Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı patojen varyantlarından proteinlerin etkileşim profillerini ortak bir hücresel faktör kümesine karşı karşılaştırmak için ektomik çalışmalar yapmaktır. Bu, farklı patojen varyantlarından proteinlerin potansiyel etkileşimli ortaklarını belirlemek için CDNA'nın iki hibrit taraması olan çiftleşme bazlı maya ile elde edilir. İkinci adım olarak, etkileşimli ortaklar açık okuma çerçeveleri sıralanır ve daha fazla doğrulama için uyumlu vektörlere aktarılır.

Daha sonra, her iki hibrit taramadan ortaya çıkan bir dizi bireysel ortak seçilir ve incelenen tüm suş yelpazesiyle etkileşimleri için yeniden test edilir. Bu, sağlam karşılaştırmalı etkileşim veri setleri sağlamak için memeli hücrelerinde gerçekleştirilen ortogonal gia, lusiferaz bazlı protein fragmanı tamamlama testi kullanılarak yapılır. Sonuçlar, elde edilen lusiferaz ölçümlerine dayalı olarak patojen proteinleri ve hücresel proteinler arasındaki farklı etkileşim yoğunluklarını gösterir ve böylece patojen konak protein protein etkileşimlerine karşılaştırmalı bir genel bakış sağlar.

Etkileşim profillerinin hiyerarşik kümeleme ile işlenmesi, spesifik konak patojen etkileşimlerini patolojik özelliklerle ilişkilendirir ve patojen proteinlerinin patogenezdeki rolü hakkında fikir verir. Bu yaklaşımın patojen konak protein protein etkileşimlerini haritalayan diğer yöntemlere göre temel avantajı, çoklu suş varyantları arasında sıkı karşılaştırmalı etkileşim veri seti sağlamasıdır. Bu teknikler, bir patojen proteinin etkileşim ağı hakkında bilgi sağlar, ancak aynı zamanda tam virüsler ve nehir genetiği kullanılarak bulaşıcı bir molekül olarak diğer sistemlere de uygulanabilir, örneğin, bu protokole, yazılı protokolde açıklandığı gibi maya hücrelerinin çiftleşmesi ve yayılması ile başlayın tohum.

Patojen proteini ifade eden P-G-B-K-T yedi plazmidi ile dönüştürülmüş birkaç AH 1 0 9 maya suşu kolonisi ile triptofan içermeyen 30 mililitre seçici bırakma ortamı. Rotasyon ile 30 santigrat derecede 30 saat inkübe edin. Bir sonraki tohum, 200 mililitre seçici bırakma ortamı eksi triptofan ile 30 mililitre AH 1 0 9.

Kültürler, 30 santigrat derecede 20 saat boyunca rotasyonla inkübe edilir. Ayrıca, inkübe düşünce CDNA kütüphanesi, Y 187'yi 20 mililitre YP tutkalında rotasyonla 30 santigrat derecede 10 dakika boyunca dönüştürdü. Daha sonra, 3.500 RPM ve 20 santigrat derecede beş dakika boyunca eşdeğer miktarda canlı Y 187 maya hücresine karşılık gelen PG BK T yedi dönüştürülmüş AH 109 kültürünün bir hacmini santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve Resus damağı 10 mililitre YP tutkalı ile askıya alın. Yeniden askıya alınmış AH 109 mayasını Y 187 içeren kitaplık ile karıştırın. 3.500 RPM ve 20 santigrat derecede beş dakika santrifüjlemeden önce 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Süper dat Resus'u dikkatlice çektikten sonra, toplam 1,5 mililitre elde etmek için peleti YP yapıştırıcısında askıya alın. Daha sonra, mayayı üç YCM agar, plaka başına 0,5 mililitrede 150 milimetre plaka üzerine yayın ve 30 santigrat derecede 4,5 saat inkübe edin. Çiftleşmiş mayayı, 10 mililitre seçici bırakma ortamı eksi lösin, triptofan ve histidin içinde bir tırmık camı ile kazıyarak YCM plakalarından toplayın.

Plakayı aynı ortamdan beş mililitre ile iki kez durulayın ve santrifüjlemeyi takiben 3, 500 RPM ve 20 santigrat derecede beş dakika boyunca havuzlayın. Süpernatan ve reus'u atın. Maya peletini beş mililitre seçici bırakma ortamı eksi lösin, triptofan ve histidin içinde askıya alın.

Daha sonra çiftleşmiş mayayı, otomatik aktivasyon testinde belirlendiği gibi uygun üç amino triazol veya üç konsantrasyon ile desteklenmiş 10 plaka seçici bırakma agar eksi lösin, triptofan ve histamin üzerine yayın. Altı ila 10 gün boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra yazılı protokolde açıklandığı gibi diploid oranını hesaplayın. Maya kolonilerini toplayın ve seçici bırakmadan taze hazırlanan plakalara aktarın: agar eksi lösin, triptofan ve histidin artı üç a t.

Mayayı, 96 kuyulu bir plakayı yeniden üreterek 12 kuyucuktan oluşan sekiz şeritli bir şemada sipariş edin, böylece daha sonra sıralama için daha kolay olacaktır. Maya kolonilerinin nemlendirilmiş bir atmosferde 30 santigrat derecede dört ila beş gün büyümesine izin verin. Bu bölümün amacı, seçici bırakma agar eksi lösin, tripofan ve histidin plakaları üzerinde yetiştirilen parçalanmış maya kolonilerinin PA ct'sinde bulunan CDNA'yı PCR, amplifiye etmektir.

Xmal 20 T çözeltisinin oyuğu başına 50 mikrolitrede maya hücrelerini lyce etmek için buz üzerine 96 oyuklu bir PCR plakası yerleştirerek başlayın. Kuyucuk başına bir koloniyi nazikçe yeniden süspanse edin. Plakayı 37 santigrat derecede 15 dakika ve 95 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Plakayı tekrar buzun üzerine yerleştirdikten sonra, yukarı ve aşağı pipetleyerek kuyu karışımı başına 50 mikrolitre damıtılmış su ekleyin ve 3.500 RPM ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjlemeye devam edin. X tack karışımını metin protokolünde açıklandığı gibi hazırladıktan sonra, 96 oyuklu PCR plakasında oyuk başına 40 mikrolitre karışım dağıtın. Kuyucuk başına 10 mikrolitre parçalanmış maya ekleyin ve metin protokolünde listelendiği gibi amplifikasyon gerçekleştirin.

PCR pozitif klonları tespit etmek için PCR ürünlerinden üç mikrolitreyi %1.2'lik bir agros jel üzerinde çalıştırın. Üç pozitif klonundan izole edilen PCR amplifiye edilmiş fragmanları sıralayın. Ardından, hücresel açık okuma çerçevelerini tanımlamak için bir patlama analizi gerçekleştirin, düşük güvenilirlikli hizalamaların yanı sıra hücre transfeksiyonundan önce içeren dizilerde çerçeve kayması ve erken durdurma kodunu atın.

Antibiyotiksiz% 10 fetal sığır serumu ile% 10 fetal sığır serumu ile mililitre DMEM başına 350.000 hücrede tohum 2 9 3 T hücresi metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Gaia lusiferaz parçalarına kaynaşmış proteinler oluşturmak için patojen proteini ve hücresel protein açık okuma çerçevelerini ilgili vektörlerine aktarın. Ertesi gün% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 24 saat büyümeden önce steril beyaz kültür plakalarında kuyu başına 100 mikrolitre dağıtın. Herhangi bir uygun transfeksiyon protokolünü kullanan transfeksiyon hücreleri, hem patojenin hem de konakçının oyuğu başına 100 nanogram kullanır Açık okuma çerçevesi plazmidi, transfeksiyon verimliliğini normalleştirmek için CMV ateşböceği lusiferaz plazmidinin oyuğu başına 10 nanogram transfekt oluşturur.

Her nokta, kültürlenmiş 2 9 3 T hücrelerinin plakalarına üçlü transfer transfeksiyon karışımında test edilir. 2, 9, 3 T hücreleri güçlü bir şekilde yapışmadığından ve kuyu dibinden kolayca ayrıldığından, kuyu dibinden kolayca ayrıldığından, 37 santigrat derecede 24 ila 30 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 karbondioksit yıkama hücresi ile% 5 karbondioksit yıkama hücreleri ile hücrelerin üzerine nazikçe bırakılmasına dikkat edin. 40 mikrolitre bir x vanilya lizisi ekleyin, tamponlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Çalkalama altında, Gaia aktivitesini ölçmek için dört santigrat derece veya alternatif olarak tavan ile negatif 20 santigrat derecede depolanan ateşböceği lusiferazının sonraki dozu için başka bir beyaz plakada 10 mikrolitre hücre lizatını saklayın. Plakayı bir luminometreye yerleştirin ve hücre lizatlarına 100 mikrolitre vanilya lusiferaz tahlil reaktifi enjekte edin. Ardından 10 saniye boyunca lüminesansı sayın.

96 oyuklu bir plakanın dozu yaklaşık yarım saat sürer. Her zaman taze ekstraktlar kullanın, çünkü dondurma veya uzun süreli depolama, kalan 10 mikrolitre hücre ekstraktları üzerindeki etkileşim aracılı Gaia aktivitesini etkileyebilir. Bir luminometre kullanarak ve 10 saniye boyunca lüminesansı sayarak hücre lizatlarına 50 mikrolitre ateşböceği lusiferaz tahlil reaktifi enjekte edin.

96 oyuklu bir plakanın dozu, her etkileşim için yaklaşık yarım saat sürer. Normalleştirilmiş bir GAIA lüsinesans değeri elde etmek için Gaia lusiferaz aktivitesi ile ateşböceği lusiferaz aktivitesi arasındaki oranı hesaplayın. Transfeksiyon verimliliğini ve hücre canlılığını dikkate alarak.

Etkileşimi izlemek için üçlülerin ortalamasını hesaplayın. Her patojen konak çifti için normalleştirilmiş bir lüminesans oranı veya NLR tahmin edin. Bunu yapmak için, hem patojen hem de konakçı proteinlerin varlığında tespit edilen normalleştirilmiş GAIA lüminesans aktivitesini, kontrol kuyularında ölçülen aktivitelerin toplamına bölün.

Pozitif etkileşimler için NLR kesme değerinin önceki bir çalışmada 3.5 civarında olduğu tahmin edilmiştir. Yüksek verimli GIA ilkelerinin, protein TAMAMLAMA testinin veya H-T-G-P-C-A'nın önemli bir gücü, yanlış negatif oranı belirlemek için HPVE iki proteini için yanlış pozitif ve yanlış negatif oranların değerlendirilmesiyle gösterildiği gibi yüksek hassasiyetinde yatmaktadır. HPV 16'dan iki E'nin bilinen etkileşimleri H-T-G-P-C-A ile değerlendirildi, 18 etkileşimden dördü kurtarılmadı, bu da %22'lik bir yanlış negatif orana karşılık geldi.

Yanlış pozitif etkileşimler, rastgele bir hücresel protein setine karşı 12 HPVE iki protein kullanılarak% 5.8 olarak ölçüldü. Yöntemin güçlü özgüllüğü bu şekilde vurgulanmıştır, bu şekilde E ile etkileşime girdiği bilinen tek noktalı bir mutasyonun, hücre ortağı BRD dördüne bağlanması, NLR oranını yok ettiğini göstermektedir. Bu büyük ölçekli karşılaştırmalı ektomik yaklaşım, son zamanlarda insan papilloma virüslerinin üç erken proteinine, E iki, E altı ve E yedi, farklı genotiplerden köken alan, erken proteinlerin her biri için tropizmler ve patolojilerdeki doğal çeşitliliklerini temsil eden başarıyla uygulanmıştır.

Etkileşim profillerinin hiyerarşik kümelenmesi, çoğunlukla HPV Filogenisini özetleyerek yaklaşımın sağlamlığını ve etkileşim veri setlerinin doğruluğunu kanıtlar. Spesifik virüs konak etkileşim profillerini patolojik özelliklerle ilişkilendirmek için kullanılabilir, böylece viral proteinlerin katılımı hakkında ipuçları verir. Patogenezde, potansiyel olarak tropizm veya patojenik biyobelirteçlere karşılık gelen genotipe özgü etkileşimler çıkarılabilir.

Burada altı etkileşimli ortak için gösterildiği gibi, hücresel hedefler etkileşim yoğunluğuna göre sıralandı ve etkileşimli HPV tipine göre gruplandırıldı. Bu temsil, yalnızca onkojenik HPV'nin E altı proteini ile etkileşime giren fad gibi spesifik biyobelirteçlerin tanımlanmasına izin verir. Bu tür bir hedefleme, tüm onkojenik HPV'nin kanserojen özelliği için çok önemli olmalıdır ve bu nedenle HPV enfeksiyonu için vekil bir belirteç veya terapötik bir hedef olarak kullanılmak için iyi bir aday oluşturur.

Bu prosedürü takiben. H-T-G-P-C-A, bir biyotin etiketi ile füzyon olarak ifade edilen üçüncü bir protein ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. Bu, strep dalışı renk plakaları üzerinde üç ortak kompleksin yakalanmasına izin verir ve bu, büyük protein komplekslerinin oluşumu sorusuna cevap verebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, patojen, konakçı tencere pot etkileşimlerini nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Üçüncüsü, çoklu suş varyantlarının etkileşim ortaklarını araştırarak. İkincisi, memeli hücrelerinde olduğu gibi bir protein protein süresi kullanarak bir dizi patojen türü ile etkileşimlerini karşılaştırarak.