Floresan Mikroskobuna Giriş
Floresan, bir madde belirli bir dalga boyunda ışığı emdiğinde ve başka bir dalga boyunda ışık yaydığında meydana gelen bir olgudur. Floresan, daha yüksek ve daha kararsız bir enerji durumuna uyarılmış bir elektron olarak meydana gelir, temel durumuna gevşer ve bir ışık fotonu verir. Uyarılmaktan veya elektronu daha yüksek bir enerji durumuna taşımaktan sorumlu olan ışık, daha uzun dalga boyuna, daha düşük enerjiye ve farklı renge sahip olan floresan emisyonundan daha kısa dalga boyuna ve daha yüksek enerjiye sahiptir.
Floresan mikroskobu, ışık mikroskobunun büyütme özelliklerini, floroforlardan - floresan kimyasal bileşiklerden kaynaklanan emisyonların uyarılmasına ve tespit edilmesine izin veren floresan teknolojisi ile birleştirir. Floresan mikroskobu ile bilim adamları, dokular içindeki belirli hücre tiplerinin veya hücreler içindeki moleküllerin yerini gözlemleyebilirler.
Floresan mikroskobun ana bileşenleri, geleneksel ışık mikroskobu ile büyük ölçüde örtüşür. Bununla birlikte, 2 ana fark, ışık kaynağının türü ve özel filtre elemanlarının kullanılmasıdır.
Floresan mikroskobu, burada gösterildiği gibi bir ksenon veya cıva kemer lambası gibi çok güçlü bir ışık kaynağı gerektirir. Cıva ark lambasından yayılan ışık, çoğu akkor lambadan 10-100 kat daha parlaktır ve ultraviyoleden kızılötesine kadar geniş bir dalga boyu aralığında ışık sağlar. Bu yüksek güçlü ışık kaynağı, floresan mikroskobu kurulumunun en tehlikeli parçasıdır, çünkü doğrudan filtrelenmemiş ışığa bakmak retinalarınıza ciddi şekilde zarar verebilir ve ampullerin yanlış kullanılması patlamalarına neden olabilir.
Floresan mikroskobunun arkasındaki prensip basittir. Işık ark lambasından çıkarken, uyarma dalga boyunu seçen bir uyarıcı filtreden geçirilir.
Bu ışık, ışığı yalnızca uyarma dalga boyunda yansıtmak üzere tasarlanmış, dikroik ayna adı verilen özel bir ayna tarafından numuneye doğru yansıtılır. Yansıyan ışık, floresan numuneye odaklandığı objektiften geçer. Numuneden çıkan emisyonlar, sırayla, görüntünün büyütülmesinin meydana geldiği objektiften ve şimdi de dikroik aynadan geri geçirilir.
Bu ışık, emisyon dalga boyunu seçen ve ark lambasından veya mikroskop bileşenlerinden yansıyan diğer kaynaklardan gelen kirletici ışığı filtreleyen bariyer filtresi tarafından filtrelenir. Son olarak, filtrelenmiş floresan emisyonu, görüntünün sayısallaştırılabileceği bir dedektöre gönderilir veya optik görüntüleme için göz merceğine iletilir.
Uyarıcı filtre, dikroik ayna ve bariyer filtre, filtre küpü olarak bilinen bir bileşene bir araya getirilebilir. Uyarma dalga boyunu değiştirmek için numune görüntüleme sırasında farklı filtre küpleri değiştirilebilir ve uyarma yoğunluğunu değiştirmek için bir dizi diyafram kullanılabilir.
Floresan mikroskobu söz konusu olduğunda, florofor mikroskobun kendisi kadar önemli olabilir ve görüntülenen florofor tipi, kullanılan uyarma dalga boyunu ve tespit edilen emisyon dalga boyunu belirler. Uyarma dalga boyları, florofor tarafından emilebilen ve uyarılmış bir duruma geçmesine neden olan küçük bir enerji aralığı içerir. Bir kez uyarıldığında, geniş bir emisyon aralığı veya daha düşük enerji durumuna geri geçişler mümkündür ve bu da bir emisyon spektrumu ile sonuçlanır.
Absorpsiyon veya uyarma eğrisinin zirvesi ile emisyon eğrisinin zirvesi arasındaki fark, Stoke Kayması olarak bilinir. Bu kaymadaki mesafe ne kadar büyük olursa, iki farklı dalga boyunu ayırmak o kadar kolay olur. Ek olarak, çakışan spektrumun, azaltılmış arka plan ve iyileştirilmiş görüntü kalitesi için filtre küpünün bileşenleri tarafından kaldırılması gerekir.
Floroforun uzun süreli uyarılmaya maruz kalması, floresan zayıflaması veya kaybı olan fotoağartıcıya neden olacaktır. Foto ağartmayı azaltmak için, slayta solmaya karşı önleyici bir montaj ortamı ekleyebilir ve kenarları oje ile kapatabilirsiniz. Slayt, görüntülenmediği zamanlarda karanlıkta da tutulmalıdır.
Floresan görüntülemeye başlamak için, ksenon veya cıva ışık kaynağını açın ve sabit aydınlatmaya ulaşması için 15 dakika kadar ısınmasına izin verin.
Ardından, numunenizi sahneye yerleştirin ve yerine sabitleyin. Ardından, mikroskobunuzun beyaz ışık kaynağını açın. Kaba ve ince odak düğmelerini ayarlayarak en düşük güçlü objektifi kullanarak numunenize odaklanın. Ardından, ilgi alanınızı bulmak için sahne ayar düğmelerini kullanın.
Ardından, arka planı azaltmak için beyaz ışık kaynağını ve gereksiz oda ışıklarını kapatın.
Görüntülemekte olduğunuz boya için doğru filtre küpünü seçin ve numunenizi aydınlatmak için deklanşörü açın.
Son olarak, ince odak ayarları yapın ve çıkış ışığını görüntüleme kamerasına yönlendirin. Kullanılan her farklı florofor veya floresan boya için maruz kalma süresinde ayarlamalar yapmanız gerekecektir. Bununla birlikte, farklı numunelerde aynı boya ile özellikleri karşılaştırırken maruz kalma süresini sabit tutmak önemlidir.
Aynı numune üzerinde birden fazla boyayı görüntülemek için, filtre küpünü her bir floroforla eşleşecek şekilde değiştirin ve yeni görüntüyü kaydedin.
Numunedeki her boya görüntülendikten sonra, tek tek görüntüler üst üste bindirilebilir ve birleştirilebilir.
Birçok farklı deney türü floresan mikroskobundan yararlanabilir ve farklı florofor türlerini içerebilir Floresan mikroskobunun en yaygın uygulamalarından biri, floresan bileşiklere bağlı veya "konjuge" olan antikorlarla etiketlenmiş proteinlerin görüntülenmesidir. Burada, uyarıldığında yeşil floresan veren alexafluor-488'e konjuge edilmiş ikincil bir antikor kullanılarak leptospiral yüzey proteinlerine karşı bir antikor tespit edildi.
Floresan ile belirli bir özelliği vurgulamanın bir başka yolu, yeşil floresan proteini veya GFP gibi bir floresan proteinin kodunu bir organizmanın DNA'sına entegre etmektir. GFP geni orijinal olarak denizanasından izole edilmiştir ve belirli tetikleyicilere yanıt olarak kültürlenmiş hücreler tarafından veya bu görüntüde parlayan tümör hücreleri gibi belirli bir hücre tipinin parçası olarak eksprese edilebilir veya üretilebilir
Floresan görüntülemenin bir başka uygulaması, bu önemli hücre iskeleti proteininin hareket ve devir kinetiğini incelemek için burada görülen F-aktin ağı gibi floresan etiketli makromoleküler düzenekleri kullanan bir teknoloji olan Floresan Benek Mikroskobudur.
Foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı veya FRAP olarak bilinen gelişmiş bir teknik, floresan etiketli moleküllerin foto-ağartılmış bölgeye geri difüzyon hızını izlemek için bir numunenin küçük bir bölgesini kasıtlı olarak foto-ağartma yoluyla gerçekleştirilir.
JoVE'nin Floresan Mikroskobu ile tanışmasını izlediniz.
Bu videoda floresan kavramını, floresan mikroskobunun ışık mikroskobundan nasıl farklı olduğunu ve dürbün aracılığıyla bir floresan görüntüsünün nasıl çekileceğini öğrendik. Ayrıca floresan kullanan bazı temel ve gelişmiş uygulamalar hakkında da bilgi edindik. İzlediğiniz için teşekkürler ve unutmayın, foto ağartma dişlerinizde harika görünse de, numuneleriniz için o kadar iyi değil.
Floresan mikroskobu, ışık mikroskobunun büyütme özelliklerini floresan görselleştirmesi ile birleştiren çok güçlü bir analitik araçtır. Floresan, flor…
Floresan, bir madde belirli bir dalga boyunda ışığı emdiğinde ve başka bir dalga boyunda ışık yaydığında meydana gelen bir olgudur. Floresan, daha yüksek ve daha kararsız bir enerji durumuna uyarılmış bir elektron olarak meydana gelir, temel durumuna gevşer ve bir ışık fotonu verir. Uyarılmaktan veya elektronu daha yüksek bir enerji durumuna taşımaktan sorumlu olan ışık, daha uzun dalga boyuna, daha düşük enerjiye ve farklı renge sahip olan floresan emisyonundan daha kısa dalga boyuna ve daha yüksek enerjiye sahiptir.
Floresan mikroskobu, ışık mikroskobunun büyütme özelliklerini, floroforlardan - floresan kimyasal bileşiklerden kaynaklanan emisyonların uyarılmasına ve tespit edilmesine izin veren floresan teknolojisi ile birleştirir. Floresan mikroskobu ile bilim adamları, dokular içindeki belirli hücre tiplerinin veya hücreler içindeki moleküllerin yerini gözlemleyebilirler.
Floresan mikroskobun ana bileşenleri, geleneksel ışık mikroskobu ile büyük ölçüde örtüşür. Bununla birlikte, 2 ana fark, ışık kaynağının türü ve özel filtre elemanlarının kullanılmasıdır.
Floresan mikroskobu, burada gösterildiği gibi bir ksenon veya cıva kemer lambası gibi çok güçlü bir ışık kaynağı gerektirir. Cıva ark lambasından yayılan ışık, çoğu akkor lambadan 10-100 kat daha parlaktır ve ultraviyoleden kızılötesine kadar geniş bir dalga boyu aralığında ışık sağlar. Bu yüksek güçlü ışık kaynağı, floresan mikroskobu kurulumunun en tehlikeli parçasıdır, çünkü doğrudan filtrelenmemiş ışığa bakmak retinalarınıza ciddi şekilde zarar verebilir ve ampullerin yanlış kullanılması patlamalarına neden olabilir.
Floresan mikroskobunun arkasındaki prensip basittir. Işık ark lambasından çıkarken, uyarma dalga boyunu seçen bir uyarıcı filtreden geçirilir.
Bu ışık, ışığı yalnızca uyarma dalga boyunda yansıtmak üzere tasarlanmış, dikroik ayna adı verilen özel bir ayna tarafından numuneye doğru yansıtılır. Yansıyan ışık, floresan numuneye odaklandığı objektiften geçer. Numuneden çıkan emisyonlar, sırayla, görüntünün büyütülmesinin meydana geldiği objektiften ve şimdi de dikroik aynadan geri geçirilir.
Bu ışık, emisyon dalga boyunu seçen ve ark lambasından veya mikroskop bileşenlerinden yansıyan diğer kaynaklardan gelen kirletici ışığı filtreleyen bariyer filtresi tarafından filtrelenir. Son olarak, filtrelenmiş floresan emisyonu, görüntünün sayısallaştırılabileceği bir dedektöre gönderilir veya optik görüntüleme için göz merceğine iletilir.
Uyarıcı filtre, dikroik ayna ve bariyer filtre, filtre küpü olarak bilinen bir bileşene bir araya getirilebilir. Uyarma dalga boyunu değiştirmek için numune görüntüleme sırasında farklı filtre küpleri değiştirilebilir ve uyarma yoğunluğunu değiştirmek için bir dizi diyafram kullanılabilir.
Floresan mikroskobu söz konusu olduğunda, florofor mikroskobun kendisi kadar önemli olabilir ve görüntülenen florofor tipi, kullanılan uyarma dalga boyunu ve tespit edilen emisyon dalga boyunu belirler. Uyarma dalga boyları, florofor tarafından emilebilen ve uyarılmış bir duruma geçmesine neden olan küçük bir enerji aralığı içerir. Bir kez uyarıldığında, geniş bir emisyon aralığı veya daha düşük enerji durumuna geri geçişler mümkündür ve bu da bir emisyon spektrumu ile sonuçlanır.
Absorpsiyon veya uyarma eğrisinin zirvesi ile emisyon eğrisinin zirvesi arasındaki fark, Stoke Kayması olarak bilinir. Bu kaymadaki mesafe ne kadar büyük olursa, iki farklı dalga boyunu ayırmak o kadar kolay olur. Ek olarak, çakışan spektrumun, azaltılmış arka plan ve iyileştirilmiş görüntü kalitesi için filtre küpünün bileşenleri tarafından kaldırılması gerekir.
Floroforun uzun süreli uyarılmaya maruz kalması, floresan zayıflaması veya kaybı olan fotoağartıcıya neden olacaktır. Foto ağartmayı azaltmak için, slayta solmaya karşı önleyici bir montaj ortamı ekleyebilir ve kenarları oje ile kapatabilirsiniz. Slayt, görüntülenmediği zamanlarda karanlıkta da tutulmalıdır.
Floresan görüntülemeye başlamak için, ksenon veya cıva ışık kaynağını açın ve sabit aydınlatmaya ulaşması için 15 dakika kadar ısınmasına izin verin.
Ardından, numunenizi sahneye yerleştirin ve yerine sabitleyin. Ardından, mikroskobunuzun beyaz ışık kaynağını açın. Kaba ve ince odak düğmelerini ayarlayarak en düşük güçlü objektifi kullanarak numunenize odaklanın. Ardından, ilgi alanınızı bulmak için sahne ayar düğmelerini kullanın.
Ardından, arka planı azaltmak için beyaz ışık kaynağını ve gereksiz oda ışıklarını kapatın.
Görüntülemekte olduğunuz boya için doğru filtre küpünü seçin ve numunenizi aydınlatmak için deklanşörü açın.
Son olarak, ince odak ayarları yapın ve çıkış ışığını görüntüleme kamerasına yönlendirin. Kullanılan her farklı florofor veya floresan boya için maruz kalma süresinde ayarlamalar yapmanız gerekecektir. Bununla birlikte, farklı numunelerde aynı boya ile özellikleri karşılaştırırken maruz kalma süresini sabit tutmak önemlidir.
Aynı numune üzerinde birden fazla boyayı görüntülemek için, filtre küpünü her bir floroforla eşleşecek şekilde değiştirin ve yeni görüntüyü kaydedin.
Numunedeki her boya görüntülendikten sonra, tek tek görüntüler üst üste bindirilebilir ve birleştirilebilir.
Birçok farklı deney türü floresan mikroskobundan yararlanabilir ve farklı florofor türlerini içerebilir Floresan mikroskobunun en yaygın uygulamalarından biri, floresan bileşiklere bağlı veya "konjuge" olan antikorlarla etiketlenmiş proteinlerin görüntülenmesidir. Burada, uyarıldığında yeşil floresan veren alexafluor-488'e konjuge edilmiş ikincil bir antikor kullanılarak leptospiral yüzey proteinlerine karşı bir antikor tespit edildi.
Floresan ile belirli bir özelliği vurgulamanın bir başka yolu, yeşil floresan proteini veya GFP gibi bir floresan proteinin kodunu bir organizmanın DNA'sına entegre etmektir. GFP geni orijinal olarak denizanasından izole edilmiştir ve belirli tetikleyicilere yanıt olarak kültürlenmiş hücreler tarafından veya bu görüntüde parlayan tümör hücreleri gibi belirli bir hücre tipinin parçası olarak eksprese edilebilir veya üretilebilir
Floresan görüntülemenin bir başka uygulaması, bu önemli hücre iskeleti proteininin hareket ve devir kinetiğini incelemek için burada görülen F-aktin ağı gibi floresan etiketli makromoleküler düzenekleri kullanan bir teknoloji olan Floresan Benek Mikroskobudur.
Foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı veya FRAP olarak bilinen gelişmiş bir teknik, floresan etiketli moleküllerin foto-ağartılmış bölgeye geri difüzyon hızını izlemek için bir numunenin küçük bir bölgesini kasıtlı olarak foto-ağartma yoluyla gerçekleştirilir.
JoVE'nin Floresan Mikroskobu ile tanışmasını izlediniz.
Bu videoda floresan kavramını, floresan mikroskobunun ışık mikroskobundan nasıl farklı olduğunu ve dürbün aracılığıyla bir floresan görüntüsünün nasıl çekileceğini öğrendik. Ayrıca floresan kullanan bazı temel ve gelişmiş uygulamalar hakkında da bilgi edindik. İzlediğiniz için teşekkürler ve unutmayın, foto ağartma dişlerinizde harika görünse de, numuneleriniz için o kadar iyi değil.
Floresan, bir madde belirli bir dalga boyunda ışığı emdiğinde ve başka bir dalga boyunda ışık yaydığında meydana gelen bir olgudur. Floresan, daha yüksek ve daha kararsız bir enerji durumuna uyarılmış bir elektron olarak meydana gelir, temel durumuna gevşer ve bir ışık fotonu verir. Uyarılmaktan veya elektronu daha yüksek bir enerji durumuna taşımaktan sorumlu olan ışık, daha uzun dalga boyuna, daha düşük enerjiye ve farklı renge sahip olan floresan emisyonundan daha kısa dalga boyuna ve daha yüksek enerjiye sahiptir.
Floresan mikroskobu, ışık mikroskobunun büyütme özelliklerini, floroforlardan - floresan kimyasal bileşiklerden kaynaklanan emisyonların uyarılmasına ve tespit edilmesine izin veren floresan teknolojisi ile birleştirir. Floresan mikroskobu ile bilim adamları, dokular içindeki belirli hücre tiplerinin veya hücreler içindeki moleküllerin yerini gözlemleyebilirler.
Floresan mikroskobun ana bileşenleri, geleneksel ışık mikroskobu ile büyük ölçüde örtüşür. Bununla birlikte, 2 ana fark, ışık kaynağının türü ve özel filtre elemanlarının kullanılmasıdır.
Floresan mikroskobu, burada gösterildiği gibi bir ksenon veya cıva kemer lambası gibi çok güçlü bir ışık kaynağı gerektirir. Cıva ark lambasından yayılan ışık, çoğu akkor lambadan 10-100 kat daha parlaktır ve ultraviyoleden kızılötesine kadar geniş bir dalga boyu aralığında ışık sağlar. Bu yüksek güçlü ışık kaynağı, floresan mikroskobu kurulumunun en tehlikeli parçasıdır, çünkü doğrudan filtrelenmemiş ışığa bakmak retinalarınıza ciddi şekilde zarar verebilir ve ampullerin yanlış kullanılması patlamalarına neden olabilir.
Floresan mikroskobunun arkasındaki prensip basittir. Işık ark lambasından çıkarken, uyarma dalga boyunu seçen bir uyarıcı filtreden geçirilir.
Bu ışık, ışığı yalnızca uyarma dalga boyunda yansıtmak üzere tasarlanmış, dikroik ayna adı verilen özel bir ayna tarafından numuneye doğru yansıtılır. Yansıyan ışık, floresan numuneye odaklandığı objektiften geçer. Numuneden çıkan emisyonlar, sırayla, görüntünün büyütülmesinin meydana geldiği objektiften ve şimdi de dikroik aynadan geri geçirilir.
Bu ışık, emisyon dalga boyunu seçen ve ark lambasından veya mikroskop bileşenlerinden yansıyan diğer kaynaklardan gelen kirletici ışığı filtreleyen bariyer filtresi tarafından filtrelenir. Son olarak, filtrelenmiş floresan emisyonu, görüntünün sayısallaştırılabileceği bir dedektöre gönderilir veya optik görüntüleme için göz merceğine iletilir.
Uyarıcı filtre, dikroik ayna ve bariyer filtre, filtre küpü olarak bilinen bir bileşene bir araya getirilebilir. Uyarma dalga boyunu değiştirmek için numune görüntüleme sırasında farklı filtre küpleri değiştirilebilir ve uyarma yoğunluğunu değiştirmek için bir dizi diyafram kullanılabilir.
Floresan mikroskobu söz konusu olduğunda, florofor mikroskobun kendisi kadar önemli olabilir ve görüntülenen florofor tipi, kullanılan uyarma dalga boyunu ve tespit edilen emisyon dalga boyunu belirler. Uyarma dalga boyları, florofor tarafından emilebilen ve uyarılmış bir duruma geçmesine neden olan küçük bir enerji aralığı içerir. Bir kez uyarıldığında, geniş bir emisyon aralığı veya daha düşük enerji durumuna geri geçişler mümkündür ve bu da bir emisyon spektrumu ile sonuçlanır.
Absorpsiyon veya uyarma eğrisinin zirvesi ile emisyon eğrisinin zirvesi arasındaki fark, Stoke Kayması olarak bilinir. Bu kaymadaki mesafe ne kadar büyük olursa, iki farklı dalga boyunu ayırmak o kadar kolay olur. Ek olarak, çakışan spektrumun, azaltılmış arka plan ve iyileştirilmiş görüntü kalitesi için filtre küpünün bileşenleri tarafından kaldırılması gerekir.
Floroforun uzun süreli uyarılmaya maruz kalması, floresan zayıflaması veya kaybı olan fotoağartıcıya neden olacaktır. Foto ağartmayı azaltmak için, slayta solmaya karşı önleyici bir montaj ortamı ekleyebilir ve kenarları oje ile kapatabilirsiniz. Slayt, görüntülenmediği zamanlarda karanlıkta da tutulmalıdır.
Floresan görüntülemeye başlamak için, ksenon veya cıva ışık kaynağını açın ve sabit aydınlatmaya ulaşması için 15 dakika kadar ısınmasına izin verin.
Ardından, numunenizi sahneye yerleştirin ve yerine sabitleyin. Ardından, mikroskobunuzun beyaz ışık kaynağını açın. Kaba ve ince odak düğmelerini ayarlayarak en düşük güçlü objektifi kullanarak numunenize odaklanın. Ardından, ilgi alanınızı bulmak için sahne ayar düğmelerini kullanın.
Ardından, arka planı azaltmak için beyaz ışık kaynağını ve gereksiz oda ışıklarını kapatın.
Görüntülemekte olduğunuz boya için doğru filtre küpünü seçin ve numunenizi aydınlatmak için deklanşörü açın.
Son olarak, ince odak ayarları yapın ve çıkış ışığını görüntüleme kamerasına yönlendirin. Kullanılan her farklı florofor veya floresan boya için maruz kalma süresinde ayarlamalar yapmanız gerekecektir. Bununla birlikte, farklı numunelerde aynı boya ile özellikleri karşılaştırırken maruz kalma süresini sabit tutmak önemlidir.
Aynı numune üzerinde birden fazla boyayı görüntülemek için, filtre küpünü her bir floroforla eşleşecek şekilde değiştirin ve yeni görüntüyü kaydedin.
Numunedeki her boya görüntülendikten sonra, tek tek görüntüler üst üste bindirilebilir ve birleştirilebilir.
Birçok farklı deney türü floresan mikroskobundan yararlanabilir ve farklı florofor türlerini içerebilir Floresan mikroskobunun en yaygın uygulamalarından biri, floresan bileşiklere bağlı veya "konjuge" olan antikorlarla etiketlenmiş proteinlerin görüntülenmesidir. Burada, uyarıldığında yeşil floresan veren alexafluor-488'e konjuge edilmiş ikincil bir antikor kullanılarak leptospiral yüzey proteinlerine karşı bir antikor tespit edildi.
Floresan ile belirli bir özelliği vurgulamanın bir başka yolu, yeşil floresan proteini veya GFP gibi bir floresan proteinin kodunu bir organizmanın DNA'sına entegre etmektir. GFP geni orijinal olarak denizanasından izole edilmiştir ve belirli tetikleyicilere yanıt olarak kültürlenmiş hücreler tarafından veya bu görüntüde parlayan tümör hücreleri gibi belirli bir hücre tipinin parçası olarak eksprese edilebilir veya üretilebilir
Floresan görüntülemenin bir başka uygulaması, bu önemli hücre iskeleti proteininin hareket ve devir kinetiğini incelemek için burada görülen F-aktin ağı gibi floresan etiketli makromoleküler düzenekleri kullanan bir teknoloji olan Floresan Benek Mikroskobudur.
Foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı veya FRAP olarak bilinen gelişmiş bir teknik, floresan etiketli moleküllerin foto-ağartılmış bölgeye geri difüzyon hızını izlemek için bir numunenin küçük bir bölgesini kasıtlı olarak foto-ağartma yoluyla gerçekleştirilir.
JoVE'nin Floresan Mikroskobu ile tanışmasını izlediniz.
Bu videoda floresan kavramını, floresan mikroskobunun ışık mikroskobundan nasıl farklı olduğunu ve dürbün aracılığıyla bir floresan görüntüsünün nasıl çekileceğini öğrendik. Ayrıca floresan kullanan bazı temel ve gelişmiş uygulamalar hakkında da bilgi edindik. İzlediğiniz için teşekkürler ve unutmayın, foto ağartma dişlerinizde harika görünse de, numuneleriniz için o kadar iyi değil.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is fluorescence and how does it occur at the molecular level?
Fluorescence occurs when a fluorophore absorbs light at a specific wavelength, exciting an electron to a higher energy state. As the electron relaxes back to its ground state, it emits a photon of light at a longer wavelength and lower energy than the absorbed light. This emission enables visualization of fluorescently labeled structures in microscopy applications.
Q2: How does fluorescence microscopy differ from light microscopy?
Fluorescence microscopy combines magnification with fluorescence detection, requiring specialized components beyond traditional light microscopy. Key differences include a powerful xenon or mercury arc lamp that is 10-100 times brighter than incandescent sources, specialized exciter and barrier filters, and a dichroic mirror to separate excitation and emission wavelengths. These additions enable detection of fluorescently labeled molecules within cells and tissues.
Q3: What is Stokes Shift and why does it matter in fluorescence microscopy?
Stokes Shift is the difference between the peak absorption wavelength and the peak emission wavelength of a fluorophore. A larger Stokes Shift makes it easier to separate excitation and emission wavelengths using filters, reducing background noise and improving image quality. This separation is critical for obtaining clear fluorescent images without contaminating light from the microscope components.
Q4: What causes photobleaching and how can you prevent it?
Photobleaching occurs when prolonged excitation weakens or eliminates a fluorophore's ability to fluoresce. To reduce photobleaching, add anti-fade mounting medium to slides and seal edges with nail polish. Additionally, keep slides in the dark when not being imaged to minimize unnecessary light exposure and preserve fluorescence intensity for accurate imaging.
Q5: What are the main components of a fluorescence microscope and their functions?
The exciter filter selects the excitation wavelength, the dichroic mirror reflects excitation light toward the sample while allowing emission light to pass through, and the barrier filter selects emission wavelength while blocking contaminating light. These three components can be assembled into a filter cube, which can be changed during imaging to accommodate different fluorophores and their specific wavelength requirements.
Q6: How do you prepare and image a fluorescence microscopy sample?
Allow the xenon or mercury light source to warm up for 15 minutes to reach constant illumination. Place the sample on the stage and focus using the lowest objective. Turn off room lights to reduce background, select the appropriate filter cube for your fluorophore, and open the shutter to illuminate the sample. Adjust exposure time as needed, keeping it constant when comparing samples with the same dye.
Q7: What are common methods for labeling samples in fluorescence microscopy?
Common labeling methods include conjugating fluorescent compounds to antibodies that target specific proteins, integrating fluorescent protein genes like GFP into organism DNA for expression in specific cell types, and labeling macromolecular assemblies such as the F-actin cytoskeletal network. Each method enables visualization of different cellular structures and molecular components for research and diagnostic applications.
Bu videodaki bölümler
0:00
Introduction to Fluorescence Microscopy
1:19
Principles and Components of the Fluorescent Microscope
2:21
Basic Principles of Fluorescence Microscopy
5:25
Fluorescence Microscopy Imaging
6:59
Applications
8:45
Summary