Name: Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Öğrenin mikropların ekstraselüler enzim aktivitesini yüksek verimli mikroplate yöntemiyle su, toprak ve tortu örneklerinde hızlıca ölçmeyi. Bu yöntem mikrobiyal ekoloji araştırmalarında besin mineralizasyonunu anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu işin yönleri için finansman Tarım Amerika Birleşik Devletleri Bölümü Özel Kooperatif Anlaşması 58-6408-1-595 ve Ulusal Bilim Vakfı (ödül 1.049.911) dahil olmak üzere çeşitli kaynaklar tarafından sağlandı.

Topraklar ve tortulları Ektraselüler Enzim Aktivitesi kolorimetik Analizi 1.. Enzim Aktivitesi Colorimetric Analizleri İçin Yüzey ve Tampon Çözümleri hazırlanması <ol><li> 50 ml 0.1 M asetik asit (2.87 ml su içinde 500 ml buzlu asetik asit) karıştırılarak 50 mM asetat tampon (pH 5,0-5,5) hazırlanması 150 ml 0.1 M sodyum asetat ve 200 ml damıtık H2O Gerekirse 0.1 M asetik asit ile 5,0-5,5 &#39;ye ayarlayın. </li><li> Damıtık H2O içinde 1 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi hazırlayın </li><li> 50 mM asetat tamponu içinde p NP-bağlanmış alt tabaka çözelti hazırlayın. Fosfataz, 50 mM asetat tamponu içinde 5 mM p NP-fosfat hazırlanması test etmek için, β-glukosidaz 5 mM p NP-β-glukopiranosid hazırlamak tahlil için Nagase 2 mM PNP-β-N-asetilglukosaminid hazırlamak için tahlil. Steril 15 ml veya 50 ml santrifüj tüplerine tüm alt-tabaka solüsyonları hazırlayın. Solutions 2-3 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. P NP Konsantrasyon Absorbans dönüştürme bir Standardının Belirlenmesi <ol><li> 50 mM asetat tamponu içerisinde p-nitrofenol standart çözeltiler hazırlayın. Konsantrasyonlar mM 0,025-1 arasında olmalıdır. </li><li> Açık bir 96 çukurlu mikrolevhanın her transfer konsantrasyonunun 100 ul üç çoğaltır. Her bir oyuğa, H 2 O damıtılmış 10 ul 1 M NaOH ve 190 ul ekleyin. </li><li> Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 410 nm&#39;de absorbansı. </li><li> 0.3 ile standart eğri Çarp konsantrasyonları 300 ul reaksiyon hacmi başına umol p NP olsun. P NP umol emmeye karşı bir eğri çizilir. Eğrinin eğimi her bir Enzim reaksiyonu p NP umol absorbans ilgili olacaktır dönüşüm faktörü (C) olarak hizmet vermektedir. </li></ol> 3. Enzim Testi yürütmek <ol><li> Toprak, bir concentr bir steril 15 ml santrifüj tüpüne test edilecek her numunenin bir bulamaç hazırlamakyaklaşık olarak 1 g / ml -1 50 mM asetat tamponu kullanarak ation. Sediment için, bulamaç kolayca pipettable yapmak için yeterli asetat tamponu ilave edin. Gerekli bulamacın tam hacmi, enzimlerin tahlil sayısına göre değişir, fakat 5 ml &#39;lik bir minimum tavsiye edilir. Vortex toprak veya tortu her kümeleri dağılana ve nihai hacim dikkat kadar, her bulamaç. </li><li> Yeniden girdap her bulamaç ve hemen, 96-çukurlu derin kuyu blok (Şekil 1) üzerine, altı kuyu her birine 150 ul pipetle. Bu süspansiyon içinde kir partikülleri tutmak için iyice ve sık sık girdap önemlidir. Bir alt-tabaka bir kontrol olarak hizmet etmek için boş blok başına en az iki kuyu bırakın. Not: Toprak çamurlar ipuçları tıkama eğilimi olarak önce pipetle için makas ile pipet ipuçları ucunu klibi. Denenecek her bir enzim için, bir 96-yuvalı blok hazırlayın. </li><li> Bir pipet rezervuar içine asetat tamponu, yaklaşık 5 ml dökün ve l için 150 ul tampon eklemek için bir 8 kanallı pipet kullanınast Her numunenin iki kuyu (bu örnek tamponu kontroller olacaktır) ve iki alt-tabaka kontrol havuzlarını (Şekil 1) </li><li> Bir pipet rezervuara uygun p NP-alt-tabaka çözeltisi, yaklaşık 10 ml dökün ve (Şekil 1) her bir numune ilk dört kuyu ve iki alt-tabaka kontrol kuyuları için alt-tabaka çözeltisi 150 ul eklemek için bir 8 kanallı pipet kullanın. Reaksiyon kısa zamanda substrat çözeltisi ilave edilir olarak başlar olarak zaman unutmayın. </li><li> 0.5-4 saat boyunca oda sıcaklığında (22 ° C) inkübe edin. Tam Kuluçka süresi aktivitesi örneklerde seviyesi ve analiz edilecek enzim bağlı olarak değişir. Nagase ve diğer enzimler&gt; 2 saat inkübasyon süresi gerektirir, oysa en toprak ve tortular için, fosfataz ve β-glukosidaz, 0.5-1.5 saat arasında bir bekleme süresi gerektirir. </li><li> Deneyleri absorbansı okumak için mikroplakalarda net 96-iyi hazırlamak kuluçka iken. (Örneğin, her bir E için her bir blok için bir derin bölmeli mikroplaka hazırlanmasınzyme) deneye tabi tutuldu. Pipet 10 ul 1 M NaOH ile mikrolevhanın her oyuğuna damıtılmış su 190 ul. Not: NaOH enzimatik reaksiyonu yavaşlatır ve reaksiyon sırasında ortaya çıkan p NP rengini artırır pH yükseltir. </li><li> İnkübasyondan sonra, kir partikülleri peletleştirmek için 5 dakika boyunca 2,000-5,000 xg&#39;de 96 oyuklu blok santrifüj. </li><li> Pelet önlemek için dikkatli olmak, her bir kuyunun 100 ul çekilme için bir çok kanallı pipet kullanın, ve hazırlanan açık 96-kuyu mikrolevhadaki iyi gelen transfer. </li><li> Mikrotabak okuyucu açın ve gerekli yazılımları kurmak. 410 nm&#39;de absorbansı. Belirli bir oyuk absorbansı, plaka okuyucusu doğrusal saptama sınırının üzerinde, su ve yeniden ölçüyle ki kuyu 1:01 seyreltin edin. Absorbans hala çok yüksek ise, deney daha kısa bir kuluçka süresi ile tekrar edilmelidir. </li></ol> 4. Numune kuru kütlesinin belirlenmesi <ol><li> Her sampl pipetle 1 ml<html> önceden tartılmış bir alüminyum tava içine e bulamaç. </li><li> 48 saat için bir 75 ° C kurutma fırınında kurutulur ve tartılır. Bulamacın 1 ml toprak ve tortu kuru kütlesi elde etmek için bu değerden tencerenin ağırlığını çıkarın. Enzim deneyinde de her bir göze ilave 150 ul numune kuru kütlesi belirlemek için 0.15 &#39;lik bir faktör ile çarpın. </li></ol> 5. Kuru Toprak Kitle veya Sedimentin başına Enzim Aktivitesi hesaplama <ol><li> Numune deney emiliminden numune kontrol absorbansı çıkartılmasıyla her numunenin absorbansı son hesaplayın. Alt-tabaka kontrol yüksek absorbans varsa (yaklaşık&gt; 0.060), daha sonra da bu çıkarın. </li><li> Umol hr -1 g kuru kütle -1 denklemden enzim aktivitesi hesaplayın: </li></ol> Enzim aktivitesi, son emme / (C x inkübasyon süresi x numune kuru kütle) Doğal Sularda Ektraselüler Enzim Aktivitesi Floresan Analizi Enzim Aktivitesi Florimetrik Analizleri için tle &quot;&gt; 1. Yüzey, Standard Hazırlama ve Tampon Çözümleri <ol><li> Steril ve fizyolojik olarak uygun bir alt-tabakanın eritilerek MUB bağlanmış alt-tabakalar (örneğin, 4-MUB-β-glukopiranosid, 4-MUB-fosfat, 4-MUB-N-asetil-β-D-glükozaminit) 200 uM solüsyonları hazırlayın (otoklav) damıtılmış steril 15 ml veya 50 ml santrifüj tüplerine H2O. Işık dahil değildir ve kullanım öncesinde buzdolabı içinde depolamak için bir alüminyum folyo içinde tüpler sarın. Bu şekilde depolandığında Elyaf en azından 1 hafta için kararlı olmalıdır. </li><li> Steril damıtılmış H2O içinde 100 uM 4-metilumbelliferon &#39;lik bir stok solüsyonu yaparak MUB standardı hazırlayın Mağaza kehribar veya folyo sarılı şişede buzdolabında. Kullanılmadan hemen önce, enzim tahlilleri için 10 uM çalışan bir solüsyonun hazırlanması için steril, H2O içine 1/10 ile 100 uM stok solüsyonu seyreltik. </li><li> NaHCO &lt;8.4 g çözülerek 100 mM bikarbonat tamponu içinde bir stok çözelti hazırlayınsub&gt; 3 1 LH 2 O ve otoklav içine. Enzim deneyleri için 5 mM bir çalışma çözeltisi oluşturmak için gerekli gibi steril H2O içine bu stok solüsyonu 1/20 seyreltin. </li></ol> 2. 96-Well siyah bir mikroplakanın ilgili düzenleme Su Örnekleri <ol><li> Şekil 2&#39;de gösterilen örnekte, aşağıdaki her bir enzim için bir mikrotabla düzenleyin. Yeterli çoğaltma, standartlar ve kontrol sağlayan, bu işlem, bir 96 oyuklu siyah bir mikroplakanın üzerinde dokuz su örnekleri için, tek bir enzimin aktivitesini tahlil unutmayın. </li><li> Bir pipet rezervuar içine ilk numunenin yaklaşık olarak 5 ml dökün ve mikro-(ler) in ve sütun 1 içindeki bütün gözlere içine ul pipette200 için bir 8 kanallı pipet kullanın. Kullanılmış pipet ipuçları atın ve sütunları 1-9 doldurmak için her su numunesi için gerektiği gibi tekrarlayın. </li></ol> 3. Örnek kurma, Standart, Söndürme ve Yüzey Kontrolleri <ol><li> Standart numuneler, hesaba kontrolleri ayarlayıns, alt-tabaka ve numuneler ile aynı siyah bir mikroplakanın (Şekil 2) üzerinde su verme. </li><li> Örnek kontrol numunesi, su ve bikarbonat tampon içeren ve aktivite hesaplamalarda kullanılan değil, deney süresi boyunca tutarlılık okuma gösterecektir. Söndürme kontrol numunesi, su ve floresan etiket standart bir miktarı oluşur ve numune su içinde floresans kırınım ölçmek için kullanılır. Alt-tabaka ve alt-tabaka, standart kontrol-bağlanmış ya da standart floresan etiket, sırasıyla, ve bikarbonat ya da tampon maddesi oluşur. </li><li> Temiz bir pipet rezervuar içine 5 mM bikarbonat tamponu içinde yaklaşık olarak 5 ml dökün. Pipet mikro kuyulara tampon maddesi 50 ul 1 satırlar 9 arasındaki D ve E, iki örnek başına numune kontrol kuyuları çoğaltmak oluştururlar. Değişim pipet uçları o satırlar 10 ile 12 kuyu bikarbonat tampon 200 ul transfer A ve H. </li><li> Li karartma veya kapatarak ortam ışıklarını azaltınFloresan standart olarak ghts ışığa karşı hassastır. </li><li> Temiz bir pipet rezervuara 10 uM 4-metilumbelliferon yaklaşık olarak 5 ml dökün. Pipet mikro kuyulara 50 ul Row H 1 ile 12 arasındaki ve kuyulara satırlar G ve F olarak 1 ile 9 arasındaki bir örnek için söndürme kontrol ve genel olarak standart üç kontrol çoğaltır oluştururlar. Karanlıkta mikroplağı koymayın veya Mub ışık bozulmasını azaltmak için opak kapak ile kapatın ya. </li><li> Florometrede açın ve set-up tabakayı eklemeden önce okumaya hazır olması için gerekli yazılımları. Not: Bazı florimetre ampuller 3 dakika veya daha fazla bir ısınma süresi gerekebilir. </li><li> Temiz bir pipet rezervuarına uygun MUB bağlanmış alt-tabaka (örneğin, 4-MUB-fosfat) yaklaşık 5 ml dökün. Her numune için üç suret tahlilleri alt-tabaka ve üç kontrol oluşturmak üzere 1 satırlar B ve C, 1 ile 9 Sıra A 12 ile mikro kuyulara 50 ul pipet ve kuyu içine bir 12 kanallı bir pipet kullanın. Immediately 4.1, kayıt floresan adıma geçin. </li></ol> 4. Kayıt Floresan <ol><li> Hemen mikroplakaya ilave edilmesinden sonra alt-tabaka ilk floresans okunur. Floresan okuduktan sonra, ya oda sıcaklığında (22 ° C) de inkübe mikroplak koyu veya MUB ışık bozulmasını azaltmak için bir opak bir kapak ile kapatıldı. </li><li> Bir su numune içinde maksimum potansiyel enzim aktivitesini ölçmek için gerekli olan kuluçka süresi numune içindeki enzim konsantrasyonuna bağlı olacaktır. Tahlil tamamlanmadan önce bu bilinmeyen olduğu için, mikro birden fazla zaman adım okunmak üzere olacaktır. Belirli enzimler için çok yüksek bir aktiviteye sahip numuneler, 10 dakika önce, tepe olsa da tipik olarak, 1 saat boyunca 10-15 dakika aralıklarla okuma, birçok enzim için kabul edilebilir. </li><li> En az 1 saat süre ile belirlenen aralıklarla mikrotablada floresan okuma. Mikrolevha kapalı tutmak için emin veya okuma arasındaki karanlıkta oluns. </li></ol> 5. Su hacmi başına Enzim Aktivitesi hesaplama <ol><li> Ilk numune floresan (kuyu D ve E), ortalama ortalama son numune floresan (kuyular AC), ortalama standart floresan (kuyu H10-11), ve ortalama kontrol floresan söndürülmesi (kuyu: Her bir zaman aralığı her bir numune için hesaplanır FG). </li><li> Her bir zaman aralığı için, nmol saat enzim aktivitesinin hesaplanması -1 mi -1 denklemle: </li></ol> Enzim aktivite = (örnek floresan demek - ilk örnek floresan ortalama) / (() hr zaman (x) 0.2 ml (standart floresan) x ortalama / kontrol floresan gidermek ortalama (standart floresan / 0.5 mol) x ortalama) <ol start="3"><li> Her zaman adımı için hesaplanan etkinlik değerleri inceleyin. En yüksek etkinliği olan zaman aşama son potansiyel aktiviteyi belirlemek. Etkinlik değerleri artmaya devam ederse daha sonra zaman adımları gerekli olabilir; aktivite değerleri Throug düşersemhout çalıştırmak tabii ki, o kısa zaman adımlarla yeniden çalıştırın. Final aktivite tabaka tüketilen saat -1 -1 ml nmol&#39;ü olduğunu ancak saat -1 L -1 umol olarak ifade kadar ölçeklendirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+microbial+cellulose+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed%3A+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li>
<li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+organic+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+agronomy%22%5BJournal%5D)">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production%3A+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li>
<li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li>
<li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+quantification+and+characterization+of+%CE%B2-glucosaminidase+activity+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li>
<li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+heavy+metal+concentrations%2C+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li>
<li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands%22%5BJournal%5D)">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li>
<li>Hoppe, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water%3A+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+ecology+progress+series%22%5BJournal%5D)">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li>
<li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li>
<li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+soil%22%5BJournal%5D)">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+oceanography%22%5BJournal%5D)">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li>
<li>Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li>
<li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li>
<li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+freshwater+ecology%22%5BJournal%5D)">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+letters%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li>
<li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+biology%22%5BJournal%5D)">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+north+american+benthological+society%22%5BJournal%5D)">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li>
<li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li>
<li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li>
<li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Toprak ve tortular mikrobiyal hücre dışı enzimlerin çeşitli aktivitesini belirlemede besin mineralizasyon ve organik madde işleme 17 oranlarında yararlı açılımlar sağlayabilir. Ancak, toprak kendi nem düzeyleri değişebilir, bu nedenle toprak kuru ağırlık aktivitesi standart önemlidir. Bu sadece enzim aktivitesinin ölçülmesi dışında (tipik haliyle iki gün) ek bir kuruma adımı gerektirir. Bu nedenle, ani sonuçlar yakın sağlamak su örneklerdeki enzim aktivitesi deneyleri aksine, toprak ve sedimanlarda enzim akti...

Bakteri ve mantar gibi mikroorganizmaların hücre dışı enzimlerin üretimi ile kompleks organik bileşiklerin besin ve karbon elde edilir. Bu enzimler, tipik olarak hücre içine alınabilir daha küçük alt-birimler halinde polimerler hidrolize. Bu nedenle, ekolojik bir seviyede, bu mikrobiyal hücre dışı enzimler besin mineralizasyonu ve doğal ortamlarında olarak ortaya çıkan organik madde ayrışımı daha sorumludur. Bu tür sellobiyohidrolaz (CBH) ve β-glukosidaz gibi enzimler mikrobiyal alımı ve asimilasyonu için kullanılabilen bir karbon taban malzeme oluşturur 1,2 Selülozun glukoza hidroliz, katalize etmek için uyum içinde selüloz bozulması ve çalışmaları için önemlidir. Enzim fosfataz organofosfatlar çözünür inorganik fosfat gruplarını, esas olarak fosfat mineralleştirici ve en çok 3 organizmalar ile kullanım için uygun hale serbest bırakır. Örneğin N-acetylglucosaminidase (Nagase) gibi diğer enzimler, importan vardırkitin bozulması t karbon ve mikrobiyal edinimi 4 için kullanılabilir hem de azot yapabilirsiniz. Doğal ortamlarında mikrobiyal hücre dışı enzim etkinliğinin test edilmesi için prosedürlerin bir yapay p-nitrofenil (p NP) bağlanmış alt-tabakalar, orjinal toprak fosfataz aktivitesi 5 tespit etmek için geliştirilmiş bir yaklaşım kullanılmasıdır. Bu yaklaşım yapay alt-tabaka, uygun bir enzim ile hidrolize edildiğinde serbest renkli bir son ürün, p-nitrofenol, tespit dayanır. P-nitrofenol, daha sonra yaklaşık 400-410 nm&#39;de absorbans ölçümü ile kolorimetrik tayin edilebilir. Bu yöntem, bu yana böyle Nagase 6 gibi diğer enzimleri tespit etmek için uygulanmıştır ve toprak ve sediment 7-9 mikrobik hücre dışı enzim aktivitesi şu an çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Orjinal oldu alternatif bir yaklaşımy 10,11 4-metilumbelliferon (MUB) bağlanmış alt-tabakaların kullanan su ortamlarında hücre dışı glukosidaz aktivitesini değerlendirmek için geliştirilmiştir. (4-metilumbelliferon) serbest son ürün yüksek floresan ve 360/460 nm civarında bir uyarım / emisyon ayarına sahip bir flüorometre kullanılarak tespit edilebilir. MUB bağlanmış yapay alt-tabakalar arasında çeşitli p NP-kolorimetrik alt-tabaka prosedürü kullanılarak analiz edilebilir olarak en az bir çok enzim (örneğin, β-glukosidaz, selobiyohidrolaz, Nagase, fosfataz) aktivitesinin fluorometrik ölçümü olanak mevcuttur. Örneğin protein-bozucu lösin aminopeptidaz gibi diğer mikrobik hücre dışı enzimler, 7-amino-4-metilkumarin (COU) bağlanmış alt-tabakalar kullanılarak florometrik olarak analiz edilebilir. MUB-ve çiftler bağlanmış alt tabakalar hem de çeşitli karasal ve su örnekler 12,13 enzim aktivitesini belirlemek için kullanılmıştır. Önceki çalışmalar descri varkenIBED florometrik ya da kolorimetrik mikro hücre dışı enzim aktivitesi 14 belirlemek için yaklaşımlar, bu tür testleri yapmak için nasıl açık bir bakış açısı için bir ihtiyaç vardır. Burada kolorimetrik p NP-bağlanmış alt-tabakalar yaklaşım kullanılarak topraklar ve sediment ve floresan MUB-bağlanmış alt-tabakalar tekniği kullanılarak, doğal sularda, hücre dışı enzim aktivitesinin analizi için yüksek verimli mikro teknikleri yapılması için işlemleri göstermektedir. Bu enzimler, sırasıyla, karbon, azot, fosfor ve bisiklet bağlı olabilir olarak biz β-glukosidaz, Nagase ve fosfataz etkinliklerinin ölçümü odaklanır. Bununla birlikte, burada açıklanan usuller farklı yapay substratlar kullanılarak diğer hücre dışı enzimler ölçümüne uygulanabilir.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><güçlü>REAKTİFLER VE MALZEMELER</strong</td></tr><tr><td>>Buzlu asetik asit</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr><tr><td>p-Nitrofenol</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>p-Nitrofenil (pNP)-fosfat</td><td>Sigma</td><td>N3234</td><td>pNP-substrat</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-glukopiranosid</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-asetilglukozaminide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>p NP-substrat</td></tr><tr><td>Şeffaf 96 oyuklu mikroplakalar</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>96 kuyulu derin kuyu blokları</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>Alternatifler mevcuttur</td></tr><tr><td>Alüminyum tartım tavaları</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr><tr><td>Steril 15 ml santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr><tr><td>Steril 50 ml santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr>: <tr><td>4-Metilumbelliferon</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr>, <tr><td>4-Metilumbelliferil (MUB)-fosfat</td>, <td>Sigma</td><td>M8883</td>, <td>MUB-substrat,</td></tr><tr><td>4-MUB-glukopiranosid</td>, <td>Sigma</td><td>M3633</td>, <td>MUB-substrat</td></tr><tr><td>, 4-MUB-N-asetilglukozaminid</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>MUB-substrat</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr><tr><td>Siyah 96 kuyulu mikroplaka</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>Pipet haznesi</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</strong</td></tr><tr><td>>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj rotoru</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>Mikroplakalar/derin kuyu blokları için</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Alternatif alternatifler mevcuttur</td></tr><tr><td>Mikroplaka florometre</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>Alternatif olarak mevcuttur</td></tr><tr><td>8 kanallı pipetleyici</td><td></td><td></td><td>Çeşitli tedarikçiler</td></tr></tbody></table>

yüksek verimli mikroplate tahliller kullanarak waters, topraklar ve tortulları mikrobiyal ekstrasellüler enzim aktivitesi belirlenmesi

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Doğal ortamlarında besin döngüsü ve karbon işleme çok mikroorganizmaların serbest hücre dışı enzimlerin aktivitesi ile gerçekleşir. Bu nedenle, bu hücre dışı enzimlerin aktivitesinin ölçülmesi gibi organik madde ayrışma ya da azot ve fosfor gibi mineralizasyon ekosistem seviyesi süreçlerin oranları içine bakış açısı verebilir. Çevresel numunelerde hücre dışı enzim aktivitesi deneyleri, genellikle, yapay kolorimetrik veya florometrik substratlara örnekleri maruz bırakılması ve substrat hidroliz hızı izleme içerir. Burada kısa bir süre içinde örnekleri çok sayıda analizine izin bu işlemler için mikrolevha tabanlı yöntemleri açıklanmaktadır. Örnekler mikro blok mikro ya da derin kuyu 96 oyuklu içinde yapay alt-tabakalar ile reaksiyona girmesine izin verilir ve enzim aktivitesi, daha sonra, tipik bir mikro-Reade kullanılarak elde edilen son ürünün emilim veya floresan ile belirlenirr veya florimetre. Bu gibi yüksek üretim işlemleri uzaysal olarak ayrı bölgelerde veya ekosistemlerin arasında karşılaştırma sağlamak değil, aynı zamanda esasen genel olarak, numune başına gerekli reaktif hacimlerini azaltarak Bu tahlillerin maliyetini azaltmak değil.

Topraklar ve su çökeltiler genellikle bağlı mikrobiyal toplulukları (biyofilm) parçacıkların yüzeyi üzerinde artan bir sonucu olarak, hücre dışı enzim etkinliğinin kayda değer bir düzeyde vardır., Bu etkinliği, bir üçüncü yüzey tortu elde edilen partikül büyüklüğüne bağlı olarak değişir kadar 3: Şekil kuzey Mississippi, ABD&#39;de sipariş akışı. Bir önceki çalışmada bu akımdan tortu partikülleri üzerinde bakteri topluluklarının kendi toplum yapısının moleküler analizine göre üç ayrı gruba ayrılabilir gö...

Mikroplaka dayalı işlemler hücre dışı enzim aktivitesi, kolorimetrik veya florometrik analizi için tarif edilmiştir. Bu işlemler yönetilebilir bir süre içinde çevre örneklerin çok sayıda bu tür aktivitenin hızlı analizi için izin verir.

Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, çeşitli doğal ortamlardaki mikrobiyal hücre dışı enzim aktivitesini hızlı bir şekilde analiz etmektir. Bu, yeterli tekrarlanabilirliği sağlamak için mikroplakaya su veya toprak süspansiyonu örnekleri eklenerek gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, mikroplaka kuyucuklarına enzimatik reaksiyonların gerçekleşmesine olanak tanıyan yapay kolorimetrik veya florometrik substrat eklenir. Ardından, reaksiyon sırasında açığa çıkan son ürün miktarını belirlemek için absorbans veya floresans ölçümü yapılır.Sonuçlar, nihai reaksiyonun absorbansı veya floresansına dayanarak örnekler arasında hücre dışı enzim aktivitesi farklılıkları olduğunu göstermektedir. Bugün, doğal ortamlarda hücre dışı enzim aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bu yöntem; topraklarda, sedimentlerde ve sularda organik madde işleme hızları ve besin mineralizasyonu gibi mikrobiyal ekolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemi kullanmaya yeni başlayan kişiler, özellikle çok sayıda örnek analiz ederken partikülleri reaksiyon solüsyonundan ayırmadaki zorluk nedeniyle sorun yaşayabilmektedir.Plaka düzeninin öğrenilmesi zor olabildiği ve birden fazla zaman adımında ölçümler yapmanın süreci daha zorlu hale getirebildiği göz önüne alındığında, bu prosedürün görsel bir gösterimi kritik önem taşır. Topraklar ve sedimentler için hücre dışı enzim aktivitesinin kolimetrik analizi, metin protokolünde açıklandığı üzere substrat tamponu ve standart çözeltilerin hazırlanmasıyla başlar; analiz edilecek her örnek için steril 15 mililitre santrifüj tüpünde bir bulamaç hazırlayın. Sedimentler için 50 millimolar asetat tamponu kullanarak yaklaşık bir gram bölü mililitre konsantrasyonda ekleme yapın.Süspansiyonun kolayca pipetlenebilmesi için yeterli miktarda asetat tamponu ekleyin. Gereken süspansiyonun kesin hacmi, analiz edilen enzimlerin sayısına göre değişiklik gösterecektir, ancak minimum beş mililitre önerilir. Toprak veya tortu topaklarının tamamı dağılana kadar her süspansiyonu vorteksleyin.Ve final hacmine dikkat edin. Pipetleme yapmadan önce pipet uçlarının ucunu makasla kesin. Toprak süspansiyonları uçları tıkama eğiliminde olduğundan, her bir süspansiyonu tekrar vorteksleyin ve derhal altı kuyucuğun her birine 150 microliters pipetleyin.96 kuyucuklu derin kuyucuk bloğunda. İyice ve sık sık vortekslemek önemlidir. Toprak partiküllerini süspansiyonda tutmak için, her blokta substrat kontrolü olarak hizmet edecek en az iki kuyucuğu boş bırakın.Analiz edilecek her enzim için bir adet 96 kuyucuklu blok hazırlayın. Bir pipet rezervuarına yaklaşık beş mililitre asetat tamponu dökün ve her örneğin son iki kuyucuğuna 150 µL tampon eklemek için sekiz kanallı bir pipet kullanın.Örnek tampon kontrollerine ve iki substrat kontrol kuyucuğuna ekleyin. Yaklaşık 10 mililitre uygun p nitro fenol veya PNP substrat çözeltisini bir pipet rezervuarına boşaltın ve sekiz kanallı bir pipet kullanarak her örneğin ilk dört kuyucuğuna ve iki substrat kontrol kuyucuğuna 150 µL substrat çözeltisi ekleyin. Substrat çözeltisi eklenir eklenmez, reaksiyonun başladığı saati kaydedin.Plakları oda sıcaklığında 0,5 ila dört saat boyunca inkübe edin. Kesin inkübasyon süresi, numunelerdeki aktivite seviyesine ve analiz edilecek enzime göre değişiklik gösterecektir. Analizler inkübe edilirken, bir adet şeffaf 96 kuyucuklu mikroplaka hazırlayın.Absorbansı okumak için her bir derin kuyucuk bloğundaki her kuyucuğa 190 µL distile su ve 10 µL 1 M sodyum hidroksit pipetleyin. Sodyum hidroksit, enzimatik reaksiyonu yavaşlatır ve pH'ı yükselterek inkübasyon sonrası reaksiyon sırasında açığa çıkan PNP rengini belirginleştirir. Toprak partiküllerini çöktürmek için 96 kuyucuklu blokları 2000 ila 5.000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Çökeltiye zarar vermeden sıvının uzaklaştırılması zorlayıcı olabilir. Başlangıçta çok fazla toprak örneği kullanmaktan kaçınılmalıdır. Yeterince uzun süre santrifüjleme yaptığınızdan emin olun ve sıvıyı çekmek için dikkatli ancak kendinden emin bir hareket uygulayın.Çok kanallı bir pipet kullanarak, pelletten kaçınmaya dikkat ederek her kuyucuktan 100 µL çekin. Sıvıyı, önceden hazırlanmış şeffaf bir 96 kuyucuklu mikroplakadaki karşılık gelen kuyucuğa aktarın. Mikroplaka okuyucuyu açın ve gerekli yazılımları kurun. Metin protokolünde açıklandığı şekilde örneklerin kuru kütlesi belirlendikten sonra 410 nm'de absorbansı kaydedin; örnek kontrol absorbansını, örnek analiz absorbansından çıkararak her örneğin nihai absorbansını hesaplayın.Substrat kontrollerinin absorbansı 0,060'tan yüksekse, bu değerleri çıkarın. Ardından, aşağıdaki denklemi kullanarak enzim aktivitesini saat başına gram kuru kütle başına mikromol cinsinden hesaplamaya geçin. Metin protokolünde gösterilen örneği takip ederek her enzim için siyah bir mikroplaka düzenledikten sonra, ilk su örneğinden yaklaşık beş mililitreyi bir pipet rezervuarına boşaltın ve sekiz kanallı bir pipet kullanarak tüm kuyucuklara 200 µL ekleyin.Mikroplakanın birinci sütununda kullanılmış pipet uçlarını atın ve birinci sütundan dokuzuncu sütuna kadar doldurmak için her su örneği için gerektiği kadar işlemi tekrarlayın; örnekleri, standartları, substratı ve söndürmeyi (quenching) hesaba katacak kontrolleri, örneklerle aynı siyah mikroplaka üzerine kurun. Örnek kontrolleri, örnek su ve bikarbonat tamponu içerir ve aktivite hesaplamalarında kullanılmazlar, ancak deney süresince okuma tutarlılığını göstereceklerdir.Söndürme kontrolleri, örnek su ile floresan etiketin standart miktarından oluşur ve floresan difraksiyonunu ölçmek için kullanılır. Örnek su substrat ve standart kontrolleri, sırasıyla ya substrata bağlı etiketten ya da standart floresan etiketten ve bikarbonat tamponundan hazırlanır. Temiz bir pipet rezervuarına yaklaşık beş mililitre beş milimolar bikarbonat tamponu dökün.Numune başına iki replika kontrol kuyucuğu oluşturmak için d ve e satırlarındaki bir ile dokuz arasındaki mikroplaka kuyucuklarına 50 µL tampon pipetleyin; pipet uçlarını değiştirin, ardından A ve H satırlarındaki 10 ile 12 arasındaki kuyucuklara 200 µL bikarbonat tamponu aktarın. Bu gösterimde çekim amaçlı olarak ışık parlak tutulmuş olsa da, floresan standart ışığa duyarlı olduğu için ortam aydınlatması ışıklar kısılarak veya kapatılarak azaltılmalıdır. Yaklaşık 5 mL 10 µM 4-metilumbelliferon veya MUB'u temiz bir pipet rezervuarına boşaltın ve H satırındaki bir ile 12 arasındaki mikroplaka kuyucuklarına 50 µL pipetleyin. Ardından, numune başına üç replika söndürme kontrolü ve genel standart kontrolleri oluşturmak için G ve F satırlarındaki bir ile dokuz arasındaki kuyucuklara 50 µL pipetleyin. MUB'un ışıkla bozunmasını azaltmak için mikroplakayı karanlık bir yere yerleştirin veya opak bir kapakla örtün; florimetreyi açın ve substratı eklemeden önce okuma yapmaya hazır olmak için gerekli yazılımları kurun.Temiz bir pipet rezervuarına yaklaşık beş mililitre uygun MUB kaplı substrat ekleyin; 12 kanallı bir pipet kullanarak A satırındaki 1 ila 12 numaralı kuyucuklara ve B ile C satırlarındaki 1 ila 9 numaralı kuyucuklara, her örnek için üç tekrarlı analiz ve üç substrat kontrolü oluşturacak şekilde 50 microliters pipetleyin ve derhal floresans kaydına geçin. Substratın mikroplakaya eklenmesinin hemen ardından başlangıç floresansını okuyun. Okuma işleminden sonra mikroplakayı oda sıcaklığında, karanlıkta veya opak bir kapakla kapatılmış şekilde inkübe edin.MUB'nin ışıkla bozunmasını azaltmak için. Maksimum potansiyel enzim aktivitesini ölçmek için gereken inkübasyon süresi, bir numune içindeki enzim konsantrasyonuna bağlı olacaktır. Bu değer bilinmediği için, numune analiz edilmeden önce mikropitka birden fazla zaman adımında okunmalıdır.Çoğu enzim için bir saatlik süre boyunca 10 ila 15 dakikalık aralıklar uygundur, ancak yüksek konsantrasyona sahip bazı örnekler 10 dakikadan önce zirve noktasına ulaşacaktır. Belirlenen aralıklarla mikroplakadaki floresans okumalarına en az bir saat boyunca devam edin. Okumalar arasında mikroplakanın kapalı tutulduğundan veya karanlıkta olduğundan emin olun.Her bir zaman aralığındaki her örnek için; ortalama başlangıç örnek floresansını, ortalama son örnek floresansını, ortalama standart floresansı ve her zaman aralığı için ortalama sönümleme kontrol floresansını hesaplayın. Metin protokolünde yer alan denklemi kullanarak, enzim aktivitesini m/saat/mL cinsinden hesaplayın.Her bir zaman adımı için hesaplanan aktivite değerlerini inceleyin ve nihai potansiyel aktiviteyi en yüksek aktiviteye sahip zaman adımından belirleyin. Aktivite değerleri artmaya devam ediyorsa, daha sonraki zaman adımları gerekebilir. Aktivite değerleri çalışma boyunca düşüş gösterirse, çalışmayı daha kısa zaman adımlarıyla tekrarlayın.Topraklar ve sucul sedimentler, partiküllerin yüzeyinde büyüyen tutunmuş mikrobiyal toplulukların bir sonucu olarak genellikle belirgin düzeylerde hücre dışı enzim aktivitesine sahiptir. Bu şekil, ABD'nin kuzey Mississippi'sindeki üçüncü derece bir akarsuyun yüzey sedimentinden elde edilen partiküllerin boyutuna bağlı olarak bu aktivitenin nasıl değiştiğini göstermektedir. Önceki bir çalışma, bu akarsuyun sediment partikülleri üzerindeki bakteriyel toplulukların, topluluk yapılarının moleküler analizi temelinde üç ayrı gruba ayrılabileceğini göstermiştir.0,063 milimetrelik partiküller üzerindekiler, 0,125, 0,25 ve 0,5 milimetrelik partiküller üzerindekiler ve bir milimetrelik partiküller üzerindekiler. Hücre dışı enzim aktivitesindeki örüntülerin analizi, PNP bağlı substrat tekniği kullanılarak ölçüldüğünde fosfataz aktivitesinin 0,125, 0,25 ve 0,5 milimetrelik partiküllerde benzer, ancak bir ve 0,063 milimetrelik fraksiyonlarda çok daha yüksek olmasıyla bu sonucu desteklemektedir. Beta glukozidaz ve NAGase gibi diğer enzimler, en ince partiküllerde benzer pikler göstermektedir, ancak bir milimetrelik partiküllerde artış göstermemektedir.Farklı enzimlerin farklı çevresel dağılımlar gösterebileceği ve bunların bu analiz kullanılarak aydınlatılabileceği gerçeği vurgulanmaktadır. Nispeten düşük hata çubukları, sedimentlerdeki enzim aktivitesinin kolorimetrik analizlerinin tekrarlanabilir olduğunu ve dolayısıyla istatistiksel analize uygun olduğunu göstermektedir. Farklı çevresel örnekler karşılaştırıldığında, doğal suların mililitre başına düşen hücre dışı enzim aktivitesinin, toprakların veya sedimentlerin gram başına düşen aktivitesinden daha düşük olma eğiliminde olduğu görülmektedir.Bu nedenle, MUB bağlantılı substratlar kullanılarak florimetrik olarak analiz edilmelidirler. Bu şekil; fosfataz, beta-glukozidaz ve NGA enzimlerinin aktivitesinin derinliğe göre nasıl değiştiğini göstermektedir. ABD'nin kuzey Mississippi bölgesindeki sığ bir gölde, gölün besin açısından fakir olduğu bilinmektedir; bu durum, mikroorganizmaların organik bileşiklerden fosfat elde etmek için ürettiği fosfataz ve enzimlerin nispeten yüksek aktivitesiyle de desteklenmektedir.Her üç enzim için de, su yüzeyinden ve 50 santimetre derinlikten toplanan analiz örnekleri benzer aktivite göstermiştir. 100 santimetre derinlikteki örnekte aktivite yükselmiş olsa da, bu örnek esasen su-sediman ara yüzeyinden alınmıştır ve örnekteki sediman partiküllerinin varlığı, özellikle beta glukozidaz ve n-AGA'lar için gözlemlenen daha yüksek aktiviteyi muhtemelen açıklamaktadır. PNP substratlarında olduğu gibi, düşük hata çubukları, sadece üç tekrarlı okuma ile bile MUB substratları kullanılarak yapılan florometrik analizlerin tekrarlanabilirliğinin yüksek olduğunu göstermektedir.Su örneği enzim aktivitesi birimlerinin tüketilen substratın nmol cinsinden olduğunu, sediment partikülleri üzerindeki enzim aktivitesi birimlerinin ise birim boyut başına karşılaştırılabilir olmasına rağmen tüketilen substratın mikromol cinsinden olduğunu unutmayın. Bu durum, toprakların ve sedimentlerin doğal sulara göre çok daha yüksek hücre dışı aktiviteye sahip olma eğilimini vurgulamaktadır. Ayrıca, MUB bağlı substrat tekniğinin artan hassasiyetini ve bu teknikte uzmanlaşıldığında, su örneklerindeki hücre dışı enzim aktivitesini analiz etmek için bu yöntemi kullanmanın gerekliliğini göstermektedir.Bu teknik, bir saatten biraz daha kısa bir sürede dokuz su örneğindeki enzimlerin miktarını belirlemek için kullanılabilir. Bu prosedür toprak ve sedimentler için uygulanırken, aktivitenin kuru ağırlık bazında ifade edilebilmesi için bilinen bir kütle materyali kullanmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kolorimetrik veya florometrik teknikler kullanarak çeşitli doğal ortamlarda hücre dışı enzim aktivitesinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Bu videoda, bir peg plakası kullanarak biyofilmleri etkili bir şekilde ortadan kaldıran antimikrobiyal bileşiklerin taranması için bir test gösterilmektedir. Metodoloji, antimikrobiyal bileşiklerle muamele edildikten sonra biyofilmin metabolik durumunu izleyerek minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunun belirlenmesini kolaylaştırır.

Antibakteriyel Ajanların Talınması için Bir Peg Plaka Biyofilm Testi

Toprak dışı enzim faaliyetlerinin muhtemel değerlerini ölçmek için, bir floresan boya bağlanmıştır sentetik alt-tabakalar toprak örneklerinin eklenir. Floresan boya yüksek flüoresans daha fazla alt bozulmasını gösteren bir enzim-katalizörlü reaksiyonu ile alt-tabakadan salınmaktadır gibi enzim aktivitesi ölçülmüştür.

Potansiyel Toprak Ekstrasellüler Enzim Aktivitelerinin Yüksek verim Florimetrik Ölçme

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Biz mikro besin bioavailability ve ciro karasal sistemlerinde katkıda bulunan siderophore olası çevresel örneklerin hızlı tarama için bir iletişim kuralı mevcut.

Yüksek işlem hacmi Siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Öğrenin mikropların ekstraselüler enzim aktivitesini yüksek verimli mikroplate yöntemiyle su, toprak ve tortu örneklerinde hızlıca ölçmeyi. Bu yöntem mikrobiyal ekoloji araştırmalarında besin mineralizasyonunu anlamaya yardımcı olur.

Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal

Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet