Name: Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Öğrenin fare pankreas asiner hücrelerini izole etme, kalsiyum görüntüleme ve hücre yaralanması ölçümü için kullanılan bu yöntemi. Adenoviral enfeksiyon ile hücre fonksiyonlarını manipüle edebilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık Hibe DK083327 ve DK093491 bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (SZH için) tarafından desteklenmiştir.

1. Kalsiyum Görüntüleme için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması <ol><li> 20 mM HEPES, 95 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 0.6 mM MgCl2, 1.3 mM CaCl2, 10 mM glükoz, 2 mM glutamin, 1 x ve en az Eagle ortamının esansiyel olmayan amino asitler ihtiva eden HEPES inkübasyon tamponu hazırlayın. NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın, nihai çözelti. </li><li> HEPES kuluçka tampon maddesi (yukarıda tarif edilmiştir), 25 ml BSA (% 1 w / v son) eklenerek bir BSA inkübasyon tamponu hazırlayın. </li><li> 1.1 mg / ml (/ 200 adet mi) tip-4 kolajenaz ve 1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile 6 BSA kuluçka tampon maddesi (yukarıda açıklandığı gibi) ml ilave edilerek bir kollajenaz sindirim tamponu hazırlayın. </li><li> İki parça HNO 3 ve 2 saat için, bir parça HCI daldırarak asitle yıkama 22x22 mm lamelleri. Daha sonra% 70 etanol içinde DI su ve mağaza ile süzün. </li><li> CO 2 boğulma bir fare Euthanize. Orient yatar pozisyonda hayvan ve cle ile karın yüzeyi hazırlamak% 70 etanol ile Aning. Karın boşluğuna ortaya çıkarmak için bir laparotomi gerçekleştirin. Pankreas inceleyin ve hemen kollajenaz sindirim tampon 6 ml içeren küçük bir tartmak tekne durulayın. </li><li> Yağ veya görünür kan damarlarının herhangi bir büyük parça parçalara ayır, sonra kollajenaz sindirim tampon 5 ml çıkarın ve 15 ml konik tüp geri ekleyin. </li><li> Ince diseksiyon makas kullanarak kollajenaz sindirim tampon 1 ml içeren küçük tartı tekne pankreas kıyma. Nihai çözelti, eşit şekilde dağılmış görünene kadar kıyma. </li><li> 125 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişeye plastik kıyılmış ürünü aktarın ve konteyner kollajenaz sindirimi tampon kalan 5 ml ilave edilir. Doku tamamen tampon altında olduğundan emin olun. </li><li> 37 ° C su banyosu içinde şişenin yerleştirin ve 30 dakika boyunca 90 rpm&#39;de karıştırın. Kesinti bu kısa dönemde, kalsiyum aktive agonistleri (örneğin Caerulein, karbakol) hazırlamak ve 22x22 mm asitle yıkanmış kapak durulamaDI su ile fişleri. Kuru ve daha sonra laboratuvar filmi ile kaplı düz bir yüzeyin üzerine yerleştirin. </li><li> 30 dakika özeti tamamlandıktan sonra, 15 ml konik tüp geri süspansiyonu transfer ve hücreler razı sağlar. Dikkatlice kollajenaz sindirim tampon dışarı pipetle ve BSA kuluçka tampon 6 ml ile değiştirin. Şiddetle küçük kümeler halinde hücreleri dağıtmak için 10 saniye boyunca elle tüp sallayın. Hemen sallayarak üzerine, huzursuz medyadan herhangi bir büyük, yüzen pislikleri temizleyin. </li><li> Kalan hücreler yerleşmek ve taze BSA kuluçka tamponu ile medya alışverişi için izin verin. </li><li> Süspansiyon çıplak gözle sadece ince görünür sadece küçük kümeleri oluşur kadar, iki kez 1.11 adımı tekrarlayın. Hücreler Şekil 1A (üst sıra) tasvir bu benzer. </li><li> BSA kuluçka tamponu çıkarın ve HEPES inkübasyon tamponu ile değiştirin. </li><li> 10% DMSO içinde bir 750 mcM, Fluo-04:00 arasında 100X stok hazırlayın. </li><li> Hücre süspansiyonu ve BSA içermeyen HEPES inkübasyon tamponu içeren 15 ml&#39;lik konik bir tüp içinde hücrelerin yerleştirin. Bunu yapmak için, hücre süspansiyonu için stok solüsyonu uygun bir hacmi (1:100 seyreltme) ekleyin. Her 22x22 mm lamel üzerine bu süspansiyon daha sonra plaka 500 ul. </li><li> Oda sıcaklığında karanlıkta lamelleri tutun. İlk Ca 2 + ölçümleri yükleme sonra 30 dakika sürer. Boya otomatik boya yükleme sonra 30 dakika gerçekleşmesi gereken perfüzyon, başlangıç ​​üzerine orta kaldırılır. </li></ol> 2. Pankreas Asiner Hücreler kalsiyum Ölçme <ol><li> DI suyla her perfüzyon kurulum yıkayın ve tampon ya da agonistinin uygun bir miktar ile doldurun. Doğru akışı sağlamak için tampon veya agonist ile Başbakan her şırınga. Bir halka şırınga kelepçe mikroskop sahne üzerinde yaklaşık 1-2 metre durmak. </li><li> Dikkatle kenarından bir lamel içeren hücre süspansiyonu kavramak için ince cımbız kullanın. Kapağın eğin45 ° kayma ve aşırı tampon kaçıp sağlar. Lamel üzerine hücreler ile kauçuk conta üstüne lamel yerleştirin ve bölme (Şekil 2A ve 2B) birleştirin. </li><li> Sahneye perfüzyon odasının Güvenli ve odası (Şekil 2C) ilk girişine tampon içeren boru takın. Tampon içeren şırınga açın ve tampon lamel tüm yüzey üzerinde serpmek sağlar. Tampon odasının karşı ucuna ulaştığında, sonra, vakum girişi ve bir vakum hattı yerleştirin. Odanın birlikte bunların uygun pozisyona başka bir boru (içeren agonist, inhibitörleri, vb) yerleştirin. </li><li> 488 nm (Şekil 1A, alt) bir dalga boyunda Fluo-04:00 boya heyecanlandırmak için ya bir 200X veya 400X, 1.4 sayısal açıklık objektif ve argon lazer kullanarak hücrelerin gözünüzde canlandırın. Lazer güç ayarlarını ayarlanmalıdır şekilde photomultiplier tüp (PMT) Yayılan ışık ile doymuş değil. Buna ek olarak, PMT üzerindeki gerilim maksimum ışık algılama için optimize edilmesi gerekmektedir. </li><li> &gt; 515 nm uzun geçiş emisyon sinyalleri 2-5 çerçeve hızlarda toplanır sn, hızlı küresel kalsiyum dalgaları (Şekil 3 ve 4) görselleştirmek için yavaş salınımlı desen ve 0.2-0.3 sn / kare görüntülenmesi için / çerçeve. </li><li> Görüntüleme tamamlandıktan sonra, şırınga kapatın ve tüm boru çıkarın. Odası ve adımları tekrarlayın 2.2-2.4 sökün. </li><li> Resim J zaman ve transfer içinde floresan sayısal değerleri (Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ücretsiz olarak sağlanan ve bulunabilir yazılım paketi olarak veri toplamak <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). </li><li> Gerçek zamanlı hücresel görüntüleri ve ilgi alanları (ROI, yani nükleer, bazolateral, apikal, vb) tespit </li><li> Bu ROI ve r için floresan yoğunlukları Edinmefloresan / temel floresan (yani F/F0) olarak epresent. </li><li> F / F 0 vs komplo ile iz oluşturmak zaman. Iz ek olarak, temsili görüntülerinin yaygın sağlanan ve Pseudocolor kullanılarak görüntülenir. </li></ol> 3. Hücre Sakatlık Tahliller için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması <ol><li> Sıcak DMEM F-12 ortamı (fenol kırmızısı olmadan) 37 ° C&#39;ye kadar </li><li> DMEM F-12 vasatı içinde, BSA (% 0.1 w / v son) ve HCI (50 uM nihai) ilave edilir. </li><li> Konik bir tüp içine kısım DMEM 50 mi. </li><li> Takviye edilmiş DMEM F-12 vasatı içinde, 10 ml kollajenaz tip IV 0.5 mg / mL (12 U / ml) ekleyerek, kolajenaz tamponu hazırlayın. </li><li> CO 2 boğulma bir fare Euthanize. Orient yatar pozisyonda hayvan, ve% 70 etanol ile temizleyerek karın yüzeyi hazırlar. Karın boşluğuna ortaya çıkarmak için bir laparotomi gerçekleştirin. Pankreas inceleyin ve hemen küçük bir tartı tekne c durulamakolajenaz tamponu 6 ml ontaining. </li><li> 3-5 dakika ya da çıkan çözelti eşit dağılmış görünene kadar ince diseksiyon makas kullanarak doku kıyma. </li><li> 5 dakika boyunca 90 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C su banyosu içine ilave kolajenaz tamponu ve ardından yerine 5 ml, 125 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişeye kıyılmış doku aktarın. </li><li> Shaker kaldırmak, hücreleri kısa bir süre yerleşmek için izin ve taze kollajenaz tampon 5 ml ile değişim. Daha sonra 90 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C su banyosu içinde, ek 35 dakika inkübe edilir. </li><li> Süspansiyon belirgin bir hücre kümeleri ile homojen görünene kadar şiddetle bir transfer pipet kullanarak sindirmek tekrar süspansiyon. Sonra yavaşça bir erlene önceden ıslak naylon örgü ile hücre süspansiyonu pipetle. </li><li> Kuvvetlice kalan hücreler aracılığıyla zorlamak için, örgü ile taze DMEM F-12 ortamı (kolajenaz ile birlikte) arasında ek bir 3 ml pipetle. </li><li> Başka bir 6-10 DMEM F-12 ortamı ilave edildi ve bir ekleme2-3 dakika razı hücreleri llow. Iki kez bu adımı yineleyin ve son yıkamadan sonra süpernatant kaldırmak. </li><li> 48-çukurlu bir doku kültür plakasının her bir oyuğuna taze DMEM F-12 vasatı içinde, hücreler tekrar süspansiyon ve hücre süspansiyonu plaka 500 ul ekleyin. Hücreler, Şekil 1B tasvir edilen benzer olmalıdır. </li><li> Plaka agonistleri eklemeden önce 5 dakika boyunca 90 rpm&#39;de 37 ° C su banyosunda oturup bekleyin. </li><li> 2-4 saat için agonistler değişen hücreleri uyarır. </li><li> Hücrelerin yerleşmek ve dikkatli bir şekilde bir medya kısım (genellikle 100 ul) ve sıvı azot içinde dondurularak üzerinden flaş pipetle izin vermek için bir açıyla plaka eğin. </li><li> Flaş kalan hücre süspansiyonu dondurma. Flaş dondurma LDH ölçümleri için gerekli değildir. Aynı gün tahlil ya da uzun süreli depolama için -20 ° C olarak kaydedilir ise bir alternatif örnekleri buz üzerinde tutulmalıdır gibi. </li></ol> 4. Laktat Dehidrogenaz Kaçak Ölçüm <ol><li&gt; Ölçü laktat dehidrogenaz (LDH) kaçak öncelikle Promega CytoTox 96 Sigara Radyoaktif Sitotoksisite Testi kiti (özel miyar ve malzemelerin Tablo bakınız) verilen reaktifler ve talimatları kullanarak. </li><li> Sulandırın LDH substrat (kitinde olduğu) analiz tamponu içinde 12 ml (aynı zamanda verilmiştir). </li><li> Oda sıcaklığında bir su banyosu içinde dondurulmuş hücre süspansiyonu ve ortam örnekleri çözülme. </li><li> 96 oyuklu bir plaka içindeki her bir ortam örneği Levha 50 ul. </li><li> Nihai konsantrasyonu 1x olur, böylece, hücre süspansiyonu için, 10X lizis tamponu gerekli hacim ekleyin. 60 dakika 37 ° C&#39;de vorteks kısaca ve inkübe. </li><li> Pelet hücre artıkları için 4 dakika 250 x g parçalanmış örnekleri santrifüj. </li><li> Hücre lizatları, bir 96 yuvalı plakanın her yuvası içine 1:10 seyreltme plaka 50 ul. </li><li> Her bir kuyucuğa sulandırılmış substrat 50 ul ekle, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li><li> Reaksiyonu durdurunher bir kuyunun elden çözüm (Set ile birlikte) 50 ul ekleyerek. </li><li> 490 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li><li> % LDH kaçak hesaplamak için aşağıdaki formülleri kullanın. Aşağıdaki optik yoğunlukları iyi içeren sadece PBS, yüzeyden boş bir OD okuma dışarı çıkarılarak düzeltilmiş ve stop çözüm vardır. </li></ol> Medya = LDH (Medya OD492) x (medya seyreltme faktörü) x (medya vol.) bu ortam örnekleri sulandırmak için genellikle gereksiz olduğu için *, seyreltme faktörü olacak en sık equal1. Toplam LDH = ((Lizat OD 490) x (lizat seyreltme faktörü) x (hücre süspansiyonu olarak vol.)) + ((Medya OD 490) x (seyreltme faktörü) x (örnekleme için aliquoted medya vol.)) <img alt="Denklem 1" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1.jpg" /> 5. Adenovirüs ile Pankreas Asiner hücreler bulaşmasını <ol><li> Hazırlamakpankreas asiner hücreler olarak Bölüm 3&#39;te açıklanan. </li><li> Adım 3.12 sonra, hücre süspansiyonu için adenovirüs 10 7 bulaşıcı birimi (IFUs) ekleyin ve 37 dakika boyunca 30 ° C&#39;de inkübe </li><li> 6 çukurlu bir plaka içinde hücre süspansiyonu eşit olarak plakası 2 mi. </li><li> En ifade yapıları için, hücreler yeterli 18 saat içinde enfekte olmalıdır ve sadece 6 saat içinde bazı lusiferaz yapıları, için. </li></ol>

<ol><li>Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+distribution+of+agonist-evoked+cytoplasmic+Ca2%2B+signals+in+exocrine+acinar+cells+analysed+by+digital+image+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy.</a> Embo J. 11, 1623-1629 (1992).</li>
<li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolar+and+submicromolar+Ca2%2B+spikes+regulating+distinct+cellular+functions+in+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells.</a> Embo J. 16, 242-251 (1997).</li>
<li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+mediates+early+zymogen+activation+in+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).</li>
<li>Raraty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+enzyme+activation+and+vacuole+formation+in+the+apical+granular+region+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).</li>
<li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+mitigates+caerulein-induced+pancreatitis+in+vivo+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).</li>
<li>Shah, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+Activation+during+in+vivo+Pancreatitis+is+Dependent+upon+Calcineurin+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).</li>
<li>Muili, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+and+genetic+inhibition+of+calcineurin+protects+against+carbachol-induced+pathologic+zymogen+activation+and+acinar+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li>
<li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+carbachol-induced+protease+activation+and+accelerates+Ca2%2B+waves+in+isolated+rat+pancreatic+acini%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini.</a> J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).</li>
<li>Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Ca2%2B+wave+propagation+in+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).</li>
<li>Reed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+extracellular+pH+induces+damage+in+the+pancreatic+acinar+cell+by+enhancing+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling.</a> J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).</li>
<li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li>
<li>Van Acker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+progression+locus-2+is+a+critical+regulator+of+pancreatic+and+lung+inflammation+during+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis.</a> J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).</li>
<li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+multiple+forms+of+Ca%282%2B%29+spikes+by+inositol+trisphosphate+in+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells.</a> J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).</li>
<li>Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+waves+require+sequential+activation+of+inositol+trisphosphate+receptors+and+ryanodine+receptors+in+pancreatic+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li>
<li>Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+calcium+entry+through+calcium+channels+in+olfactory+receptor+neurones+using+a+laser+scanning+microscope+and+the+calcium+indicator+dyes+Fluo-3+and+Fura-Red%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red.</a> Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).</li>
<li>Saluja, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretagogue-induced+digestive+enzyme+activation+and+cell+injury+in+rat+pancreatic+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).</li>
<li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors+contribute+to+bile+acid-induced+pathological+calcium+signaling+and+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li>
<li>Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholecystokinin+activates+pancreatic+calcineurin-NFAT+signaling+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan etti.

Hücre izolasyonu yöntemi ve sonraki deneyleri pankreas fizyolojik ve patofizyolojik özellikleri incelemek için hangi ile güçlü araçlar temsil burada tasvir. Dağınık pankreas asiner hücreleri izole etmek için yöntemi ilk kez 1972 11 Amsterdam ve Jamieson tarafından tanımlanmıştır. Burada sunulan yöntem Van Acker ve arkadaşları 12 tarafından tarif daha yeni izolasyon yöntemleri uyarlanmıştır. Bu tekniklerin son derece tekrarlanabilir ve kolay öğrenilen olmasına rağmen, tam olarak gerçekleştirilmelidi...

Sitozolik kalsiyum dinamik değişiklikler fizyolojik hem de patolojik asiner hücre olayları için gereklidir. Kalsiyumun bu farklı etkileri 1 sinyal kalsiyum farklı mekansal ve zamansal desen kaynaklandığı düşünülmektedir. Örneğin, asinar hücreden enzim ve sıvı salgılamadan yerine 2 alır apikal kutbunun bir kısıtlı bölge kalsiyum sivri bağlantılıdır. Buna karşılık, yoğun olmayan salınımlı kalsiyum sinyalleri tarafından izlenen bir küresel dalga kalsiyum akut pankreatit 3,4 yol patolojik erken olayları ile ilişkilidir. Bu içi asiner proteaz aktivasyonu, düşük enzim salgılanmasını ve asiner hücre hasarı içerir. Bizim laboratuvar in vivo ve in vitro 5-7 hem hastalığına yol bu erken patolojik olayları incelemek için izole pankreas acini kullanır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntemler cy ölçmek amacıyla birincil asiner hücrelerin izolasyonu tariftosolic kalsiyum düzeyleri ve hücre hasarı. Bu hücrelerin, adenoviral enfeksiyon için bir yöntem de sağlanmaktadır.

<table><tbody><tr><td></td><td>Fareler NCI</td><td>N/A</td><td>Erkek 20-30 gram; hemen hemen her suş karşılaştırılabilir sonuçlar vermelidir.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Fischer</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>J.T. Baker</td><td>1916-01</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>1X minimum Eagle'ın orta esansiyel olmayan amino asit karışımı</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>EM</td><td>SX0593</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu</td><td>Albümin Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Worthington</td><td>4188</td><td></td></tr><tr><td>Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit</td><td>Matheson Gazı</td><td>124-38-9</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Erlenmeyer plastik şişe</td><td>Crystalgen</td><td>26-0005</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon kiti</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td>LabChem</td><td>LC222102</td><td></u</td></tr><tr><td>>P1000, P100, P10 pipetleri</td><td>Gilson</td><td>FA10005P</td><td></td></tr><tr><td>Tartı teknesi</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS1420A</td><td></td></tr><tr><td>Plastik transfer pipetleri</td><td>USA Scientific</td><td>1020-2500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikro santrifüj tüpü</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>0.65 ml mikro santrifüj tüpü</td><td>VWR</td><td>20170-293</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cam lameller</td><td>Fisher</td><td>032811-9</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik Asit</td><td>Fischer</td><td>A483-212</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Fischer</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm lameller</td><td>Fischer</td><td>021510-9</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar filmi</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Luer kilidi</td><td>Becton Dickinson</td><td>932777</td><td></td></tr><tr><td>60 ml şırınga</td><td>BD Bioscience</td><td>DG567805</td><td></td></tr><tr><td>23 & # 190; ölçer iğnesi</td><td>BD Bioscience</td><td>9328270</td><td></td></tr><tr><td>PE50 boru</td><td>Kil Adam</td><td>PE50-427411</td><td></td></tr><tr><td>Düz başlı tornavida </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12, Fenol Kırmızısı yok</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>30.5 ölçer iğne</td><td>BD Bioscience</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 CC şırınga</td><td>BD Bioscience</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Erlenmeyer şişesi</td><td>Fischer</td><td>FB50025</td><td></td></tr><tr><td>Naylon örgü filtre </td><td>Nitex</td><td>03-150/38</td><td>150 um gözenek boyutu</td></tr><tr><td>48 kuyu doku kültürü plakası</td><td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu doku kültürü plakası </td><td>Costar</td><td>3795</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu doku kültürü plakası</td><td>Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td>Matheson Gazı</td><td>7727-37-9</td><td> </td></tr><tr><td>Sitotoksisite test kiti</td><td>Promega</td><td>G1782</td><td> </td></tr><tr><td>Adeno-GFP</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>J. Williams</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kelepçeli halka standı</td><td>United Scientific</td><td>SET462</td><td></td></tr><tr><td>Perifüzyon odası</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>S.Z.H ve Yale Üniversitesi'ndeki meslektaşları tarafından tasarlanmıştır</td></tr><tr><td>Vakum hattı</td><td>Manostat</td><td>72-100-000</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcılı</td> <td>su banyosuHassas Bilimsel</td><td>51220076</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 plaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>11-120-534</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü başlığı</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü İnkübatörü</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr></tbody></table>

kalsiyum görüntüleme amacı, hücre yaralanma Ölçümler ve adenoviral enfeksiyon için pankreas asiner hücreleri hazırlanması

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Pankreas asiner hücre ekzokrin pankreasın ana parankimal hücre ve pankreatik kanal içine pankreatik enzimlerin salgılanmasını birincil rol oynar. Ayrıca pankreatit başlatılması için bir sitedir. Burada bütün pankreas dokusu ve hücre içi kalsiyum sinyallerinden asiner hücreler izole nasıl tarif ölçülür. Buna ek olarak, in vitro olarak hücre hasarının neden asinar koşullarında, Adeno yapıları bu hücreleri transfekte etmek, ve daha sonra laktat dehidrojenaz, hücre hasarının işareti olan kaçak ölçme teknikleri tarif eder. Bu teknikler asiner hücre fizyolojisi ve patolojisi karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar.

Fizyolojik uyarıcıya tepki olarak hücre kalsiyum asinar ölçümlerinin bir örneği Şekil 3&#39;te verilmektedir. Acinar hücreleri kalsiyum ile yüklenen boya Fluo-4 ve asetilkolin analog karbakol (CCh, 1 uM) ile perfüze) 8. Hücreler, apikal bölgedeki başlatır ve bazolateral bölge 3,9 ile yayılan bir kalsiyum dalga şeklinde verdi. Şekil 3B gösterilen Temsilcisi iz yaygın olarak 1 mcM karbakol ile gözlenen tipik tepe-plato desen göstermektedir. Tersine, kolesistokinin an...

Biz fizyolojik ve patolojik ilgili uyaranlara ile asiner hücre kalsiyum sinyalleri ve hücresel hasarı incelemek amacıyla bir fare fare pankreas asiner hücre hazırlama tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücrelerin, adenoviral enfeksiyon için bir yöntem de sağlanmaktadır.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Bu prosedürün genel amacı,le sitozolik kalsiyum seviyelerini ve hücre hasarını ölçmek amacıyla primer hücreleri izole etmek ve enfekte etmektir. Bu işlem, öncelikle fare pankreas dokusunun izole edilmesi ve dokunun kollajenaz tamponu içerisinde kıyılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kıyılmış doku 37 °C'de kollajenaz tamponu içerisinde kısa süreliğine inkübe edilir.Ardından hücreler filtrelenir ve sonra kültür ortamında yeniden süspanse edilir. Son aşamada hücreler; hücre hasarı, kalsiyum ölçümleri veya adenoviral enfeksiyon için ekilir.Sonuç olarak; hücre toksisitesindeki değişiklikleri, kalsiyum seviyelerini ve adenoviral enfeksiyon verimliliğini belirlemek için sırasıyla LDH sızıntısı, hücre altı kalsiyum floresansı ve adenoviral floresans ölçümleri yapılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ASIN veya hücre sitotoksisitesini ve kalsiyum sinyallerini ölçmek için hassas bir yöntem sunmasıdır.Ayrıca, pankreas hücrelerinin adenovirüs ile güvenilir şekilde enfekte edilmesine olanak tanır. Bu tekniğin etkileri, akut pankreatit tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü bu yöntem, hastalığın patogenezinde kritik roller oynayabilecek potansiyel biyokimyasal yolakların hızlı ve kapsamlı bi

preparation-pancreatic-acinar-cells-for-purpose-calcium-imaging-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, pankreas adacık hücrelerinin küçük alt popülasyonlarındaki sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri incelemek için adacık hücrelerinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesi tekniği açıklanmaktadır. Minör hücre alt popülasyonları, belirli bir adacık hücresi popülasyonunda sitozolik kalsiyumda değişikliklere neden olan adrenalin ve ghrelin gibi işaretleyici bileşiklere fonksiyonel tepkiler kullanılarak tanımlanabilir. Bu, kan şekeri ile adacık salgısı çıktısı arasındaki...

Pankreas Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiklerini Görüntüleme: Pankreas Adacığındaki Sitozolik Kalsiyum Konsantrasyonundaki Gerçek Zamanlı Değişiklikleri İncelemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, çeşitli sindirim enzimleri içeren pankreas asiner hücrelerini (ekzokrin hücreler) izole etmek için kullanılan teknik açıklanmaktadır. Primer asiner hücreler, pankreas kanseri gelişiminde erken bir olay olan asinar-duktal metaplazinin (ADM) ex vivo çalışmasında faydalıdır.

Primer Acinar Hücre İzolasyonu: Acinar Hücreleri Fare Pankreasından İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, ex vivo 3D kültürde pankreas asiner hücrelerini duktal hücrelere ayırma tekniği açıklanmaktadır. Bu, pankreas kanserinin erken gelişiminde önemli bir süreç olan asinar-duktal metaplaziyi (ADM) düzenleyen mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olur.

Acinar-to-duktal Metaplazi İndüksiyonu: Acinar Hücreden Duktal Hücreye Farklılaşmayı 3D Ex Vivo Kültürde İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

İzole pankreas acininin in vivo morfolojisi ve etkinliğini muhafaza ve izleme ve salgılanmasını işlenmesi için güçlü yollar sunuyoruz. Bu çalışma acininin fare pankreasında izole edilebilir ve bunların salgı kapasiteleri ne değerlendirilebilir gösterilmiştir.

, Pankreatik acinar hücreleri ve salgı kapasitesinin değerlendirilmesi

Birincil acinar hücre izolasyon, protein ifade veya etkinlik modülasyon, kültür ve aşağı akış uygulamaları eski bol yararlı vivo çalışmada acinar-için-duktal metaplazi (ADM), pankreas kanseri gelişimi erken bir durumda.

Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Akut pankreas doku dilimlerinin hazırlanmasını ve konfokal lazer tarama mikroskobunda kullanımını, kalsiyum dinamiklerini aynı anda çok sayıda canlı hücrede, uzun zaman periyotlarında ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlükte incelemek için sunuyoruz.

Akut Fare Pankreas Doku Dilimlerinde Kalsiyum Dinamiğinin Konfokal Lazer Tarama Mikroskopisi

Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.

Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi

İntraperitoneal ilaç uygulaması, pankreas hasarını indüklemek için güvenli ve etkili bir non-invaziv yaklaşımdır. Bu çalışma, değişen derecelerde pankreas hasarını indüklemek için fareler üzerinde beş farklı intraperitoneal enjeksiyon protokolünü karşılaştırdı ve şiddetli akut pankreatit (SAP) için patolojik değişiklikleri ve tedavi stratejilerini araştırmak için bir ciddi pankreas hasarı modeli oluşturdu.

Semoreuin ve lipopolisakkarit intraperitoneal enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile şiddetli akut pankreatitin bir fare modelinin hazırlanması

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Öğrenin fare pankreas asiner hücrelerini izole etme, kalsiyum görüntüleme ve hücre yaralanması ölçümü için kullanılan bu yöntemi. Adenoviral enfeksiyon ile hücre fonksiyonlarını manipüle edebilirsiniz.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

Daha fazla video keşfet