Kullanımı In vivo Görüntüleme Yenidoğanlar Deneysel Fare Sitomegalovirüs Enfeksiyon ilerleme Monitör

Bu prosedürün genel amacı, ışıldayan sitomegalovirüsün yayılmasını araştırmak için fare yenidoğanların in vivo görüntülemesini yapmaktır. Bu, önce virüsün uygun seyreltmesinin bir stok çözeltisinden hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonraki yenidoğanlara periton boşluğuna ışıldayan MCMV enjekte edilir.

Enjeksiyondan sonraki zaman noktalarında. Yavrular in vivo görüntülemeden önce uyuşturulur ve Lucifer enjekte edilir. Sonuç olarak, in vivo görüntüleme, virüsün periton boşluğu ve merkezi sinir sisteminde replikasyonunu ve yayılmasını göstermek ve ölçmek için kullanılır.

Bu tekniğin, enfekte hayvanların ötenazisinden sonra organlarda viral filtrasyonlar gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, daha az zaman ve daha az kaynak tüketilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Mr.Il Macan olacak. Aşağıdaki çalışmada Ulrich Kowski laboratuvarından elde edilen Lusiferaz eksprese eden bir MCMV suşu kullanılmıştır.

Suşu amplifiye etmek için, virüsü 37 santigrat derecede serum serbest ortamda kültürlenmiş hücrelere ekleyin. Bir saat sonra, süpernatanı çıkarın ve% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmiş DMEM ile değiştirin. Beş gün sonra kültür hasat edilir ve alikotlar eksi 80 santigrat derecede saklanır.

Daha fazla kullanıma kadar. Viral süspansiyonu plak tahlili ile titre ettikten sonra, numuneyi 50 mikrolitre DMEM'de 50 pfu'ya seyreltin ve dört ila 20 saatlik yenidoğanlarda kullanıma hazır enjeksiyonlar yapılana kadar buz üzerinde bırakın. Yavruları tutmadan önce, çöpü ve dışkıyı eldivenli ellerle manipüle edin.

Anneyi bir uygulama enjeksiyonu yapmaya zorlayabilecek yabancı kokuların yayılmasını önlemek için, bir insülin şırıngasını DPBS'de seyreltilmiş% 1 metilen mavisi ile doldurun. Hazır olduğunda, yenidoğanı ventral tarafı yukarı bakacak şekilde burada görüldüğü gibi sırt derisinden tutun. İğneyi dört bacağın altına sokun ve nazikçe deri altından periton boşluğuna itin.

İğne ucu doğru konuma geldiğinde, metili mavi renkte enjekte edin. Ardından, iğneyi yavaşça geri çekin ve enjeksiyon bölgesindeki kanı silin. Başarılı bir uygulama enjeksiyonundan sonra yenidoğanı enjeksiyondan sonra ev kafesine geri koyun, bu işlemi daha önce hazırlanan viral süspansiyon ile tekrarlayın.

Görüntüler enjeksiyondan yedi gün sonra alınır ve yenidoğanlar daha önce gösterildiği gibi dikkatli bir şekilde ele alınır. 12 ila 15 dakika beklerken her birine anestezik ve Lucifer karışımı enjekte edin LUCIFERIAN'ın maksimum emisyonuna ulaşması için, doğru vücut sıcaklığını korumak için görüntüleme cihazının alım odasındaki platformun ısıtıldığından emin olun. Yavrular uyuşturulduktan ve tanımlama için etiketlendikten sonra görüntüleme sistemine yerleştirilmeye hazır hale gelirler.

İlk olarak, tüm vücut tarafından yayılan ışığın edinimini gerçekleştirin. Virüs birkaç hedef organda çoğaldığından, maruz kalma süresi kısa olmalıdır. Burada, alım 10 ila 20 saniye boyunca gerçekleştirilir.

Bir edinme turunda birkaç hayvanın düşük çözünürlüklü görüntülerini elde etmek ve ardından diseksiyonu takiben belirli bir hayvanın veya izole edilmiş bir organın bir kısmına odaklanmak için platformu yaklaştırmak yararlıdır. Sadece kafadan bir ışık sinyali almak için, vücudun geri kalanını fotonları maskeleyecek kalın, koyu renkli bir kağıtla örtün, beş ila 10 dakika boyunca alım yapın ve bunu hayvanın karşı tarafı için tekrarlayın. Aynı koşullar altında.

Görüntülemeden sonra, anestezi altındayken vücut ısılarını korumak için yavruları ısıtılmış bir kafese geri koyun. Bu görüntüler enfeksiyondan sonraki 7, 9, 11 ve 14. günlerde çekildi, hayvandaki genel viral titre zamanla azalıyor gibi görünüyor. Bu örnekte, vücut örtülür ve baş açıkta bırakılır.

Bu, sol kulak seviyesinde, yoğunluğu yedi ila 14. günler arasında artan gizli bir noktayı ortaya çıkarır ve MCMV'nin beyne yayılmasının in vivo olarak dinamik olarak gözlemlenebileceğini düşündürür. Bu prosedürü takiben, virüsün beyindeki kesin yeri hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.