıvısı</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS boyama tamponu</td><td></td><td></td><td>PBS, 0,2 mM EDTA, %0,5 BSA/FCS, filtre sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>Faz kontrast mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (APC) mAb</td><td>Biolegend</td><td>1005616</td><td>klonu RM4-5</td></tr><tr><td>Anti-TCR V & # 946; 4 (FITC) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553365</td><td>klonu KT4</td></tr><tr><td>Anti-CD62L (PE) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553151</td><td>klonu MEL-14</td></tr><tr><td>Hücre sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>e. BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Isı lambası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare kısıtlayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>18-1&frac12; gauge iğneler (steril)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; gauge iğneler (steril)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

diyabetojenik cd4 kabul edilmiş transfer ile farelerde hızlandırılmış tip 1 diyabet İndüksiyon + t hücreleri

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Obez olmayan diyabetik (NOD) fare kendiliğinden yaş 12 hafta sonra otoimmün diyabet gelişir ve insan Tip 1 diyabet (T1D) en çok çalışılan hayvan modelidir. Işınlanmış alıcı farelerde hücre transferi çalışmaları T hücreleri bu modelde T1D patogenezinde önemli olduğunu kurduk. Hızla arıtılmış adoptif transfer yoluyla T1D endüklemek için burada basit bir yöntem tarif primer CD4 + NOD.SCID alıcı farelere adacık-spesifik T hücre reseptörü (TCR) BDC2.5 için transgenik pre-diyabetik NOD farelerde T hücreleri. Bu tekniğin en önemli avantajlarından aynı gün içinde, alıcıların ışınlama gerekli değildir, ve tip 1 diyabetin yüksek oranda T hücre transferinden sonra 2 hafta içinde ortaya çıkarılan bir diyabetojenik T hücrelerinin izolasyonu ve evlatlık transferi tamamlanabilir vardır. Böylece, T1D patogenez ve tedavi edici girişimlerin çalışmaları heterojen T hücre popülasyonlarının veya klonlar dayalı yöntemlere göre daha hızlı bir oranda devam edebilirsinizNOD farelerinde diyabet türetilmiştir.

Bulgularımız başta pankreas lenf düğümleri gibi ikincil lenfoid organlara eve T hücreleri için önemlidir CD62L, ifade transgenik BDC2.5 hücrelerin izolasyonu göstermektedir. Bulgularımız hızlı aktarmak ve verimli NOD.SCID alıcı farelere T1D için bu monospesifik T hücre popülasyonunun güçlü yeteneğini göstermek. Diyabetojenik CD4 + BDC2.5 farenin alınan T hücrelerinin izolasyonu, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Toplanmış, dalak ve lenf düğümleri yaklaşık 5 x 10 7 hü...

Biz adacık antigen spesifik primer CD4 + T-hücrelerinin adoptif transfer yoluyla, iki hafta içinde farenin tip 1 diyabet (tip 1 diyabetin) ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Bu prosedürün genel amacı, diyabetojenik T hücrelerinin transgenik farelerden, endojen T ve B hücrelerinden yoksun farelere aktarılarak farelerde hızla tip 1 diyabet indüklemektir. Donör farelerden dalak ve lenf düğümlerini toplayarak ve CD4 pozitif T hücrelerini saflaştırarak başlayın. Ardından, saflaştırılmış donör T hücrelerini nüd (non-SCID) alıcı farelere adoptif olarak aktarın.Ardından, alıcı fareleri tip 1 diyabet gelişimi açısından izleyin. Nihayetinde bu protokol, diyabet patogenezini incelemek ve diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında terapötik müdahaleleri araştırmak için kullanılabilir. BDC 2.5, CD4 pozitif T hücrelerinin non-skid alıcılara aktarıldığı bu tekniğin temel avantajı, tip 1 diyabetin hızlı ve tekrarlanabilir şekilde gelişmesidir.Diabetojenik CD four pozitif T hücreleri donörleri için, idrar glukoz ölçümüyle diyabet olmadıkları belirlenmiş altı haftalık pre-diyabetik dişi BDC 2.5 fareler kullanın. Dalak ve lenf düğümlerini çıkarmak için kürkü %70 etanol ile ıslatın, ardından deriyi kesin ve ön ekstremite kasları açığa çıkana kadar deriyi geri çekin. Ön ekstremitelerin tabanına yakın bölgede, her iki yanda ikişer lenf düğümü görünür olmalıdır. Küçük bir cımbızla her bir lenf düğümünü dikkatlice kavrayın ve bağ dokusunu kırparak çıkarın.Ardından, küçük makas kullanarak peritonda yaklaşık 2,5 cm'lik (bir inç) bir insizyon yapın. Şimdi dalağı merkezden nazikçe kavrayın. Bağ dokusunu ve yapışık yağları dikkatlice temizleyin.Ardından dalağı çıkarın, dalakları ve lenf düğümlerini buz üzerinde 10 milliliters DMEM içerisine yerleştirin. Steril bir 10 milliliter şırınga pistonunun ucuyla, lenfoid organları 70 micrometer hücre süzgecinden nazikçe geçirin. Böylece tek hücre süspansiyonu elde edin.Hücre geri kazanımını maksimize etmek için her süzgeci birkaç kez 1 mL DMEM ile durulayın. Ardından, toplanan hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 400 G'de yedi dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücre peletini 3 mL CK tamponunda yeniden süspande edin.Şimdi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Alyuvarları liz etmek için 12 mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri santrifüj ile peletleyin. Hücre peletini 10 mililitre DMEM ile bir kez yıkayın.Ardından, hücreleri beş mililitre fact boyama tamponunda süspanse ederiz ve canlı hücre sayısını belirlemek için faz kontrast mikroskobu ile hemositometre kullanırız. Şimdi, boyama kontrolü başına yaklaşık 1 × 10⁶ hücre alın. Ayrıca, aktive edilmemiş transgenik CD4 pozitif T-hücrelerini ayırmak için hücreleri fare monoklonal antikorları ile boyayın.Tüm bu örnekleri dört °C'de, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından hücreleri, boyama hacminin üç katı kadar FACS tamponu ile üç kez yıkayın ve hücreleri; sıralama örneği için mL başına 1 ila 2 × 10⁷ hücre, tekli boyama kontrolleri için ise 300 µL olacak şekilde FACS tamponu içinde yeniden süspande edin. Sonra, hücre örneğini 35 µm'lik bir hücre süzgeçli kap tüpten geçirin.Hücre kümelerini gidermek için örnekleri, eğitimli bir operatör eşliğinde hücre ayıklayıcı (cell sorter) ile işleyin. Yaklaşık 1,5 × 10⁸ toplam transgenik naive CD4 pozitif T hücresini ayıklamak için, kurulum süresi dahil yaklaşık üç saat ayırın. Fare başına yaklaşık 2,5 × 10⁶ hücre elde etmeyi bekleyebilirsiniz ve BD FACSAria gibi bir cihazda ayıklama hızı saniyede yaklaşık 2 × 10⁴ olay olacaktır. Ayıklanan hücreleri 3 mL DMEM içerisine toplayın.Sıralanan hücrelerin mutlak sayısını kaydedin ve yedi dakika boyunca santrifüjleyin. 400 Gs'de, hücre peletlerini adaptif T-hücresi transferi için steril fosfat tamponlu saline süspande ederiz. 18 gauge iğneye sahip bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, FACS ile saflaştırılmış CD4 pozitif T hücrelerini nazikçe yeniden süspande edin.Bir mililitrelik şırıngayı doldurun ve ardından enjeksiyona hazırlık amacıyla şırıngaya 27,5 gauge bir iğne takın. Knot skid alıcı fareleri sabitleyin ve enjeksiyon bölgesini dezenfekte etmek için kuyruklarını %70 etanol ile silin. Daha sonra, fare başına 1 × 10⁶ saflaştırılmış CD4 pozitif T hücresini lateral kuyruk venlerinden herhangi birine enjekte edin.Kuyruk veni enjeksiyonlarını yaparken pistonu zorlamadığınızdan emin olun. İğne gerçekten venin içindeyse, enjeksiyon neredeyse hiç dirençle karşılaşmadan gerçekleşmelidir. T-hücresi transferinden beş gün sonra başlayarak, NOD skid alıcı fareleri tip 1 diyabet gelişimi açısından günlük olarak izleyin.İdrar glukozunu, üretici talimatlarına uygun olarak reaktif şeritler kullanarak ölçün. Ardışık iki idrar glukoz ölçümü 250 milligrams per deciliter değerinin üzerinde olan farelerin diyabetik kabul edildiğini unutmayın. Tipik bir deneyde, her BDC 2.5 donör faresinden, hücre ayıklama sonrası yaklaşık iki buçuk tane 10⁶ naif transgenik CD4 pozitif T hücresi elde edilir; diyabetojenik CD4 pozitif T hücrelerinin adoptif transferinden sonra farelerin idrar glukoz konsantrasyonları izlenmiştir.BDC 2.5 donör farelerinden küçük sayılarda hücrelerin adaptif transferi, tüm non-skid alıcılarda 11. güne kadar tip 1 diyabeti tetikledi. Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik organ hasadından T-hücresi transferine kadar yaklaşık sekiz saat içinde tamamlanabilir.

accelerated-type-1-diabetes-induction-mice-adoptive-transfer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protokolü, temiz ve kolay bir adacık veya hücreleri farelerin böbrek kapsülü altında sunmak için geliştirildi. Hücreler, böbrek kapsül altında hücrelerinin nakli için kullanılan son tüp pelet içine yoğunlaşmıştır. Bu tekniğin kolaylığı hücreleri ve fare stresi azaltır.

Diyabetik Fare Böbrek Kapsül içine, Pankreas Islets Nakli

Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Bu videoda, obez olmayan diyabetik immün yetmezliği olan bir fareye nakledilen lusiferaz eksprese eden beta hücrelerini görselleştirmek için görüntüleme tabanlı bir yöntem gösterilmektedir. Diyabetik bir fareden splenositlerin eklenmesi, substrat girişinden sonra azalan lüminesans ile görsel olarak doğrulanan ilerleyici beta hücre yıkımına yol açar.

Diyabetik Splenositlerle Mücadele Edilen İmmün Yetmezliği Olan Bir Farede Transgenik Beta Hücrelerinin Görüntülenmesi

Burada, sinjeneik CD4 + CD45RByüksek T hücrelerinin T ve B hücresi eksikliği olan alıcılara evlat edinici transferi yoluyla farelerde kolon iltihabını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. Klinik ve histopatolojik özellikleri insan inflamatuar barsak hastalıklarını taklit eder. Bu yöntem, kolon iltihabının başlaması ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Bu protokol, spontan diyabetik NOD farelerinden saflaştırılmış splenositlerle mücadele eden obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli farelerde NIT-1 hücrelerinin nakli ve görüntülenmesi için basit ve minimal invaziv bir yöntemi tanımlamaktadır.

Farelerde Otoimmün Diyabetin Evlat Edinilen Transfer Modelinde Greft Sağkalımının Biyolüminesan İzlenmesi

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Sitotoksisite deneyleri, HIV bulaşmış hücrelerin doğal öldürücü hücre litik tepkileri ölçmek için hedef hücreler saflığı ile sınırlıdır. Biz burada, HIV-1 yeteneğini CD4 aşağı modüle yararlanarak HIV-1 ile enfekte birincil T-hücre patlamaların son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

Bazı fare suşlar miyelin temel protein olan deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) indüksiyon karşı edebiliyoruz. Burada anlatılan yanıtsızlık tersine çevirir ve birkaç tipik EAE dirençli fare lekeler paralitik hastalığın neden basit bir bağışıklama protokoldür.

Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Öğrenin, farelerde tip 1 diyabeti hızla indüklemek için diyabetojenik CD4+ T hücrelerinin kabul edilmiş transferi yöntemini. Bu protokol, diyabet patogenezini ve terapötik müdahaleleri araştırmak için kullanılabilir.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

Daha fazla video keşfet