Name: Bir uygulama In vitro DNA Koruma Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Öğrenin, E. coli'den Dps proteininin saflaştırılması ve DNA'yı oksidatif hasardan koruma yöntemini. Bu teknik, bakteri stres mekanizmalarını anlamak için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, ve yararlı tartışmalar için Kourosh Azim Honarmand İbrahimi minnettarız. Bu çalışma Delft Teknoloji Üniversitesi&#39;nden finansman start-up tarafından desteklenmiştir.

1. Dps İfade ve Arıtma Yüksek saflıkta protein elde DNA-koruma deneyi için önemli bir ilk adımdır. DPS protein saflaştırma, 4-5 gün içinde gerçekleştirilebilir. <ol><li> E. Bir proteaz eksikliği olan gerginlik Dönüşümü DPS protein-kodlama sekansı klonlanmıştır içine pET vektörü (örneğin pET17 gibi) coli (örneğin, BL21 (DE3) pLysS gibi). </li><li> Çizgi uygun antibiyotik (örneğin, 1.1 &#39;de verilen örnekler için, ampisilin ve kloramfenikol gibi) içeren Luria Broth (LB) agar plakaları üzerine hücreleri transforme. 37 gece boyunca inkübe ° C </li><li> Uygun antibiyotikler ihtiva eden LB ortamı, 30 ml içine plakadan tek bir koloni inoküle. 37 gece boyunca inkübe ° C 200-250 rpm sallayarak. </li><li> 10 ml gecelik kültürü her biri ile uygun bir antibiyotik içeren 2 x 1 L LB vasatı inoküle. OD 600, sallayarak ise, 37 ° C de büyümeye </alt&gt; yaklaşık 0.6. (Belirgin bir şekilde nihai ürünün saflığını ödün vermeden, yüksek bir protein verimi artar OD hücre yetiştirilmesi.) 0.3 mM bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edilerek DPS ekspresyonunu ve çalkalama sırasında 37 ° C &#39;de 3-4 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj ile hasat hücreleri. Indüklenen hücre kültürü L başına DEAE tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) içinde 7.5 ml hücre topakları yeniden süspanse edin. Örnekler sıvı nitrojen içinde dondurulur ve arzu edildiği takdirde, -80 ° C&#39;de saklanabilir. Bu prosedür daha sonra 4 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde örnekleri eritilmesi ile devam edilebilir </li><li> Aşırı ekspresyona DPS bozulmasını önlemek için hücre süspansiyonu proteaz inhibitörleri (örneğin, Calbiochem grubu III proteaz inhibitörleri olarak, hücre süspansiyonu, ml başına 0.167 ul) karışımı ekleyin. </li><li> Bir Fransız basını kullanarak hücre-ücretsiz özü hazırlamak. 20 ml DEAE Tampon A (sürekli-akış modeli kullanıyorsanız), daha sonra sınıfta yıkıcı ile Başbakan Fransız basınıt 20 kpsi az iki kez örnek. Çözünmeyen parçacıkların açıklamak için 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca 30,000 x g&#39;de santrifüj lizat ve süpernatant kaydedin. İstenirse Süpernatant daha sonra, sıvı azot ile dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Bir FPLC DEAE ile tampon A ile 30 ml&#39;lik bir DEAE-Sefaroz CL-6B kolonu, dengelenmesi. Arka plan üzerinde 0,2 MPa arasında bir maksimum basınç ile 1-2 ml / dk &#39;da sütun üzerinden tampon çalıştırın. Sütun üzerine hücre ücretsiz özü yük ve akış yoluyla OD 280 sinyal temel üzerinde artmaya başladıktan sonra toplamaya başlar. DEAE Tampon ile sütun yıkayın bir sürekli akış yoluyla toplarken OD 280 değeri, temel dönene kadar. Akış yoluyla bağlı DNA&#39;dan serbest DPS proteinin, içermelidir. % 100 tampon B (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 M NaCI, 0.1 mM EDTA) ile sütun yıkayın. Bu eluat DPS-DNA kompleksleri gibi diğer proteinler içerir ve atılabilir. </li><li> Reklamı kaldırınamonyum sülfat çöktürme yoluyla protein ditional kirletici. Toplanmış akış yoluyla hacmi belirleyin. Yavaş yavaş (10-20 dakika arasında bir süre boyunca) 4 az% 62 doygunluk (solüsyonun ml&#39;si başına 390 mg), ° C de karıştırılarak kuru bir küçük taneli amonyum sülfat ekleyin. Tüm dengeleme sağlamak için amonyum sülfat son bölümü ilave edilmesinden sonra, 20-30 dakika boyunca karıştırılır. Kirletici proteinlerin çözeltiden çökelebilir olurken DPS, çözünür olmaya devam edecektir. </li><li> 4, 30 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile Çöken proteinler çıkarmak ° C ve süpernatan kaydedin. </li><li> Yavaş yavaş% 94 doygunluğa ulaşmak ve tam denge sağlamak için 20-30 dakika süreyle karışmaya süpernatan ml&#39;si başına ek bir 227 mg amonyum sülfat ekleyin. DPS bu yüksek tuz konsantrasyonunda çökelir ve 4 ° C de 30 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile toplanabilir DPS pelet olacak, süpernatant ekarte edilebilir. Pelet -80 saklanabilir ° C eğer desIRED. </li><li> Tabanda tampon içinde DPS-içeren pelet (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) yeniden süspanse edin. 2.5 ml örnek ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Tampon değişimi, bir PD-10 jel filtrasyon kolonu kullanılarak amonyum sülfat kaldırın. 25 mi tabanda tampon ile jel yatağı dengelenmesi. PD-10 sütunun üstüne DPS örnek 2.5 ml uygulayın ve Flow-through atın emmek sağlar. 3.5 mi tabanda tampon ile yıkanarak DPS toplayın. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de tampon ile-yer değiştirilmiş örnek Santrifüj ° C çözülmeyen bileşenler kaldırmak ve 6-10 ml seyreltme tamponu (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 0.1 mM EDTA) ile seyreltin sağlamak için bu Tuz konsantrasyonu DPS SP Sepharose kolonuna bağlamak için yeterince düşüktür. DPS Özellikle konsantre örnekler olarak sıvı bulutlu kanıtladığı düşük tuz tamponu içine seyreltme ile daha az çözünür hale gelebilir, ancak tamamen küçük Amou ilavesiyle çözündürülmüş edilebilir5 M NaCl çözeltisi nt (ek 10-20 mm). </li><li> SP tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) ile 30 ml&#39;lik bir SP Sefaroz Hızlı Akışlı kolon dengelenmesi. 1.5-2 ml / arka plan üzerinde 0.3 MPa&#39;lık bir basınç limiti olan dk kolonu boyunca tampon çalıştırın. Sütun üzerine örnek yerleştirin. OD 280 iz dönene kadar başlangıca SP Tampon A ile yıkayın ve flow-through atın. 2 ml&#39;lik fraksiyonlar toplarken, 0-100% Tampon B, 150 ml&#39;lik bir doğrusal gradyan çalıştırın. % 10 değişim mümkün olsa DPS, yaklaşık 50% B keskin bir tepe Zehir olacaktır. </li><li> % 15 SDS-PAGE jel üzerinde elüsyon kesirler çalıştırın ve bir spektrofotometre kullanılarak OD 260 / OD 280 oranı ölçülerek DNA kontaminasyonu kontrol edin. Jel sadece 19 kDa civarında bir grup göstermelidir, ve OD 260 / OD 280 0.7 civarında tipik olarak. Saf DPS kesirler havuzu. Bir ile bir santrifüj filtre ünitesi (örneğin Amicon Ultra Filtrasyon Ünitesi gibi) kullanın10K molekül ağırlığı kesme DPS konsantre ve depolama tampon (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCl) içine alışverişinde. -80 Depolama için sıvı nitrojen içinde kısım arıtıldı DPS ve dondurma ° C </li></ol> 2. DNA koruma deneyi Tahlil birden fazla zaman duyarlı adımdan oluşuyor ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ikinci zamanlı olmalıdır. Birçok maddeler ve pipetleme adımlar söz konusu, bir pipetleme tablo (Tablo 1) adım ve hacimleri takip etmek için tavsiye edilir böylece. Tahlil için gereken toplam süre en fazla 3 saat olduğunu. <ol><li> Hava geçirmez bir şişenin içine 30 ml su ölçün; çözüm oksijen kaldırmak için 10 dakika (iki şırınga iğneleri, sıvı bir, yukarıda birini kullanarak) için N 2 ile su yıkayın. 2 mM stok solüsyonu elde etmek için suya 0.0168 g FeSO 4 • 7H 2 O ekleyin. Flakon Seal ve karıştırın sonra, daha 5 dakika azot ile yıkayın. Çözüm olmalıdıraçık, sarı herhangi bir ipucu tespit ise, yeni bir demir solüsyon hazırlanır. </li><li> Buz üzerinde tutmak ve alüminyum folyo ile sararak ışıktan korumalı, H 2 O 2 çözeltisi (1 ml suya 9.2MH 2 O 2 10.87 ul) 100 mM olun. Spontan çürüme nedeniyle hazırlandıktan sonra yaklaşık 1-2 saat için kullanın. Hidrojen peroksit stok kısmen uygun depolama (karanlıkta, 4 ° C&#39;de) tarafından ıslah olabilir arıza, benzer tabidir. OD 240 ölçerek stok konsantrasyonu düzenli olarak kontrol tavsiye edilir. </li><li> Bir oda sıcaklığında su banyosunda hızla DPS saflaştırılmış bir kısım Çözülme ve buz üzerinde tutmak. Çökelti agrega için bir masa üstü picocentrifuge 4.000 x g&#39;de 10 saniye santrifüj. Bir spektrofotometre (OD 280 = 1.547 100 mcM monomer DPS bir konsantrasyon gösterir) kullanarak santrifüj sonra konsantrasyon ölçün. </li><li> 12x reaksiyon tamponu (1 kullanarak yüksek konsantrasyon stoktan lineer DNA sulandırmakNg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda 100 M MOPS-KOH pH 7.0, 1 M NaCI). Lineer DNA miktar kolaylaştırmak için kullanılır, ancak plazmid DNA sıra kullanılabilir. </li><li> Bir PCR tüpü içine DNA tampon karışımı pipetle 1 ul. Nihai reaksiyon hacmi (eksi SDS), 12 ul olacak, böylece, reaksiyon içine yeterince su ilave edilir. Bu miktar pipetleme tablosunu kullanarak önceden hesaplanmalıdır. 3 mcM son bir dodecamer konsantrasyonu DPS ekleyin. DPS DNA&#39;ya bağlamak için izin vermek için, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Istenen konsantrasyona ulaşmak için yeterli 2 mM FeSO 4 çözüm ekleyin. Tipik bir deneyde, 0, 1 mM FeSO 4 ile bir konsantrasyon aralığında kullanılmaktadır. Daha yüksek konsantrasyonlarda daha geniş bir DNA bozulmaya sebep olacak, ama aynı zamanda demir, reaksiyon karışımı içinde çökeltilerinin oluşmasına neden olabilir. Çabuk 100 mm H2O 2 çözeltisi (10 mM nihai konsantrasyona kadar) 1 ul ekleyin ve Fenton izin vermek için 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübeGerçekleşmesi-aracılı bozulması tepki. </li><li> % 20 SDS (sodyum dodesil sülfat), 0.8 ul ekleyin. Mix ve DPS-DNA kompleksleri bozmaya 5 dakika 85 ° C&#39;de inkübe edin. SDS DPS-DNA kompleksi destabilizes ve miktar kolaylığı artırır DNA, için istenmeyen jel vardiya önler. Isteğe bağlı bir adım toksik olmayan ürünler haline katalitik olarak kırıcı hidrojen peroksit ile reaksiyon durdurmaktır. Bu protokol açıklanan koşulları için, bu adımı DNA bozulması geniş bir aralığı elde etmek için gerekli değildir. </li><li> Boya yükleme ekleyin, 1 dakika buz üzerinde inkübe ve bir agaroz jel üzerinde yük. Jel çalıştırın ve etidyum bromür kullanarak DNA leke. Jel jel etidyum bromür dağılımı ile engellemesini önlemek için SDS, elektroforez sonrası lekeli yerine elektroforeze tabi tutulmadan önce olmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li>
<li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions%3A+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li>
<li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li>
<li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li>
<li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li>
<li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li>
<li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+Dps%2C+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li>
<li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li>
<li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li>
<li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li>
<li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+%28DNA-binding+protein+from+starved+cells%29%3A+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li>
<li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage%3A+x-ray+crystal+structure%2C+iron+binding%2C+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li>
<li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation%2C+detoxification%2C+and+DNA+protection+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li>
<li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopharmacology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li>
<li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radical+scavenging%2C+DNA+protection%2C+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins%3A+FurB+%28All2473%29+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li>
<li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li>
<li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+iron+determination+using+ferene+triazine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu makalede açıklanan DPS bir arınma süreci çok sağlamdır. Saflık sürekli (&gt;% 99) yüksek olmuştur; başka proteinler görünür bantları gibi SDS-PAGE jel görünür. DPS çok yüksek konsantrasyonları ile inkübe, kısmi DNA yıkımı ile kanıtlandığı gibi buna rağmen, saflaştırılmış DPS bazı gruplar, nükleaz aktivitesi var gibi görünmektedir. Bu, arıtma yoluyla kaldırmak koyamadık, düşük konsantrasyonda yüksek derecede aktif DNase&#39;lann varlığına işaret olabilir. Bununla birlikte, bu DNA yıkımı yalnızca tipik olarak in vi...

Aerobik organizmalar sürekli olarak DNA hem de diğer önemli biyolojik makromoleküllerin zarar verebilir reaktif oksijen türleri ile uğraşmak gerekir. Oksidatif hasar toksik etkilerini ortadan kaldırmak için bir güçlü bir araç hasret hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteindir. Hasret E. 1992 yılında keşfedilmesinden bu yana coli kültürü 1, DPS bakteri ve Archaebacteria 2 300&#39;den fazla türün tespit edilmiştir. Sabit faz sırasında DPS Massive upregülasyonu bu E. en çok ifade nükleoit-ilişkili protein yapar açlık koşulları 3, 4 altında coli. Buna ek olarak, DPS açlık, yüksek demir konsantrasyonu, UV ışığına maruz bırakma, ısı şoku ve oksidatif stres 5, 6 da dahil olmak üzere pek çok çeşitli stres sırasında bakteriyel canlılığı ve DNA bütünlüğünü korumak için de gösterilmiştir. 12 monomerlerin, w istikrarlı bir homo-oligomerik kompleksi içine Yapısal olarak, DPS kendini ortaklarıhich bir küresel içi boş kabuk içine monte. ~ 4.5 nm çapında iç boşluğu küçük moleküllerin 7 geçişine izin gözenekleri ile çözücü dış erişilebilir, ve demir 8 gibi mineralli metaller ayırmak olabilir. DPS koruyucu etkisi non-spesifik DNA bağlayıcı 1, ferroxidase aktivite, ve demir depolama 8 de onun çeşitli biyokimyasal faaliyetleri, türemiştir. DPS yararlı biyokimyasal faaliyetlerin ayrıntılı çalışma ilk olarak arıtma gerektirir. DPS sadece başka proteinler ayrı olarak, aynı zamanda herhangi bir bağlı DNA&#39;nın 7 olması gerektiği gibi DPS saflaştırma, karmaşık bir işlemdir. Optimize edilen saflaştırma işlemi, iki iyon değişim ve amonyum sülfat ile çöktürme kademesi oluşan, çok yaygın teknikleri kullanır. Son derece konsantre DPS düşük tuz koşullarında çözüm dışında hızlandırabilir gibi çeşitli tampon değişim, ihtiyaç vardır. Bir kez DPS saflaştırılmış protein edilmiştir, Bu doğrudan ferroxidase aktivitesi 8, DNA bağlayıcı stokiyometri 9 ve 10 demir bağlama mekanizmaları ölçmek deneyleri ile uygulanabilir. Saf DPS de diğer potansiyel uygulamalar vardır. DPS sabit içi boş küresel yapısı, proteinin boşluğu 11 içine hidrofobik parçacıkların depolamak için iskelesi olarak kullanılmış ve bir reaksiyon haznesi yeni bir manyetik nano partiküller 12 sentezlemek için bile. Reaktif oksijen türleri nedeniyle zarar arabuluculuk DPS bir koruyucu yeteneği açıkça olması ve doğrudan DNA koruma deneyi 13, 14 ile ispat edilebilir. Demir Fenton kimya ile H 2 O 2 bozulması katalize zaman in vitro prosedüründe bu, radikal türleri üretilmektedir. Bu radikaller doğrudan reaksiyon DNA mevcut zarar ve tamamen yüksek konsantrasyonlarda bu düşürebilir. İki anahtar DPS faaliyetleri doğrudan Fent etkilerini karşı olabilir hemon-aracılı radikal üretimi. DPS sürecinde mevcut hidrojen peroksit tüketen, mineralizasyon ile katalitik demir konsantrasyonunu düşürür. Ayrıca, DNA bağlayıcı DPS potansiyel radikal hasarına karşı fiziksel olarak korumak ve daha az reaktif yüzey alanına sahip daha küçük bir hacim içine yoğunlaştırır olabilir. Bu iki özellik kombinasyonu de koruyucu DPS aktivitesinin ölçülmesi amacıyla, uygun DNA koruma deneyi yapar. DNA koruma deneyi oldukça çok yönlü ve DPS karakterizasyonu ötesinde çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Radikal hasar hücrelerinde stres yaygın bir şeklidir, ve birçok farklı protein ve kimyasalların, önlemek için kullanılır. Radikal hasarı için bir belirteç olarak DNA bütünlüğü kullanılarak tahlil genel ilkesi, hemen hemen her türlü radikal üreten reaksiyon ya da mücadele maddesi ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Diğerleri arasında, tahlil, başarılı bir şekilde bir anti-oksidatif özelliklerini belirlemek için kullanılmıştırK. hidroksil zarar arabuluculuk 16 ürik asit etkilerini karakterize etmek ve Kürk transkripsiyonel regülatör proteinlerin 17 fonksiyonu yeni bakış açıları kazanmak için gıda sektöründe 15, kullanılmak üzere Paniculata özü. Yayınlanan gazetelerde testin çeşitli kullanımlarını rağmen, ilk kez birçok araştırmacı için gereksiz yere zahmetli bir süreç için tahlil kurma yapar, birçok optimizasyon ve sorun giderme adımları gerekli olduğunu bulundu. Bu makalede mevcut protokol giriş için bu engeli kaldırmayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS yetkin hücreler</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB et suyu tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl Seti III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sefaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Tuz Giderme Sütunları</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. Filtre (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Demir Sülfat heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>SDS çözeltisi</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Statik inkübatör</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama İnkübatörü </td><td>New Brunswick Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Hücre bozucu</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Temizleyici</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>Hava geçirmez şişeler</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga iğneleri</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

bir uygulama<em&gt; in vitro</emdps protein stres arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; dna koruma testi

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oksidatif stres aerobik yaşamın kaçınılmaz bir yan ürünü. Moleküler oksijen karasal metabolizması için gereklidir, ama aynı zamanda canlılar içinde birçok zararlı reaksiyonlar yer almaktadır. Yaşam için başka önemli bir bileşiktir aerobik metabolizma ve demir, kombinasyonu Fenton kimya ile radikaller üretmek ve hücresel bileşenleri azaltmak için yeterlidir. DNA tamiri çok önemsiz olduğu gibi DNA bozulması, belki hücre içi radikaller içeren en çok zarar veren bir süreçtir. Bu makalede sunulan tahlil radikal aracılı DNA hasar molekülleri ve enzimlerin etkisini ölçmek ve görselleştirmek için nicel bir teknik sunmaktadır. DNA koruma deneyi protein ya da kimyasal koruyucu özelliklerinin in vitro karakterizasyonu için, basit, hızlı ve güçlü bir araçtır. Bu zararlı oksidatif reaksiyona DNA açığa çıkar ve çeşitli bileşik konsantrasyonları eklemeyi içerir. Bileşik konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, DNA hasarının azaltılması veya artışa daha sonra jel elektroforezi kullanılarak görselleştirildi. Bu yazıda aç bırakılmış hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteinin koruyucu özelliklerini ölçerek, DNA koruma deneyi tekniğini göstermektedir. Dps güçlü çevresel stres ile mücadele için 300&#39;den fazla bakteri türleri tarafından kullanılan bir mini-ferritin olduğunu. Burada DPS arıtma protokolü ve DPS tarafından DNA koruma değerlendirmek için optimize edilmiş test koşulları sunuyoruz.

Burada açıklanan DPS için arıtma işlemi çok tekrarlanabilir. Tanımlanmış bir protokole göre DPS arıtma, E. 2 L kullanılarak bir başlangıç ​​noktası olarak coli kültür, genellikle 5 ila 12 mikron arası konsantrasyonlarda 12 DPS içeren proteinin 2.5 ml verecektir. Daha uzun indüksiyon kez (4 saat) Bu değişkenliği azaltmak gibi görünüyor. Protein saflığı SDS-PAGE jel (Şekil 1) ile kanıtlandığı gibi,% 99 üzerinde sürekli olarak. DNA kirlilik düzeyi olarak hem DNA ve OD 260<...

Hasret hücreler (DPS) gelen DNA-bağlayıcı protein bakteriyel stres mücadelede önemli bir rol oynar. Bu makalenin arıtma ele<em&gt; E. coli</em&gt; DPS ve için protokol<em&gt; In vitro</em&gt; Test reaktif oksijen türleri tarafından bozulması DNA DPS-aracılı koruma gösteren.

Bir uygulama<em&gt; In vitro</emDPS Protein Stres Arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; DNA Koruma Testi

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, DPS aktivitesi sonucunda radikal aracılı DNA hasarındaki azalmayı görselleştirerek, DPS proteininin koruyucu etkisini in vitro olarak analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle çeşitli iyon değişim kolonları ve amonyum sülfat çöktürme yöntemi kullanılarak DPS'nin e coli hücrelerinden saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, saflaştırılmış DPS DNA'ya eklenir; bu durum, proteinin spesifik olmayan DNA bağlanma özellikleri nedeniyle A-D-P-S-D-N-A kompleksinin oluşmasını sağlar. Ardından, Fenton kimyası aracılığıyla hidroksil radikalleri üretmek ve böylece DNA'ya hasar vermek amacıyla reaksiyona demir(II) ve hidrojen peroksit çözeltileri eklenir.Elde edilen sonuçlar, elektroforez sonrası agaroz jellerdeki hasarsız DNA bantlarının kantifikasyonuna dayanarak, DPS varlığı nedeniyle DNA hasarında azalma olduğunu göstermektedir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler reaktif hazırlama aşamasında zorluk yaşayacaktır. Bu durum, ferrik demir çökeleklerinin oluşumu veya hidrojen peroksitin kendiliğinden bozunması gibi istenmeyen yan reaksiyonlara yol açar.Bu yöntem, DPS'nin oksidatif streşe karşı koruyucu aktivitesi hakkında bilgi sağlasa da, diğer pro

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Bu iletişim kuralı plazmid DNA üzerinde tanımlanmış DNA-protein Glossar tamiri ölçmek için hedeftir. Lesioned plazmid alıcı memeli hücre satırları ve düşük molekül ağırlığı birden çok kez puan sonrası transfection hasat içine transfected. DNA onarım Kinetik sayısal qPCR tarafından takip strand özgü astar uzantısı kullanma.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Msh2 Msh6 DNA replikasyon hataları tamir başlatmak için sorumludur. İşte bu kritik protein nasıl çalıştığını anlamak yolunda geçici bir kinetiği yaklaşım sunuyoruz. Rapor durdu akış birleştiğinde DNA bağlayıcı ve eylem Msh2-Msh6 DNA onarım mekanizması altında yatan ATPaz kinetiği ölçmek için deneyler göstermektedir.

DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama

Öğrenin, E. coli'den Dps proteininin saflaştırılması ve DNA'yı oksidatif hasardan koruma yöntemini. Bu teknik, bakteri stres mekanizmalarını anlamak için güvenilir bir protokol sunar.

Bir uygulama

Daha fazla video keşfet