Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, çeşitli doğal ortamlarda mikrobiyal hücre dışı enzim aktivitesini hızlı bir şekilde test etmektir. Bu, yeterli replikasyon elde etmek için mikroplakaya su veya toprak bulamaç numuneleri eklenerek elde edilir İkinci adım olarak, mikroplaka kuyucuklarına yapay kolometrik veya floro metrik substrat eklenir, bu da enzimatik reaksiyonların meydana gelmesine izin verir. Daha sonra, reaksiyon sırasında salınan son ürün miktarını belirlemek için absorbans veya floresan ölçülür.

Sonuçlar, son reaksiyonun absorbansına veya floresansına bağlı olarak numuneler arasındaki hücre dışı enzim aktivitesindeki farklılıkları göstermektedir. Bugün, doğal ortamlarda hücre dışı enzim aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bu yöntem, organik madde işlemenin su oranları ve topraklarda, çökeltilerde ve sularda besin mineralizasyonu gibi mikrobiyal ekolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir Genel olarak, bu yöntemi kullanmaya yeni başlayan kişiler, özellikle çok sayıda numuneyi test ederken, partikülleri reaksiyon çözeltisinden ayırmadaki zorluk nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Bu prosedürün görsel bir gösterimi çok önemlidir, çünkü bir plaka düzeninin öğrenilmesi zor olabilir ve birden fazla zaman adımında ölçüm yapmak bu prosedürü daha zor hale getirebilir. Topraklar ve çökeltiler için hücre dışı enzim aktivitesinin chole metrik analizi, toprak için metin protokolünde açıklandığı gibi substrat tamponu ve standart çözeltilerin hazırlanması ile başlar, steril bir 15 mililitrelik santrifüj tüpünde test edilecek her numunenin bir bulamacı hazırlayın. Çökeltiler için 50 milimolar asetat tamponu kullanarak mililitre başına yaklaşık bir gram konsantrasyon ekleyin.

Bulamacın kolayca borulanmasını sağlamak için yeterli asetat tamponu ekleyin. İhtiyaç duyulan bulamacın tam hacmi, test edilen enzim sayısına göre değişecektir, ancak en az beş mililitre önerilir. Tüm toprak veya tortu kümeleri dağılana kadar her bulamacı girdaplayın.

Ve son cildi not edin. Pipetlemeden önce pipet uçlarının ucunu makasla klipsleyin. Toprak bulamaçları uçları tıkama eğiliminde olduğundan, her bir bulamacı yeniden girdaplayın ve hemen altı kuyucuğun her birine 150 mikrolitre pipetleyin.

96 kuyu derinliğinde bir kuyu bloğunda. İyice ve sık sık girdap yapmak önemlidir. Toprak parçacıklarını süspansiyon halinde tutmak için, alt tabaka kontrolü olarak hizmet etmek üzere blok başına en az iki kuyuyu boş bırakın.

1 96 hazırlayın. Tahlil edilecek her enzim için iyi blok. Bir pipet haznesine yaklaşık beş mililitre asetat tamponu dökün ve her numunenin son iki kuyucuğuna 150 mikrolitre tampon eklemek için sekiz kanallı bir pipetleyici kullanın.

Numune tampon kontrolleri ve iki substrat kontrol kuyusu için. Yaklaşık 10 mililitre uygun p nitro rezene veya PNP substrat solüsyonunu bir pipet haznesine dökün ve her numunenin ilk dört kuyucuğuna ve iki substrat kontrol kuyusuna 150 mikrolitre substrat solüsyonu eklemek için sekiz kanallı bir pipetleyici kullanın. Substrat çözeltisi eklenir eklenmez reaksiyonun başladığı zamana dikkat edin.

Plakaları oda sıcaklığında 0,5 ila dört saat inkübe edin. Kesin inkübasyon süresi, numunelerdeki aktivite seviyesine ve test edilecek enzime bağlı olarak değişecektir. Tahliller inkübe edilirken, bir adet net 96 kuyulu mikroplaka hazırlayın.

Absorbans pipetini okumak için her derin kuyu bloğu için, mikroplakanın her bir oyuğuna 190 mikrolitre damıtılmış su ve 10 mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ekleyin. Sodyum hidroksit, enzimatik reaksiyonu yavaşlatır ve pH'ı yükseltir, bu da inkübasyondan sonra reaksiyon sırasında salınan PNP'nin rengini arttırır. 96 kuyu bloğunu 2000 ila 5.000 kez G'de beş dakika boyunca toprak parçacıklarını pelet haline getirin.

Peleti bozmadan sıvının çıkarılması zor olabilir. Başlangıçta çok fazla toprak örneği kullanmaktan kaçınılmalıdır. Yeterince uzun süre santrifüj ettiğinizden ve sıvıyı çekmek için dikkatli ama kendinden emin bir hareket kullandığınızdan emin olun.

Her birinden 100 mikrolitre çekmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Peletten kaçınmak için dikkatli olun. Sıvıyı, hazırlanmış şeffaf 96 kuyulu bir mikroplaka üzerindeki ilgili kuyucuğa aktarın, Mikroplaka okuyucuyu açın ve metin protokolünde açıklandığı gibi numunelerin kuru kütlesinin belirlenmesini takiben 410 nanometrede gerekli yazılım kayıt absorbansını ayarlayın, numune kontrol absorbansını numune tahlil absorbansından çıkararak her bir numunenin nihai absorbansını hesaplayın.

Alt tabaka kontrolleri 0,060'tan daha yüksek absorbansa sahipse, bunları çıkarın. Ayrıca, bu denklemi kullanarak kuru kütle gramı başına saatte mikromol cinsinden enzim aktivitesini hesaplamaya devam edin. Metin protokolünde gösterilen örneği izleyerek her enzim için siyah bir mikroplaka düzenledikten sonra, ilk su örneğinin yaklaşık beş mililitresini bir pipet haznesine dökün ve tüm kuyucuklara 200 mikrolitre pipetlemek için sekiz kanallı bir pipetleyici kullanın.

Mikroplakanın birinci sütununda, kullanılmış pipet uçlarını atın ve her su numunesinin bir ila dokuz arasındaki sütunları doldurması için gerektiği kadar tekrarlayın. Numunelerle aynı siyah mikroplaka üzerinde numuneleri, standartları, alt tabakayı ve su vermeyi hesaba katmak için kontroller ayarlayın. Numune kontrolleri, numune suyu ve bikarbonat tamponu içerir ve aktivite hesaplamalarında kullanılmaz, ancak deney boyunca okuma tutarlılığı gösterecektir.

Söndürme kontrolleri, numune suyu ve standart bir miktar floresan etiketinden oluşur ve floresansın kırınımını ölçmek için kullanılır. Numunede, su substratı ve standart kontroller, sırasıyla substrata bağlı veya standart floresan etiketinden ve bikarbonat tamponundan oluşur. Temiz bir pipet haznesine yaklaşık beş mililitre beş milimolar bikarbonat tampon dökün.

50 mikrolitre tamponu iki tane oluşturmak için d ve e sıralarında bir ila dokuz arasındaki mikroplaka kuyucuklarına pipetleyin, numune başına numune kontrol kuyularını çoğaltın, pipet uçlarını değiştirin, ardından 200 mikrolitre bikarbonat tamponunu A ve H sıralarındaki 10 ila 12 numaralı kuyucuklara aktarın. Floresan standardı ışığa duyarlı olduğundan, ışıklar kısılarak veya kapatılarak ortam aydınlatması azaltılmalıdır. Temiz bir pipet haznesine yaklaşık beş mililitre 10 mikromolar, dört metil mone veya MUB dökün, 50 mikrolitreyi H sırasındaki bir ila 12 mikroplaka kuyucuklarına pipetleyin. MUB'un ışık bozulmasını azaltmak için mikroplakayı karanlıkta yerleştirin veya opak bir kapakla örtün, florimetreyi açın ve alt tabakayı eklemeden önce okumaya hazır olacak şekilde gerekli yazılımları ayarlayın.

Temiz bir pipet haznesine uygun MUB kaplı alt tabakanın yaklaşık beş mililitresi için, 50 mikrolitreyi A satırında bir ila 12 arasındaki mikroplaka kuyucuklarına ve B ve C satırlarında bir ila dokuz arasındaki kuyucuklara pipetlemek için 12 kanallı bir pipetleyici kullanın, her numune için tahlilleri tekrarlayın ve üç alt tabaka kontrolü hemen floresan kaydetmeye devam edin. Okuduktan sonra mikroplakaya substrat eklendikten hemen sonra ilk floresansı okuyun. Floresan: Mikroplakayı oda sıcaklığında, karanlıkta veya opak bir kapakla kapalı olarak inkübe edin.

MUB'un ışık bozulmasını azaltmak için. Maksimum potansiyel enzim aktivitesini ölçmek için gereken inkübasyon süresi, bir numune içindeki enzim konsantrasyonuna bağlı olacaktır. Bu bilinmediğinden, numune test edilmeden önce, bir mikroplakanın birden çok kez adım adım okunması gerekecektir.

Çoğu enzim için, bir saat boyunca 10 ila 15 dakikalık aralıklar uygundur, ancak yüksek konsantrasyonlara sahip bazı numuneler 10 dakikadan önce zirveye ulaşacaktır. Mikroplakada floresan değeri belirlenen aralıklarla en az bir saat boyunca okumaya devam edin. Okumalar arasında mikroplakayı kapalı veya karanlıkta tuttuğunuzdan emin olun.

Her zaman aralığındaki her numune için, her zaman aralığı için ortalama ilk numune floresanını, ortalama son numune floresanını, ortalama standart floresansını ve ortalama söndürme kontrol floresansını hesaplayın. Enzim aktivitesini mililitre başına saatte m olarak hesaplayın. Metin protokolünde bulunan denklemi kullanarak.

Her bir zaman adımı için hesaplanan aktivite değerlerini inceleyin, en yüksek aktiviteye sahip zaman adımından nihai potansiyel aktiviteyi belirleyin. Etkinlik değerleri artmaya devam ederse, daha sonraki zaman adımları gerekebilir. Koşu boyunca aktivite değerleri düşerse, daha kısa zaman adımlarıyla tekrar koşun.

Topraklar ve sucul çökeltiler, parçacıkların yüzeyinde büyüyen bağlı mikrobiyal toplulukların bir sonucu olarak tipik olarak kayda değer seviyelerde hücre dışı enzim aktivitesine sahiptir. Bu şekil, kuzey Mississippi'deki üçüncü dereceden bir akarsuyun yüzey tortusundan elde edilen parçacıkların boyutuna bağlı olarak bu aktivitenin nasıl değiştiğini göstermektedir. USAA'nın önceki çalışması, bu akıştan gelen tortu parçacıkları üzerindeki bakteri topluluklarının, topluluk yapılarının moleküler analizine dayanarak üç ayrı gruba ayrılabileceğini göstermiştir.

0.063 milimetrelik parçacıklar üzerindekiler, 0.1, 2, 5, 0, 0.25 ve 0.5 milimetrelik parçacıklar üzerindekiler ve bir milimetrelik parçacıklar üzerindekiler. Hücre dışı enzim aktivitesindeki modellerin analizi, fosfatazın 0.1, 2, 5, 0, 0.25 ve 0.5 milimetre parçacıklarında benzer olduğu, ancak PNP'ye bağlı substrat tekniği kullanılarak ölçüldüğünde bir ve 0.063 milimetre fraksiyonlarda çok daha yüksek olduğu bu sonucu desteklemektedir. Beta glukko ve n AGA gibi diğer enzimler, en ince parçacıklarda benzer zirveler gösterir, ancak bir milimetrelik parçacıklarda yükselmezler.

Farklı enzimlerin farklı çevresel dağılımlar gösterebileceği ve bunların bu test kullanılarak açıklanabileceği gerçeğinin altını çiziyor. Nispeten düşük hata çubukları, çökeltiler üzerindeki enzim aktivitesinin chole metrik tahlillerinin tekrarlanabilir olduğunu ve bu nedenle istatistiksel analize uygun olduğunu göstermektedir. Farklı ve çevresel numuneleri karşılaştırırken, doğal sular, mililitre başına toprak veya tortuların gram başına yaptığından daha düşük hücre dışı enzim aktivitesine sahip olma eğilimindedir.

Bu nedenle, MUB bağlantılı substratlar kullanılarak flora metrik olarak test edilmelidirler. Bu şekil, enzimlerin, fosfatazın, beta, glukko ve NGA'ların aktivitesinin derinliğe göre nasıl değiştiğini göstermektedir. ABD'nin kuzey Mississippi'deki sığ bir gölde, gölün besin açısından fakir olduğu bilinmektedir, bu da mikroorganizmaların organik bileşiklerden fosfat elde etmek için ürettiği fosfataz ve enzimin nispeten yüksek aktivitesi ile önerilmektedir.

Enzimlerin üçü için de, su yüzeyinde ve 50 santimetre derinlikte toplanan tahlil örnekleri benzer aktivite gösterdi. 100 santimetrelik numunede aktivite yükselirken, numune esas olarak su tortu arayüzünden alınmıştır ve numunedeki tortu parçacıklarının varlığı, özellikle beta glukko ve n AGA'lar için numunede görülen daha yüksek aktiviteyi açıklamaktadır. PNP substratlarında olduğu gibi, düşük hata çubukları, sadece üç tekrar okumasıyla bile, MUB substratları kullanılarak floro metrik tahlillerinin tekrarlanabilirliğinin yüksek olduğunu göstermektedir.

Su numunesi enzim aktivitesi için birimlerin, tüketilen substratın inal olduğunu, tortu parçacıkları üzerindeki enzim aktivitesi için olanların, birim başına boyut karşılaştırılabilir olmasına rağmen tüketilen substratın mikromolleri cinsinden olduğunu unutmayın. Bu, toprakların ve çökeltilerin doğal sulardan çok daha yüksek hücre dışı aktiviteye sahip olma eğiliminde olduğu gerçeğini vurgulamaktadır. Ayrıca, MUB bağlantılı substrat tekniğinin artan hassasiyetini ve bu tekniğin, bir kez ustalaştıktan sonra su örneklerinde hücre dışı enzim aktivitesini test etmek için kullanılmasının gerekliliğini göstermektedir.

Bu teknik, topraklar ve çökeltiler için bu prosedürü denerken, bir saatten biraz fazla bir sürede dokuz su örneğini enzimlere kadar test etmek için kullanılabilir. Aktivitenin kuru ağırlık bazında ifade edilebilmesi için bilinen büyük bir malzeme kullanmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, renk metriği veya daha düşük metrik teknikler kullanılarak hücre dışı enzim aktivitesinin ve çeşitli doğal ortamların nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.