Name: Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Öğrenin yetişkin Danio rerio beyninde morfolino oligonükleotidlerle gen ekspresyonu manipülasyonu. Bu hızlı ve verimli serebroventriküler mikroenjeksiyon tekniği, radyal glial hücreleri hedefleyerek nörogenez ve beyin fonksiyonu çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) ve Avrupa Birliği (ZF-Sağlık) tarafından desteklenmiştir.

1. Enjeksiyon Karışım hazırlanması <ol><li> Hücreleri daha etkin, normal morfolino molekülleri daha onları içselleştirmek gibi in vivo morpholinos kullanın. Ayrıntılar için üreticinin bilgi (: Reaktifler ve Malzeme Tablo 1) Bkz. </li><li> Enjeksiyon doğruluğu görselleştirmek için bir floresan boya izleme (örneğin CellTracker Kırmızı CMTPX, Invitrogen) kullanın. Bu boya, hücre metabolize olur ve yalnızca alımından sonra hücre içinde floresan olur. Bu nedenle, bu adım, verimli bir şekilde cerebroventricular mikroenjeksiyon tarafından hedeflenen hücrelerin belirlenmesi için çok önemlidir. </li><li> Hazırlama fosfat-tamponlu salin (PBS) (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) ile seyreltilmesi için morfolino. Morfolino çözeltinin bir seyreltme gerekli ise, her PBS kullanın. </li><li> Morfolino çözeltisi 9 ul ve th 1 ul ekleyerek enjeksiyon karışımı 10 ul hazırlanmasıE hücre izci boya (seyreltilmiş veya sulandırılmamış morfolino çözüm stok konsantrasyonu 500 mcM olan 22 morfolino birkaç farklı dozlarda göstermektedir Daha önceki sonuçları -.. 50 mcM 500 mcM kadar - etkin gelen demonte farklı düzeylerde sonuç hypomorphic fenotipleri için demonte). Çözeltinin 1 ul bir zebrabalıkları beyin içine enjeksiyon için yeterlidir. </li><li> İyice karıştırın ve enjeksiyon kadar oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> 2. Enjeksiyon Aparatı hazırlanması <ol><li> Bir iğne çektirmenin kullanarak cam enjeksiyon kılcal hazırlayın. Isıtma döngüsü Değeri: 463, döngü değeri çekme: 230, hız: 1.5 sn, saat: 75 msn aşağıdaki parametreleri kullanın. </li><li> Basınç kaynağı açın ve 50 psi veya 3,5 bar basınç ayarları yapın. </li><li> Aşağıdaki gibi mikroenjektör ayarlarını: basıncı 20 psi, çıkarma basıncı 10 psi, yolluk 2.5 ve 100 msn aralık döneminde değer tutun. </li><li> Çevirmekhalka aydınlatıcı ve mikroskop sahne üzerinde halka bulun. </li><li> Mikroskop yanında uygun bir konuma kılcal tutucu yerleştirin. </li><li> Tutucu içine kılcal cam yerleştirin. 45 derece için enjeksiyon açısını ayarlayın. </li><li> Ince uç forseps kullanarak kılcal cam ucu koparmak ve orifis gelen basınç çıkışı kalibre. Bu balık suyu içine iğne ucu çeker ve sürekli bir basınç darbesi verilerek test edilmelidir. Ortaya çıkan hava kabarcıkları optimum basınç / delik boyutlu bir göstergesidir sadece bir satır, olmalıdır. Bu kalibrasyon gösterilmesi için video bakın. </li><li> Hava kabarcıkları yakalama olmadan enjeksiyon çözüm kılcal cam yükleyin. </li><li> Kılcal cam ve yüklü enjeksiyon çözüm ucu arasındaki hava kaldırmak için basınç uygulayın. </li></ol> 3. Anestezi <ol><li> Etil-- anestezik stok solüsyonu (% 0.1 MESAB hazırlayınm-aminobenzoat metansülfonat). </li><li> Su yeterli miktarda plastik fare kafesleri veya diğer taşıma kabı içine tanklarından balık istediğiniz numarayı çıkarın. </li><li> Anestezik stok çözeltisi, 5 ml balık 200 ml su içinde karıştırılarak küçük bir plastik kutu içinde anestezi çözeltisi hazırlayın. Anestezik nihai konsantrasyon: 0.0025% (v / v). </li><li> Anestezik bir plastik Petri kabı Yarım doldurun. Enjeksiyonlar için bu çanak kullanın. </li><li> Balık Subdues kadar anestetik balık inkübe edin. </li></ol> 4. Kesi ve Cerebroventricular Mikroenjeksiyon <ol><li> Bir balık net kullanarak kutusundan balık çıkarın ve Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> Yavaşça biraz aşağı tenteli bir şekilde forseps ve yönlendirmek kafa ile balık tutun. Bu kesi kolaylaştıracaktır. </li><li> 30 göstergesi dikenli sonu iğne kullanılarak kafatası küçük bir yarık oluşturun. Iğne sadece uç kullanımı ve daha fazla nüfuz etmezyeterince bu gibi beyin içine beyin dokusunda hasara neden ve kanama olarak tezahür edecek olacaktır. </li><li> Balık tutma tutmak ve camın ucu kesi sitesi üzerinden kılcal yerleştirin. </li><li> Orient cam ucu telencephalon doğru kılcal. Bu doku hasarı oluşturur ve aynı zamanda enjekte çözeltisinin dispersiyon engeller gibi beyin dokusu dokunmaktan kaçının. </li><li> Çözüm enjekte edilir. Sıvı ilaç uygulandıktan hemen sonra dağılır. </li></ol> 5. Kurtarma ve Enjeksiyon Doğruluk Analizi <ol><li> Taze balık su ile bir plastik kutu içine enjeksiyon kurulum ve yerden balık çıkarın. </li><li> Kurtarma sağlar. </li><li> Kısa bir süre 0.0025% MESAB ile balık tekrar uyuşturan ve floresan mikroskop altında balık kontrol edin. Kırmızı floresans esaslı bir dağılım sıvısı enjekte yaygın dağılımının bir göstergesidir. </li><li> Plastik kutu geri balık koyun. </li><li> T plastik kutu bağlayındaha uzun süreler için oksijen balık ve korumak için o dolaşım sistemi. </li><li> Bu türden davranış analizi gibi arzu edilen amaçlar için kullanımı balık ya da daha fazla analiz (histolojik boyamalar, immünositokimya, vb) için doku örneklerinin hazırlanması için enjeksiyondan sonra istenilen zaman noktalarında, hayvanlar kurban. 9,11,17-20,24-27: Aşağıdaki referanslar yetişkin zebrafish beyin analiz nasıl örnekler vermek. (% 50&#39;den fazla demonte) etkin bir demonte gözlemlemek için en hızlı zaman bizim çalışmalarda 22, 12 saat oldu. </li></ol> 6. Önerilen Bilimsel Kontrolleri <ol><li> Bir negatif kontrol olarak herhangi bir fenotip neden gerekiyordu olmayan bir uyumsuzluk morfolino molekül kullanın. Ilgi her gen için ya bir standart morfolino molekül ya da özellikle tasarım morfolino denetimlerini kullanın. Buna ek olarak, mism arasında spesifik olmayan etkileri ya da toksisiteyi değerlendirmek üzere bir başka negatif kontrol olarak (bu durumda, PBS içinde) çözücü maddelermorfolino enjeksiyon / kontrol atch. </li><li> PCNA morpholinos pozitif kontroller daha önce 22 açıklanan kullanın. Bu morfolino yetişkin zebrafish beyin (enjeksiyon 1 gün içinde 75-95% demonte verimlilik) 22 etkili demonte neden olur. </li></ol>

<ol><li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStocum%2C+D+%22Regenerative+Biology+and+Medicine%22">Regenerative Biology and Medicine</a>. , Academic Press. London. (2006).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+for+brain+repair%3A+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Evol%22%5BJournal%5D)">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li>
<li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li>
<li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , In Press (2013).</li>
<li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKempermann%2C+G+%22Adult+Neurogenesis+2%3A+Stem+Cells+and+Neuronal+Development+in+the+Adult+Brain%22">Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain</a>. , 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford. (2010).</li>
<li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li>
<li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li>
<li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li>
<li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li>
<li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li>
<li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li>
<li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum%3A+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li>
<li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li>
<li>März, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li>
<li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li>
<li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroventricular+microinjection+%28CVMI%29+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395(2011).</li>
<li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vivo-Morpholinos%3A+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27(2012).</li>
<li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li>
<li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020(2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz burada açıklamak yöntem yetişkin zebrafish beyin içine morpholinos kolay ve hızlı yönetim sağlar. Biz enjeksiyon yöntemi verimli ventriküler hücreleri ve nöron yanıt olarak fonksiyonel önemi ile sonuçlanır gen ekspresyonu bloke olduğunu göstermiştir. Cerebroventricular mikroenjeksiyon yürütülürken hakkında dikkatli olmak önemli nokta vardır. Örneğin, morfolino moleküllerin etkisi kullanılan konsantrasyona bağlıdır. Bu konsantrasyon, son kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Biz standart embriyo enjeksiyon protokolleri 28-30 kullanarak embriyo içine enjeksiyon ile ön test için ideal stok solüsyonu ile başlayan (500 mcM) ve seri dilüsyonları performans tavsiye ve. Daha önce, 50 uM ila 500 uM arasında değişen 22 konsantrasyonda morpholinos demonte verimliliği farklı seviyelerde elde edilmiştir. İkinci olarak, kılcal cam menfez larg olmamalıdırBu e enjeksiyondan sonra beyin içine kapsamlı sıvı akını yol açacaktır. Bu yeterli enjeksiyon önleyecek şekilde Benzer şekilde, açılış çok dar olmamalıdır. Bir su ile bir Petri kabı içine hava pompalayarak en uygun orifis basınç kombinasyonu belirleyebilirsiniz. Ortaya çıkan kabarcıklar ancak birden çok satır tek bir satır olmalıdır. Bu video bu göstermektedir. Üçüncü olarak, anestetik balık kuluçka kritiktir. Balık anestetik 2 dakika daha uzun bir süre tutulması gerekir. Bu enjeksiyondan sonra iyileşme oranı engel olacaktır. Dördüncü olarak, kesi yerini iyice enjekte sıvı dağıtma için önemlidir. Optik tectum üzerinde ventriküler bölge orta hat üzerinde büyük ve yanal dar alır. Bu nedenle, deneyci orta hatta kafatası yakın yarık oluşturmak gerekir ve telencephalic bölgeyi kapsayan kafatası plaka sadece kaudal. Cerebroventricular injectio avantajlarından biri,n (CVMI) yöntemi, sürat olduğunu. CVMI gen fonksiyonu tahlil için hızlı bir yöntemdir. Genellikle birkaç ay sürebilir fonksiyonel çalışmalar için, transjenik nesil ile karşılaştırıldığında bu özellik önemlidir ve yararlıdır. Buna ek olarak, CVMI enjekte sıvının homojen dağılımına yol açar ve bu nedenle fokal enjeksiyon ya da elektroporasyon ile karşılaştırıldığında gen aktivitesinin nispeten daha ayrıntılı bir düzenleme sağlar. CVMI ile, birden fazla gen enjeksiyon hazırlama birden morpholinos oligonükleotid içeren karışımları aynı anda nakavt olabilir. CVMI belirli bir morfolino oligonükleotid farklı konsantrasyonda enjekte etmek ve bu nedenle hypomorphic fenotipleri analiz etmek için de kullanılabilir kullanılabilir. Son olarak, bu enjeksiyon paradigma toksisite neden ya da hayvanların hayatta kalma ödün vermez. CVMI teknik, düzenleyici peptidler, uyuşturucu, plazmid DNA veya RNA düzenleyici mo enjeksiyon gibi çalışmaların diğer tip için genişletilmiş olabilirhücre fizyolojisi etkileyebilecek lecules ya da diğer maddeler. Moleküllerin kombinasyonu Assaying ve doz cevap analizleri yapmak mümkün hypomorphic fenotipleri eğitim sağlayan, bizim yöntem kullanıyor. Bu özellikleri ile, CVMI yetişkin zebrafish beyinde ifade çalışmalar için hızlı ve kolay bir test olduğunu kanıtlıyor, ve hızlı tarama ve fonksiyonel analiz açılır. Yetişkin Zebra balığı Beyin yapısal olarak tüm rostro ekseni boyunca yeni nöronlar üretebilir ve aynı zamanda travmatik yaralanmalar sonra yeniden oluşturabilirsiniz. Bu sınırlı nöron ve hiç değilse, oldukça kötü rejeneratif kapasiteli memeli beyinlerine tezat olduğunu. Bu yaygın kök hücre aktivitesi ve iyileşme yeteneği şu anda büyük ölçüde bilinmemektedir merkezi sinir sistemi rejenerasyon için gerekli olan moleküler programları, anlamak için yararlı bir model organizma Zebra balığı yapar. Bu nedenle, ze olan rejeneratif yetenek moleküler temeli soruşturmabrafish beyin balık ve memeli beyin bir yaralanma sonrası tepki, hem de insanlarda rejeneratif tıp tedavileri için yollar bağışlamak nasıl temel bir fark açıklayabilir araştırma ilginç bir alemdir. Onlar nörojenik ataları 3,8,20 gibi omurgalı beyin plastisite ve yenilenme moleküler altyapı anlamak için, glial hücreler önemli bir araştırma alanı olarak hizmet vermektedir. Böylece, Zebra balığı beynin radyal glial hücrelerde gen fonksiyonu değiştirmek için CVMI tekniği kullanarak açıklık vesile ne kadar balık beyin verimli yetişkin nöron ve rejeneratif yanıt çift progenitör aktivite yapabilirsiniz. Biz son zamanlarda yetişkin zebrafish beyin 24,26,27 ve rejeneratif nöron yanıt olarak çeşitli faktörler ve sinyal yolları katılımı ve ihtiyaç göstermiştir ve bu çalışmaların CVMI yöntemi kullanılarak mümkün yapılmıştır. Genel olarak, biz Zebra balığı beyin kazanç bilgi regene dayatmaya harnessed olabiliryaralanma tepki ve dolayısıyla insan nörolojik bozukluklar ve akut yaralanmalar için klinik tedavi tasarımı yardımcı olacaktır memeli glial hücreler için rative yeteneği.

Yetişkin nöron omurgalı için ortak bir özelliktir, ancak sıklığı ve verimlilik derecesi filogeni 1,2,3,4,5,6 göre değişir. Teleost Zebra balığı, tüm beyin 4,5,9,10 on altı farklı kök hücre etki ve ilişkili nörojenik bölümü içeren iken Örneğin, yetişkin memeli beyin büyük ölçüde ön beyin 7,8, sınırlı kök hücre bölgeleri içerir. Memeliler ve Zebra balığı arasındaki bu farklılık kök hücre bakım ve progenitör hücrelerin nörojenik kapasitesinin mekanizmalarında bir eşitsizlik yansıtıyor olabilir. Zebra balığı beyin tarafından kullanılan moleküler mekanizmaları insanlarda nörodejeneratif hastalıkların üstesinden gelmek için tedavi uygulamaları için harnessed olabilir gibi beyindeki nöronlar üretmek için Zebra balığı yaşam boyu yetki de klinik etkileri oluşturabilir. Yetişkin Zebra beynin birçok kök hücreleri bölgeleri analiz edilmiş ve gösterilmiş olduğuBu bölgelerin ventriküler yüzeyi astar hücreleri progenitör hücrelerin 9,11-20 olarak hizmet vermektedir. Zebrabalıkları telencephalon Detaylı analizler, örneğin, nörojenik ataları 19, 20 olması için bu beyin bölgesi içinde, ventriküler yüzey tasvir radyal glial hücreler, tespit edilmiştir. Bu, beyincik ve nöroepitelyal hücrelerin nörojenik giriş 16,21 sağlamak ventricularly-bulunan optik tectum, diğer bölgeler için de geçerlidir. Bu amaçla, yetişkin zebrafish beyinde yaygın nörojenik yetkinlik düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak progenitör hücrelerin gen ifadesinin manipülasyonu gerektirir. Çeşitli yöntemler, daha önce zebrabalıkları modüle gen fonksiyonu için tarif edilmiştir. Bunlar, elektroporasyon veya kimyasal muamele ile birleştirilmiş tek bir protein, plazmid bazlı odak enjeksiyon arzu edilen varyantlar ifade koşullu transjenik nesil içerir. Daha önce, bir dizaynyetişkin zebrafish ön beyin 22 ventriküler hücrelerinde modüle gen fonksiyonu hızlı ve etkili bir yol olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon kullanarak yetişkin zebrafish beyin içine morfolino oligonükleotidler veya protein gibi çeşitli maddeler yönetmek için yöntem. Çalışmalarda, in vivo morpholinos çünkü kovalent gibi elektroporasyon 23 gibi ekstra permeabilization için gerek kalmadan ilgi hücreleri etkin dağıtım sağlayan zengin teslim peptidler, arginine bağlantılı morfolino molekül içeren kendi kimya kullanılmıştır. Bu enjeksiyondan sonra istenilen doku tam hedefleme, sadece biz yetişkin zebrafish telencephalon 22 gözlenen ne gibi olanak sağlayacak. In vivo morpholinos kullanımı bu yüzden, elektroporasyon veya DNA moleküllerinin odak enjeksiyon olarak hedef doku arasında zaten var olan yöntemler daha üstündür. Burada, biz bu işlemi gerçekleştirmek ve bir sağlamak nasıl görsel olarak göstermekadım adım protokolü. Biz enjeksiyon karışımı ve enjekte ve enjeksiyon cihazı kurmak nasıl göstererek devam edilecek balık hazırlanması açıklayan ile başlar. Biz mikroenjektör kullanarak morpholinos bir kafatası ve enjeksiyon bir kesi üreten içerir cerebroventricular enjeksiyon yöntemi, bir açıklama sağlar. Ayrıca kritik noktaları optimizasyonu veya sorun giderme olarak belirterek tüm prosedürü sırasında dikkatli olması gerekir, ayrıntılı.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>C34552</td><td>Enjeksiyon doğruluğunu ölçmek için 1:100 seyreltmede kullanın</td></tr><tr><td>MESAB (etil-m-aminobenzoat metansülfonat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Balığın uyuşturulması için</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Sarstedt</td><td>821,472</td><td>Balıkları işlemek için enjeksiyon ve görüntüleme sırasında</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td>Steril seyreltme ortamı olarak</td></tr><tr><td>Vivo morpholinos</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>özelleştirilmiş Vivo</td><td>morpholinos hakkında daha fazla bilgi: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Dikenli uçlu iğne</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td>Kafatasında kesi oluşturmak için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Üreticiye göre değişir</td><td>Parçası tüm enjeksiyon kurulumu</td></tr><tr><td>Dumont Cımbız</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>501985</td><td>Cam kılcal damarın ucunu koparmak için</td></tr><tr><td>Floresan kamera</td><td>Zeiss, Nikon, Leica</td><td>Üreticiye göre değişir</td><td>Enjeksiyondan sonra floresansı görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Gillies Diseksiyon Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501265</td><td>Balıkları yerinde tutmak için</td></tr><tr><td>Cam enjeksiyon kılcal damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>TWF10</td><td>Mikroenjeksiyon için</td></tr><tr><td>PicoNozzle kiti (mikroenjektör tutucu)</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>5430-12</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>için Pnömatik PicoPump (mikroenjektör)</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>SYS-PV820</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Halka aydınlatıcı için; Halka Işık Kılavuzu</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td>Numuneyi aydınlatmak için</td></tr></tbody></table>

morfolino oligonükleotidler bir cerebroventricular mikroenjeksiyon kullanarak yetişkin zebra balığı beyin gen İfade mikromanipülasyon

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Dokularda gen manipülasyonu fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için gereklidir. Bu yazıda, biz yetişkin zebrafish beyinde gen ekspresyon modüle için bir araç olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon (CVMI) tekniği göstermektedir. CVMI kullanarak, maddeler cerebroventricular sıvısı içine tatbik edilebilir ve iyice beyin rostro ekseni boyunca dağıtılabilir. Biz özellikle in vivo gen aşağı vurma için güçlü araçlardır antisens morfolino oligonükleotidler, kullanımı üzerine odaklanır. Bizim yöntemde, uygulandığında, morfolino molekülleri ventriküler yüzeyi kaplayan hücreler tarafından alınır. Bu hücreler, nörojenik progenitörlerin olarak hareket radyal glial hücreler bulunmaktadır. Bu nedenle, radyal glial hücreler gen ifadesinin aşağı vurma zebrafish yaygın nöron yanıt analiz etmek büyük önem taşımaktadır ve aynı zamanda omurgalı yetişkin neurogen sürdürmek nasıl fikir sağlayacakyovasküler yanıt. Böyle bir anlayış, insan nörodejeneratif hastalıklar ve merkezi sinir sisteminde rejenerasyon klinik uygulamalar için çabalarını yardımcı olacaktır. Böylece, gen ifadesi ve yetişkin zebrafish ön beyin nöron yanıt değiştirmek için hızlı ve verimli bir şekilde olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon yöntemi mevcut. Ayrıca CVMI işlemi yürütmek için nasıl sorun giderme ipuçları ve diğer yararlı bilgiler sağlar.

Cerebroventricular mikroenjeksiyon enjekte çözüm yaygın dağıtım yol açar Şekil 1&#39;de tasvir cerebroventricular mikroenjeksiyon iş akışı ve teknik düzeni kullanarak, yetişkin zebrafish beyin içine morfolino oligonükleotidler uygulandı. Doğru bir enjeksiyon protokol ventriküler yüzey (Şekil 2A) yakın hücre hedefleme beyin ve verimli boyunca enjekte edilen sıvının dağılmasına yol açar. Kılcal cam beyin dokusu delip iğneleri, enjeksiyon noktasında (Şekil 2B) de yoğun bir floresan sinyali olacaktır. Enjeksiyon miktarı yeterli değilse, zayıf floresan sinyali (Şekil 2C) gözlenecektir. Cerebroventricular mikroenjeksiyon yetişkin zebrabalıkları beynin ventriküler bölgede gen ekspresyonu devrilmesi için kullanılabilir Biz th göstermiştirin vivo morpholinos da ventriküler iç yüzeyine bir kaç hücre çapları nüfuz edebilir ve bu nedenle etkin ventriküler hücreleri (Şekil 3A, 3B), hedef olabilir. Morfolino enjekte edilmesi, bu da protein (Şekil 3C, 3D &#39;de gösterildiği gibi bir örnek olan PCNA) üretimini azaltmak gibi portatif gen ekspresyonu olabilir. Biz daha önce bu tekniği kullanarak genleri aşağı vurma yetişkin nöron (Şekil 3E, 3F) veya rejenerasyon yanıt (Şekil 3G, 3H) sırasında fonksiyonel sonuçlara yol açtığını göstermiştir. Biz verimli demonte aralığı (% 50&#39;den fazla demonte) morpholinos 22 enjeksiyonundan sonra yaklaşık 12 saat elde edilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca verimli demonte süresi yaklaşık 5 gün PCNA protein 22 için enjeksiyon sonrasına kadar olduğu görülmektedir. % 70&#39;den fazla demonte 3 gün enjeksiyon 22 sonrasına kadar görüldü. Demonte eğrileri bağımlı o vardırn endojen proteinler ve morfolino moleküllerin verimliliği ifade seviyesini ve deneyi tarafından her gen için belirlenmelidir. Çalışmalarda, biz morfolino moleküllerin yönetimi yerel ve sistemik toksisite neden olmaz muhtemelen CVMI işlem, hayvanın hayatta kalma ödün görmedim. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Şekil 1. Cerebroventricular enjeksiyon tekniği şematik. (A), enjeksiyon optik tectum seviyesini (OT, 2), yetişkin zebra balığı (1) ait olan dorsal gerçekleştirilir. Bir kesi bir 30-gauge iğne (3) ile optik tectal kafatası plaka üzerinde yapılır. Cam kılcal kullanarak, morfolino molekülleri ventriküler sıvısı (4) içine enjekte edilir. Kapsamlı bir dispersiyonu olan bir(5) hemen chieved. (B), kanül ve dikenli uç yüksek büyütmede gösterilmiştir. (C) insizyon iğne yönlendirilmesi. (D) kesi daire ve kesik çizgilerle gösterilmiştir. (E) gösterilen ve enjeksiyonu yapılır olarak kılcal enjeksiyon yer alır. Tüm paneller ref adapte edildi. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Şekil 2. Enjeksiyon verimlilik ve doğruluk ile karşılaştırılması. (A) iyi bir enjeksiyon ventriküler yüzeyine yakın hücrelerin hedef yol açar. Kılcal cam beyin dokusu içine takılırsa (B), bu merkezi bir floresan sinyal üretecektir. (C </strong&gt;) enjeksiyon miktarı düşükse, bu zayıf floresan sinyal yol açacaktır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Şekil 3,. . GFP pozitif çekirdekler gösteren transgenik hattı: morfolino penetrasyon, gen hakemin ve fonksiyonel sonuçları verimliliği (A) GFP kontrol telencephalic kesitleri Tg (GFP H2A) morfolino-enjekte üzerinde immün. GFP pozitif çekirdekler gösteren transgenik hattı: (B) GFP Tg (GFP H2A) morfolino-enjekte GFP antisens en telencephalic kesitleri üzerinde immün. Ventriküler bölgede GFP sinyali arasındaki farkı dikkat edin. v: ventrikül. (C) PCNA kontrolü morfolino enjeksiyonlu PCNA pozitif hücrelerin yaygın dağılımını gösteren beyinleri üzerinde immün. ( <strong&gt; D) PCNA bu CVMI yapabilirsiniz demonte endojen genleri gösteren, PCNA pozitif hücrelerin önemli ölçüde azaltılmış miktarda gösteren PCNA antisens morfolino enjeksiyonlu beyinleri üzerinde immün. (E) BrdU ve HUC / D kumanda üzerindeki immün morfolino-enjekte beyinleri 22 önce açıklanan bir BrdU darbe-kovalamaca deney sonra yeni doğan nöronlar belirlemek için. (F) BrdU ve HUC / D 22 önce açıklanan bir BrdU darbe-kovalamaca deney sonra yeni doğan nöronlar belirlemek için PCNA antisens morfolino-enjekte beyinleri üzerinde immün. (G) Knocking aşağıya PCNA CVMI fonksiyonel sonuçlar doğuran demonte endojen gen için kullanılabileceğini gösteren, yeni doğan nöron üretimi önemli bir azalmaya yol açar. Tüm paneller ref adapte edildi. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Bu yazıda, morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak yetişkin zebrabalıkları telencephalon ventriküler hücrelerde gen ifadesinin manipülasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz, yetişkin omurgalı beynin fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir hızlı ve verimli protokolü olarak bu yöntem sunuyoruz.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin zebra balığı beyninin serebral ventrikülüne morfo oligonükleotidleri mikroenjeksiyon yoluyla zerk etmek ve radyoglial hücrelerdeki genlerin aktivitesini baskılamaktır. Bu işlem, öncelikle zebra balığının anesteziye alınmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tırtıklı bir diş iğnesi kullanılarak, optik tümörün üzerindeki kafatasında bir yarık oluşturulur.Ardından, morfo çözeltisi insizyon bölgesinden serebral ventriküler sıvıya enjekte edilir. Son olarak, enjeksiyonun verimliliği ve doğruluğu floresan mikroskobu altında kontrol edilir. Nihayetinde, morfo aracılı gen susturma yoluyla erişkin zebra balığı beynindeki radyal glial hücrelerde hedeflenen genlerin protein üretiminin oldukça verimli ve yaygın bir şekilde engellendiği sonuçlar elde edilebilir; bu durum histolojik kesitler ve immünohistokimyasal boyamalar ile analiz edilebilir.Bu tekniğin, transgenik yaklaşımlar veya elektroporasyon tabanlı iletim yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, CVMI'nın daha az zaman alması ve radyal glial hücrelerin tüm popülasyonunu hedeflemede daha verimli olmasıdır. Bu yöntem ayarlanabilirle ve aynı anda birçok gen susturulabilir. Enjeksiyon karışımını hazırlamak için 500 µM'lık bir Morpho stok çözeltisi hazırlayarak başlayın.10 enjeksiyon için PBS kullanarak, dokuz mikrolitre seyreltilmiş veya seyreltilmemiş morpho solüsyonunu bir mikrolitre floresan izleme boyası ile birleştirerek 10 mikrolitre enjeksiyon karışımı hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Cam enjeksiyon kapilerlerini aşağıdaki parametrelere göre hazırlamak için bir iğne çekici kullanın.Basınç kaynağını açın ve basınç ayarlarını 50 PSI veya 3,5 bar değerine getirin. Mikro enjektör ayarlarını şu şekilde düzenleyin: Tutma basıncı (Hold pressure) 20 PSI, püskürtme basıncı (eject pressure) 10 PSI, periyot değeri 2,5 ve 100 milisaniye.Gating aralığı. Halkalı aydınlatıcıyı açın ve halkayı mikroskop tablasının üzerine yerleştirin. Kapiler tutucuyu mikroskobun yanındaki uygun bir konuma yerleştirin.Cam kılcal boruyu tutucuya yerleştirin ve enjeksiyon açısını 45 dereceye ayarlayın. İnce uçlu pens kullanarak cam kılcal borunun ucunu kırın ve orifisten gelen basınç çıkışını kalibre edin. İğnenin ucunu balık suyuna daldırıp sürekli bir basınç darbesi uygulayarak, hava kabarcıklarının optimum basıncı veya orifis boyutunu belirten tek bir sıra oluşturmasını sağlayın.Cam kılcal boruyu enjeksiyon çözeltisiyle doldurun. Hava kabarcığı oluşmasını önleyerek, cam kılcal borunun ucu ile doldurulan enjeksiyon çözeltisi arasındaki havayı gidermek için basınç uygulayın. Anestezik meab'ın %0,1'lik stok çözeltisini hazırladıktan sonra, istenen sayıda balığı balık suyu içeren bir taşıma kabına aktarın.200 mililitre balık suyu ile beş mililitre MISP stok çözeltisini karıştırarak anestezi çalışma çözeltisini hazırlayın. Enjeksiyonlarda kullanmak üzere bir Petri kabını yarıya kadar anestezi çözeltisiyle doldurun. Bir balığı, hareketi durana kadar anestezi çözeltisinde inkübe edin.Ardından, balığı bir ağ yardımıyla anestezik bulunan Petri kabına aktarın. İnsizyonu kolaylaştırmak için, pensle balığı nazikçe tutun ve başı hafifçe aşağıya bakacak şekilde konumlandırın. 30 gauge tırtıklı bir iğnenin ucuyla, beyin dokusuna zarar verebileceği için çok derine inmeden kafatası üzerinde küçük bir kesik açın.Balığı tutmaya devam ederken, cam kılcal borunun ucunu insizyon bölgesinden yaklaşık yarım milimetre içeri yerleştirin ve beyin dokusuna temas etmemeye dikkat ederek sefalona doğru yönlendirin. Çözeltiyi enjekte edin; çözelti hemen dağılmalıdır. Balığı taze balık suyuna aktarın ve iyileşmesine izin verin.Yaklaşık 30 dakika sonra balığı yeniden anestezi edin ve sıvının yaygın dağılımını kontrol etmek için floresan mikroskobu altında inceleyin. Bu işlem kırmızı floresansa göre gerçekleştirilir. Balığı tankına geri koyun ve tekrar sirkülasyona dahil edin.Davranışsal analizlerde kullanılana veya burada görüldüğü gibi doku örnekleri hazırlanana kadar, doğru bir enjeksiyon, enjekte edilen solüsyonun beyin genelinde yayılmasını ve ventriküler yüzeye yakın hücrelerin etkili bir şekilde hedeflenmesini sağlar. Ancak, cam kılcal tüpün dokuyu zedelediği enjeksiyonlarda, enjeksiyon noktasında yoğun bir floresan sinyali oluşacaktır. Enjekte edilen miktar yeterli değilse, zayıf bir floresan sinyali gözlemlenecektir.Bu şekil, vivo morfoların ventriküler yüzeyin içinde birkaç hücre çapı kadar nüfuz edebildiğini ve bu nedenle kontrol morfolarına kıyasla ventriküler hücreleri etkili bir şekilde hedefleyebildiğini göstermektedir. PCNA'ya karşı morfo enjeksiyonu, ventriküler hücrelerde gen ekspresyonunu etkili bir şekilde baskılamaktadır. Bu immünofloresan görüntülerde, A-B-R-D-U pulse-chase deneyi sonrası BRDU ve QCD immün boyamaları, antisense morfolarla PCNA'nın baskılanmasının yeni oluşan nöronlarda belirgin bir azalmaya yol açtığını göstermekte; bu da CVMI'nın, sonrasında fonksiyonel sonuçlar doğuran endojen genleri baskılamak için kullanılabileceğini ortaya koymaktadır.Böylece geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların yetişkin balık beynindeki rejeneratif nörojenez yanıtında yer alan moleküler mekanizmaları keşfetmesinin önünü açmıştır.

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

24hpf zebrafish otocyst doğrudan morpholinos sunmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Otik vezikül ve penetrasyon etkisi elektroporasyon lümenine morpholinos, mikroenjeksiyon, morpholinos beyin üzerinde etkisi atlayacak ve iç kulak özgü efektler elde etmek mümkün.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Biz, koşullu yetişkin zebrabalıkları fin rejenerasyon sırasında bir hedef protein ifadesini demonte için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, mikro-enjeksiyon ve yara iyileşmesi, blastem oluşumu ve rejeneratif akıbet de dahil olmak üzere yüzgeç yenilenmesi çeşitli aşamalarında, proteinin rolünü test verir fin dokuya antisens oligonükleotid morpholinos electroporating içerir.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Protokol, zebra balığında gen ekspresyonunun kuyrukta morfolino enjeksiyonu ile hedefli olarak yok edilmesini açıklar.

Morfolino Enjeksiyonu: Zebra Balıklarında İşlevi İncelemek İçin Hedef Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Bir Yöntem

Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

Biz nöronlar, makrofajlar ve microglia larva Zebra balığı beyin fizyolojik ve patolojik şartlar altında gelen izole etmek için bir protokol mevcut. Yalıtım, RNA gen ifade profillerini analiz etmek için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı için yüksek kaliteli RNA koleksiyonu aşağı akım analizi qPCR ve transcriptomics gibi gerçekleştirmek için izin verir.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Yenidoğan kemirgen omurilik elektrofizyolojik kayıtlar ölçmek için kullanılan ekstraselüler emme elektrot üretimi ve kullanımı bir...

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Öğrenin yetişkin Danio rerio beyninde morfolino oligonükleotidlerle gen ekspresyonu manipülasyonu. Bu hızlı ve verimli serebroventriküler mikroenjeksiyon tekniği, radyal glial hücreleri hedefleyerek nörogenez ve beyin fonksiyonu çalışmalarına olanak tanır.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon (Video) | JoVE Journal

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Daha fazla video keşfet