Name: Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Keşfedin patojen varyantlarının protein-protein etkileşim profillerini karşılaştırmak için Y2H ve HT-GPCA yöntemlerini kullanarak. Bu yaklaşım, yüksek güvenilirlikli veri setleri sağlar ve genotip-spesifik biyobelirteçlerin tanımlanmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Institut Pasteur fon tarafından ve Ligue Nationale contre le Kanser (hibe R05/75-129 ve RS07/75-75), Derneği pour la Recherche sur le Kanser (/ hibe ARC A09 hibe kısmen desteklenmiştir 1/5031 ve 4867) ve Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 ve ANR09 MIEN 026 01). MM bir MENRT dostluk bir alıcı oldu.

1. Maya İki melez Gösterimleri <ol><li> Aşağıdaki gerekli çözümleri olun: <ol><li> Komple Sentetik Drop Out (SD): 1 su L glukoz ile minimum SD tabanının 26.7 g çözülür. Aşağıdaki gibi elde amino asit karışımı, 2 g ekleyin 2 g Adenin hemisülfat, 2 gr Arginin HCI, 2 gr Histidin HCI, 2 gr izolösin, lösin 4 gr, 2 gr Lizin HCI, 2 gr Metionin, Fenilalanin 3 g, 2 g L -Serin, 2 gr L-treonin, 3 g Triptofan, Tirosin 2 gr, 1.2 gr urasil, 9 g Valin. </li><li> SD-L/-W/-H Out Seçici Bırak: SD belirtilenler hariç her esansiyel amino asitleri içeren (-L:-Lösin,-W:-Triptofan,-H:-Histidin). </li><li> YPGLU: 1 L, ağırlık maya özü, Bacto pepton, 10 g glukoz ve 20 g 10 g. Katı ortam için 25 g Bacto agar ile tamamlayın. </li><li> YCM: YPGLU ile aynı, ancak pH 4.5 &#39;e ayarlanır. </li></ol></li><li> Çiftleşme ve yayılan <ol><li> Ön dönüşümünün dondurulmuş alikotları kullanınpACT2 klonlanmış bir cDNA kitaplığı ihtiva ed Y187 maya suşu (eşleşme tip α). SD-L plakalar üzerinde seri seyreltme kaplama ile hücre canlılığı kontrol edin. </li><li> PGBKT7 vektörünün içine patojen ORF klon ve AH109 maya suşu (eşleşme tip a) standart bir prosedür kullanılarak, rekombinant plazmid dönüşümü. </li><li> Yayılmasını SD-W plakalar üzerinde AH109 maya pGBKT7-dönüştürdü. Nemlendirilmiş bir inkübatör içinde en az iki gün 30 ° C&#39;de inkübe edin. Levhalar 4 ° C de iki hibrit tarama kadar saklanabilir. </li><li> Patojenlerin proteinler tarafından HIS3 raportör geninin kendi kendine trans potansiyelini ortadan kaldırmak için 3-amino triazol (3-AT), HIS3 enziminin bir rekabetçi inhibitörüdür kullanın. SD-W/-H plakalar üzerinde pGBKT7-dönüştürülmüş maya büyümesini engeller 3-AT, konsantrasyonu belirleyerek otomatik aktivasyon testi yapın. </li><li> PGBKT7 dönüştürülmüş AH109 birkaç kolonileri ile SD-W Tohum 30 ml. Rotasyon ile 30 ° C&#39;de 30 saat inkübe edilir. </li><li> 30 ml, SD-W Tohum 200 miAH109 kültürlerin. 30 20 saat etrafında dönme ile inkübe ° C </li><li> 20 ml YPGLU, 30 inkübe 10 dakika ° rotasyon ile C cDNA kütüphanesi dönüştürülmüş Y187 çözülmüş inkübe edin. </li><li> 20 ° C &#39;de 3500 rpm&#39;de 5 dakika için uygun Y187 maya hücrelerinin bir eşdeğer miktara tekabül pGBKT7-dönüştürülmüş AH109 bir kültür hacmi Santrifüj Dikkatlice 10 ml YPGLU içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet geri. </li><li> Y187 içeren kütüphane ile süspanse AH109 maya karıştırın. 50 ml&#39;lik bir tüp içinde aktarın. 20 3.500 rpm&#39;de 5 dakika ° C, santrifüj dikkatlice süpernatant geri (kırılgan pelet). </li><li> YPGLU içinde tekrar süspansiyon pelet 1,5 ml toplam almak için. </li><li> Yayılmasını maya YCM-Agar 3 için 150 mm plakalar, 0.5 ml / plaka. 4.5 saat 30 ° C&#39;de inkübe </li><li> SD-L/-W/-H 10 ml bir komisyon cam kazınarak YCM plakalardan evlendirilen maya toplayın. 5 ml SD-L/-W/-H orta ve havuzlu plakalar iki kez durulayın. </li><li> 20, 3500 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj° C Süpernatant atın ve 5 ml SD-L/-W/-H ortamda maya pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Otomatik aktivasyon testinde belirlenen 3-amino triazol uygun konsantrasyonda (3-AT) ile desteklenmiş SD-L/-W/-H Agar plakaları 10 (0.5 ml / plaka) üzerine şeklindeki maya yayılır. 6-10 gün için nemli bir atmosferde 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> SD-L/-W tabakalarına şeklindeki maya süspansiyonu seri dilüsyonları 250 ul (10 -6 ila 10 -4) yayarak çiftleşme etkinliğini değerlendirmek amacıyla, diploid (2n) oranını belirlemek. İki gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. SD-L/-W yetişen kolonileri sayın ve evlendirilen maya ilk hacmi bulunan toplam diploid sayısını anlamak. Diploid oranını hesaplamak için uygun kütüphane içeren maya sayısı bu diploid sayısını bildirin. Bu, yaklaşık% 10-25 arasında olmalıdır. </li><li> 6-10 gün 30 inkübasyondan sonra ° C, taze SD-L/-W/-H olarak evlendirilen maya kolonileri + plakalar 3-AT seçin. [İpucu: sipariş maya 8 bir düzenibu] sıralama için daha sonra daha kolay olacaktır, böylece bir 96 plaka yeniden 12 kuyu şerit. Maya kolonileri ile nemlendirilmiş bir atmosferinde 30 ° C&#39;de 4-5 gün boyunca büyümeye izin verin. </li></ol></li><li> PCR ve sıralama ile his3 pozitif klonların Eleme Hedef PCR ORF seçici SD-L/-H/-W plakaları üzerinde büyüyen maya kolonileri pACT2 vektörleri içerdiği yükseltirler. <ol><li> Buz üzerinde bir 96 PCR plaka koyun. </li><li> Maya hücreleri lize etmek için, 50 ul başına iyi bir Zymolase 20T çözeltisi (10 mM HEPES tampon pH 7.7 içinde 2.5 mg / ml) ilave edilmektedir. </li><li> Yavaşça başına iyi bir koloni tekrar süspansiyon. </li><li> 37 95 ° C de ve 15 dakika ° C &#39;de 15 dakika inkübe </li><li> Buz geri plaka koyun. Çukur başına distile su 50 ul ekle. Aşağı yukarı pipetleme ve ile iyice karıştırın. </li><li> 3500 rpm ve 4, 5 dakika boyunca santrifüje ° C </li><li> PCR pACT2 vektörler cDNA&#39;dan türetilmiş ORF bölgesinin her iki tarafında tavlama primerler kullanarak bir uç tespit etmek için 10 ul yükseltmek. Protokol gExTaq polimeraz ile 96 parçalanmış maya kolonileri amplifikasyonu için iven. Aşağıdaki karışımı hazırlayın: 525 ul 10X ExTaq tampon, 420 ul dNTP karışımı (2.5 mM), 10.5 ul İleri Primer (1 mg / ml), 10.5 ul Ters Primer (1 mg / ml), 31.5 ul ExTaq (5 U / ml ) ve 3202,5 ​​ul H 2 0. 96 oyuklu bir plaka PCR oyuk başına 40 ul karışım dağıtın. De başına parçalanmış maya 10 ul ekleyin. 7 dakika için 1 dakika için 4 dakika, 72 ° C arasında ve 72 ile son ° C&#39;de 30 saniye, 60 ° C&#39;de 94 daha sonra da 3 dakika, 35 ° C döngü boyunca 94 ° C&#39;de aşağıdaki gibidir: amplifikasyon gerçekleştirin. PCR pozitif klonların tespit etmek için% 1.2 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri 3 ul çalıştırın. Kullanılarak önceden dökme 96 agaroz jel önerilir unutmayın. [İpucu: plaka birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanır ve yeni PCR için yeniden kullanılabilir] </li><li> HIS3 pozitif klonların izole PCR amplifiye parçaları dizisi. Hücresel ORF belirlemek için bir patlama analizi yapın. Düşük güven diziler (E değeri veGT, 10 -10, kimlik &lt;% 80, peptid uzunluğu &lt;20 amino asit) yanı sıra, frameshifted atılır ve dizilerini içeren erken durdurma kodonu. </li></ol></li></ol> 2. HT-GPCA için matris bina HT-GPCA hem de patojen ve konak proteinlerin geçici olarak bölünmüş Gaussia princeps&#39;in lusiferaz tamamlayıcı parçaları kaynaşmış ifade edilmiştir, bir memeli hücresi bazlı tahlil oluşturmaktadır. Ortakları arasındaki etkileşimi üzerine, bu enzim, enzim aktivitesinin ölçümü sağlayan sulandırılır. Etkileşim yoğunluğu böylece Normalize Lüminesans Oranı (aşağıya bakın ve 1 Şekil) çıkarılabilir edilir <ol start="4"><li> Host hücre taraflarının seçilmesi <ol><li> Veri kümesi güven 9 artırmak için memeli hücrelerinde daha fazla doğrulama için Y2H gösterimleri fazla üç kez tanımlanır proteinleri seçin. </li><li> Positi gibi patojen proteinlerin bilinen etkileşim ortakları eklekontrol ettik. </li></ol></li><li> HT-GPCA uygun vektörlere transfer <ol><li> Amino asitler lusiferaz N-terminuslarıyla (GL2-patojen protein füzyonları) de erimiş hümanize Gaussia princeps&#39;in 110-185 patojen proteinlerin üretilmesi için pSPICA-N2 vektörü içinde, her patojenin ORF proteini klonlama. </li><li> PCR ORF doğrudan Y2H pozitif klonların ya da başka bir bilgi ORF (insan ORFeome ikinci hücresel protein yükseltmek <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ile N-terminalinde kaynaşmış protein üretmek için) ve pSPICA-N1 vektörlerine aktarmak amino asitler hümanize Gaussia princeps&#39;in lusiferaz (GL1-ana protein füzyonları) 18-109. [İpucu: büyük ölçekli klonlama için, Ağ Geçidi klonlama sistemi önerilir. Bu durumda, PCR amplifikasyonu için, ağ geçidi uyumlu siteler ihtiva etmek üzere tasarlanmış primerler de]. </li><li> Sıra tüm ifade vektörleri. PSPICA-N1 ve pSPICA-N2 dizilerireferans 8 bulunabilir. </li></ol></li></ol> Plazmid yapıları pSPICA-N1, yani patojen protein ters çevrilerek ve ana protein pSPICA-N2 olabilir unutmayın. 3. Yüksek Verim Gaussia princeps&#39;in Lusiferaz Tabanlı Protein tamamlama Testi (HT-GPCA) <ol start="6"><li> Hücre transfeksiyonu <ol><li> Antibiyotik olmaksızın% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile DMEM 350,000 hücre / ml &#39;de Tohum 293T hücreleri. / Iyi steril beyaz kültürü plakaları 100 ul dağıtın. Tek bir deneyde 10 plakaları aşmayın. Hücreler% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 24 saat süre ile büyümesine izin. [Kriteri:. PSPICA plazmid bir SV40 kopyalama kaynağını kullanır bu yana, 293T hücreleri kullanılır ve transfekte hücreler çoğaldıktan izin verir ve böylece iki lusiferaz fragmanlarının ekspresyonu yol] </li><li> Ertesi gün, uygun olan herhangi bir transfeksiyon protokolü kullanılarak transfekte hücreler. Nu, bazı transfeksiyon reaktifler için unutmayınhücre tohumlanan mber adapte edilmesi gerekebilir. 100 ng başına kuyunun patojen ve ev sahibi ORF plazmid yapıları hem de kullanın. Transfeksiyon verimlilik için normalleştirmek için plazmid CMV-Firefly lusiferaz bir çok iyi başına Co-transfect 10 ng. Her bir nokta üç kopya halinde test edildi. [İpucu:. DNA karışımları yapışkanlı ile transfeksiyon bir gün önce yapılan ve -20 ° C&#39;de saklanabilir] </li><li> Kültür 293T hücrelerinin levhalara transfeksiyon karışımı aktarın. 293T güçlü yapışık değildir ve kolayca kuyunun dibinde ayırmak gibi, yavaşça hücreleri üzerine DNA karışımı yatırmak için dikkatli olun. % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de 24-30 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> Hücre parçalama ve Gaussia lusiferaz doz <ol><li> PBS (iyi 100 ul /) ile hücreleri yıkayın. 40 ul 1X Renilla lizis tamponu ekleyin. Karıştırma altında, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Başka bir beyaz plat hücre lizatları 10 ul kaydetateşböceği lusiferaz aktivitesinin sonraki dozaj e. 4 ° C&#39;de saklayın ya da alternatif olarak -20 ° sızdırmazlık C. </li><li> Renilla lusiferaz analiz ayıraçı 100 ul ekleyerek ve bir luminometre ile 10 saniye boyunca ışıldama sayımı ile hücre lizatları üzerinde kalan 30μl Gaussia aktivitesi ölçülür. , 96 gözlü bir levhanın bir dozaj, yaklaşık yarım saat sürer. Dondurma veya uzun süreli depolama etkileşimi-aracılı Gaussia aktivitesini etkileyebilir çünkü taze hücre özleri ile ölçüm yapın. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Ateşböceği aktivite ölçümü <ol><li> Ateşböceği lusiferaz deneme ayıracı 50 ul ekleyerek ve 10 saniye boyunca ışıldama sayımı ile hücre lizatları kayıtlı 10 ul ilgili Ateşböceği aktivitesi ölçülür. , 96 gözlü bir levhanın bir dozaj, yaklaşık yarım saat sürer. [Kriteri: ateşböceği lusiferaz dozaj dondurulmuş lizatları üzerindeki bir gün sonra gerçekleştirilebilir.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> NLR Hesaplamalar <ol><li&gt; Her etkileşim için, Gaussia lusiferaz faaliyet ve hesap transfeksiyon verimlilik ve hücre canlılığı dikkate alınarak normalize Gaussia lüminesans değeri elde etmek için Firefly lusiferaz aktivite arasındaki oranı hesaplar. Triplicates, ortalama hesaplayın. </li><li> Etkileşimi izlemek için her bir patojen-ev sahibi çifti için bir Normalize Lüminesans Oranı (NLR) tahmin ediyoruz. Bunu yapmak için, kontrol kuyuları ölçülen aktivitelerinin toplamından (referans 8 uyarlanmıştır Şekil 1) patojen ve konak proteinlerin hem varlığı tespit normalize Gaussia lüminesans aktivitesi bölün. Olumlu etkileşim için NLR kesim değeri 3,5 8 civarında olduğu tahmin edilmektedir. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> Veri analizi <ol><li> R istatistik paketi kullanılarak hiyerarşik kümeleme gerçekleştirin. İlk olarak, grup kategoride NLR veriler, daha sonra tam bir bağlantı yöntemi kullanılarak bir etkileşim dendrograma hesaplar. Bu görselleştirmekJavaTreeView 10 ile dendrogram. Bir Pearson korelasyon katsayısı ile etkileşim dendrogram ve filogenetik ağaç arasındaki mesafeyi hesaplayın. </li><li> Etkileşim ağları oluşturmak için, HT-GPCA kümesi gelen olumlu etkileşim seçin ve Cytoscape yazılım 1&#39;i kullanın. Ev sahibi proteinlerin derece ayıklamak ve ağ yerel dinamikleri erişmek için kendi dağıtım arsa. Host-patojen ağlar ana hücresel ağ patojen proteinlerin küresel etkisi bir değerlendirme sağlamak için ana interactome için yerleştirilebilir. </li><li> GO (Gen Ontoloji) veri kümesi işlevsel zenginleştirme değerlendirmek için DAVID biyoinformatik veritabanı 12 ile hedeflenen hücresel faktörler ile ilgili terimler ayıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+viruses+hijack+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li>
<li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li>
<li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+protein+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230(2008).</li>
<li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26(2012).</li>
<li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32(2008).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li>
<li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li>
<li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li>
<li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+2.8%3A+new+features+for+data+integration+and+network+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761(2012).</li>
<li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li>
<li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bağımsız, maya-iki gibi GST açılır, Lumier veya MAPPIT gibi hibrid ve memeli etkileşim deneyleri, protein-protein etkileşimleri tespit etmek için etkili araçlar olduğu kanıtlanmış, ama yanlış pozitif ve yanlış-negatif yüksek oranda sınırlıdır etkileşimler bu teknikler 15 ile ilgilidir. Ayrıca, kanıt dik yöntemleri birleştirerek elde edilen etkileşim veri kümesi 7 güvenilirliğini artırdığını büyüyor. HT-GPCA tekniğin son gelişmeler, memeli hücrelerinde ikili protein-protein etkileşimi tespit duyarlı...

Protein-protein etkileşimleri haritaları oluşturmak için toplanan verilerin artan miktarda daha fazla patojen enfeksiyonları anlamak için perspektifler açar. Patojen enfeksiyonların küresel anlayış ortaya çıkmaya başladığında, bu insan proteom 1 bağlanırken patojenler proteinlerin neden olduğu tedirginlikler aralığında erişim sağlar. Bu sayede patojenlerin konak hücre makine işlemek nasıl anlamak için bir yol sunar. Özellikle, birçok viral-host etkileşim ağlarının haritalama viral proteinler tercihen yüksek (hub) hücresel ağa bağlı, ya da bir ağ (darboğazları proteinler) 2-4 birçok yollara merkezi olduğunu ana protein hedef ortaya koydu. Bu etkileşimler bulaşıcı döl çoğaltmak ve üretmek için enstrümantal olan virüsler önemli hücresel süreçleri işlemek için izin verir. Karşılaştırmalı etkileşimleri haritalama son göre bilgileri ayıklamak amacı ile ilgili virüsler üzerinde yapılmıştırpatogenezi 4. Ayrıca, ev sahibi-patojen etkileşimleri peyzaj çalışmaları birçok patojen 5 genişletilmiştir. Hedeflenen hücre faktörler kimlik hücreleri enfekte için patojenler tarafından kullanılan stratejileri içine bilgiler sağlar ve potansiyel patojen belirteçlerin algılanmasını sağlar. Maya iki hibrid sistemi genetik tarama protein-protein etkileşimleri yüksek verimli haritalama için verimli ve hassas bir araç olduğu için ikili etkileşimleri tanımlamak için en popüler yöntemdir. Yaklaşım, böylece patojen-ana protein-protein etkileşimleri karşılaştırmalı bir bakış erişim sağlayan, birden fazla patojen gerginlik türevleri bir protein değerlendirerek bireysel Y2H gösterimleri geliştirir Burada önerilen. Bunun toplam etkileşimleri 6 yaklaşık% 20 kurtarır Dahası, maya iki hibrit tarama önemli bir sınırlama, yüksek yanlış negatif oranı yatıyor. Bu pato yalnızca bir alt kümesini ile tespit bu etkileşimleri imagens türevleri başkalarıyla algılama kaçmış olabilir. Bu nedenle, tüm iki-hibrid gösterimleri çıkan bireysel ortaklar daha karşılaştırmalı etkileşim veri setleri sağlayarak, çalışılan suşları tam yelpazesi ile etkileşim için zorlanmaktadır. Farklı yöntemler birleştirerek güçlü protein-protein etkileşimi veri setleri 7 sağlamlığını artırır olduğu gösterilmiştir, çünkü bu doğrulama HT-GPCA 8 olarak adlandırılan yeni geliştirilmiş bir protein fragmanı tamamlama analizi ile memeli hücrelerinde gerçekleştirilir. Bu hücre-tabanlı sistem Gaussia princeps&#39;in complemantasyon protein etkileşimlerinin saptanmasında lusiferaz bölünmüş ve yüksek verimli bir formatta ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmıştır sağlar. Onun lüminesans tabanlı teknoloji sayesinde ve düşük arka plan gürültü diğer floresan bazlı analiz ile karşılaştırıldığında, HT-GPCA çarpıcı yüksek hassasiyet gösterir. Genel olarak, bu yaklaşım, etkin bir teşkilkaçırma konak hücre küresel bir anlayış doğru ilk adımı temsil konak-patojen interplays kapsamlı haritalama, oluşturmak için bir araç.

<table><tbody><tr><td>Maya suşları</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimal SD baz</td><td>ABD biyolojik</td><td>D9500</td><td></td></tr><tr><td>Amino asitler</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-Triazol (3-AT)</td> <td>Acros organikleri</td><td>264571000</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase</td><td>Seikagaku</td><td>120491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponu Salin (PBS)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Renilla lusiferaz testi</td><td>Promega</td><td>E2820</td><td></td></tr><tr><td>Beyaz kültür plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu PCR plakaları</td><td>4titude</td><td>4titude 4t-i0730 / C</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör (30 &deg; C)</td> <td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü (37 & derece; C)</td> <td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>Berthold</td><td>Centro XS-LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

ana-patojen protein-protein etkileşimleri ve peyzaj karakterize etmek karşılaştırmalı bir yaklaşım

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Önemli çabalar büyük ölçekli kapsamlı protein-protein etkileşimleri ağ haritaları oluşturmak için toplanmıştır. Bu patojen-konakçı ilişkileri anlamak için etkili olup, esas olarak maya iki-hibrid sistem genetik gösterimleri ile gerçekleştirildi. Bir Gaussia lusiferaz tabanlı parçası tamamlama yöntemi ile protein-protein etkileşimleri algılama son gelişme şimdi titizlikle hücresel faktörlerin ortak bir dizi karşı farklı patojen gerginlik seçenekleri arasından proteinlerin etkileşim profillerinin karşılaştırılması gerekli bütünleştirici karşılaştırmalı interactomic yaklaşımlar geliştirme fırsatı sunuyor. Bu kağıt özellikle protein-protein etkileşimleri veri setleri oluşturmak için iki dik yöntem birleştirme programı üzerinde duruluyor: maya iki hibrid (Y2H) ve yeni bir tahlil, memeli hücrelerinde yapılan yüksek verimli Gaussia princeps&#39;in protein tamamlama testi (HT-GPCA). nt &quot;bir patojen protein hücre ortaklar&gt; büyük ölçekli bir kimlik birden fazla patojen suşu türevleri kullanılarak cDNA kütüphaneleri iki-hibrid gösterimleri çiftleşme tabanlı maya tarafından gerçekleştirilir. yüksek güven istatistiksel puanlama seçilen etkileşim ortakların bir alt kümesi daha fazla olduğunu HT-GPCA kullanarak patojen türevleri proteinlerin tüm set ile çift-bilge etkileşimleri için memeli hücrelerinde geçerli. birbirini tamamlayan iki yöntem kombinasyonu etkileşim veri kümesi sağlamlığı artırır ve sıkı bir karşılaştırmalı etkileşim analizi performans sağlar. Böyle karşılaştırmalı interactomics deşifre herhangi bir patojen-ana interplays için güvenilir ve güçlü bir strateji oluşturmaktadır.

Şekil 2&#39;de HPV E2 protein (referans 13 uyarlanmıştır) için yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları değerlendirilmesi ile gösterildiği gibi HT-GPCA önemli bir gücü, yüksek hassasiyet yatıyor. Yanlış negatif oranını belirlemek için, HPV16 gelen E2 bilinen etkileşimleri HT-GPCA (Şekil 2A) ile değerlendirildi. 18 etkileşimleri dışında dört (% 22 yanlış negatif oranı karşılık gelen) geri değildi. Yanlış pozitif etkileşimleri hücresel proteinlerin rastgele bir dizi (Şekil 2B)</s...

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı patojen varyantlarından gelen proteinlerin ortak bir hücresel faktör setiyle etkileşim profillerini karşılaştırmak için ektomik çalışmalar yürütmektir. Bu, farklı patojen varyantlarındaki proteinlerin potansiyel etkileşim ortaklarını belirlemek amacıyla, eşleşme tabanlı maya iki hibrid yöntemle cDNA taramaları yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, etkileşim ortaklarının açık okuma çerçeveleri dizilenir ve ileri doğrulama için uyumlu vektörlere aktarılır.Ardından, her iki hibrit taramadan ortaya çıkan bir dizi bireysel partner seçilir ve incelenen tüm suş yelpazesi ile etkileşimleri açısından yeniden test edilir. Sağlam karşılaştırmalı etkileşim veri setleri sağlamak amacıyla, memeli hücrelerde gerçekleştirilen ortogonal bir GIA, lusiferaz tabanlı protein fragman komplementasyon analizi kullanılarak bu işlem yapılır. Sonuçlar, elde edilen lusiferaz ölçümlerine dayanarak patojen proteinleri ile hücresel proteinler arasında farklı etkileşim yoğunlukları göstermekte ve böylece patojen-konak protein-protein etkileşimlerine dair karşılaştırmalı bir genel bakış sunmaktadır.Etkileşim profillerinin hiyerarşik kümeleme ile işlenmesi, belirli ko

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile E. coli'deki diğer faktörler arasındaki etkileşimleri izlemek için bölgeye özgü fotoçapraz bağlama ile birlikte nabız kovalama radyo etiketlemesinin kullanımını göstermektedir. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yöntemlerinden farklı olarak, bu yaklaşım, canlı bir hücredeki düzenli bir montaj yolunun yüksek çözünürlüklü "anlık görüntülerini" oluşturur.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Burada sunulan protokol, RNA dizilimi transkriptom verilerini ham okumalardan fonksiyonel analize analiz etmek için kalite kontrolü ve gelişmiş istatistiksel analitik yaklaşımlara yönelik ön işleme adımları da dahil olmak üzere eksiksiz bir işlem hattını açıklar.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Kantitatif proteomik veriler için ağ analizini gerçekleştirmek ve görselleştirmek için bir sistem biyolojisi aracı JUMPn'ı, veri ön işleme, birlikte ekspresyon kümeleme, yol zenginleştirme ve protein-protein etkileşim ağı analizi dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokolle sunuyoruz.

JUMPn: Proteomikte Protein Ko-İfade Kümelemesi ve Ağ Analizi için Kolaylaştırılmış Bir Uygulama

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Keşfedin patojen varyantlarının protein-protein etkileşim profillerini karşılaştırmak için Y2H ve HT-GPCA yöntemlerini kullanarak. Bu yaklaşım, yüksek güvenilirlikli veri setleri sağlar ve genotip-spesifik biyobelirteçlerin tanımlanmasına olanak tanır.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Daha fazla video keşfet