Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Bu prosedürün genel amacı, morf oligonükleotidleri yetişkin zebra balığı beyninin serebral ventrikülüne mikro enjekte etmek ve radyo glial hücrelerdeki genlerin aktivitesini azaltmaktır. Bu, önce zebra balığının uyuşturulmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, kafatasında bir yarık oluşturulur ve dikenli bir çentiklik iğnesi kullanılarak optik karın üzerine bindirilir.

Daha sonra morfo solüsyonu insizyon bölgesinden serebral ventriküler sıvıya enjekte edilir. Son olarak, enjeksiyon verimliliği ve doğruluğu floresan mikroskobu altında kontrol edilir. Nihayetinde, histolojik kesitler ve immünohistokimyasal boyamalarla test edilebilen, morfo aracılı gen yıkımı yoluyla, yetişkin zebra balığı beyninin radyal glial hücrelerindeki ilgilenilen genlerden protein üretiminin çok verimli ve yaygın bir şekilde bloke edilmesi sonucu sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, transgenik yaklaşımlar veya elektro işlem tabanlı dağıtım yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, CVMI'nin daha az zaman alıcı olması ve tüm radyo glial hücre popülasyonunu hedeflemede daha verimli olmasıdır. Bu ayarlanabilir ve birçok gen aynı anda yıkılabilir. Enjeksiyon karışımını hazırlamak için 500 Micromolar Morpho stok çözeltisi yaparak başlayın.

10 enjeksiyon için PBS kullanarak, dokuz mikrolitre seyreltilmiş veya seyreltilmemiş morpho çözeltisini bir mikrolitre floresan izleme boyası ile birleştirerek 10 mikrolitre enjeksiyon karışımı hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Cam enjeksiyon kılcal damarlarını aşağıdaki parametrelere göre hazırlamak için bir iğne çektirmesi kullanın.

Basınç kaynağını açın ve basınç ayarlarını 50 PSI veya 3,5 bar olarak ayarlayın. Mikro enjektör ayarlarını aşağıdaki gibi yapın. Tutma basıncı: 20 PSI çıkarma basıncı, 10 PSI periyot değeri 2.5 ve 100 milisaniye.

Geçit aralığı. Halka aydınlatıcıyı açın ve halkayı mikroskop tablasının üzerine yerleştirin. Kılcal tutucuyu mikroskobun yanında uygun bir konuma yerleştirin.

Cam kılcal damarı tutucuya yerleştirin ve enjeksiyon açısını 45 dereceye ayarlayın. Uç forseps bularak, cam kılcal damarın ucunu koparın ve delikten gelen basınç çıkışını kalibre edin. İğnenin ucunu balık suyuna batırarak ve sürekli bir basınç darbesi uygulayarak, hava kabarcıkları optimum basıncı veya delik boyutunu gösteren tek bir sıra oluşturmalıdır.

Cam kılcal damarı enjeksiyon solüsyonu ile doldurun. Hava kabarcıklarından kaçınmak, cam kılcal damarın ucu ile yüklü enjeksiyon çözeltisi arasındaki havayı çıkarmak için basınç uygulayın. Anestezik meabın% 0.1'lik bir sap solüsyonunu hazırladıktan sonra, istenen sayıda balığı balık suyu ile bir taşıma kabına aktarın.

200 mililitre balık suyunu beş mililitre MISP stok çözeltisi ile karıştırarak çalışan bir anestezik çözeltisi hazırlayın. Enjeksiyonlar için kullanmak üzere bir Petri kabını yarıya kadar anestezik ile doldurun. Bir balığı hareket etmeyi bırakana kadar anestezik içinde kuluçkaya yatırın.

Daha sonra anestezik Petri kabına aktarmak için bir ağ kullanın. Kesmeyi kolaylaştırmak için, balığı nazikçe tutmak için forsepsleri kullanın ve başı hafifçe aşağı doğru eğik olarak yönlendirin. 30 gauge iğneli bir dikenin ucunu kullanarak, beyin dokusuna zarar vereceği için çok derine nüfuz etmeden kafatası üzerinde küçük bir yarık açın.

Balığı tutmaya devam ederken, cam kılcal damarın ucunu kesi bölgesinden yaklaşık yarım milimetre geçirin ve beyin dokusu ile temastan kaçınırken, onu sefalona doğru yönlendirin. Çözeltiyi enjekte edin, hemen dağılmalıdır. Balıkları taze balık suyuna aktarın ve iyileşmesine izin verin.

Yaklaşık 30 dakika sonra, balığı yeniden uyuşturun ve sıvının yaygın dağılımını aramak için bir floresan mikroskobu altında kontrol edin. Kırmızı floresan bazlıdır. Balıkları tankına geri koyun ve tekrar dolaşıma sokun.

Davranışsal analizler için veya burada görüldüğü gibi doku örneklerinin hazırlanması için kullanılana kadar, doğru bir enjeksiyon, enjekte edilen çözeltinin beyin boyunca dağılmasına ve ventriküler yüzeye yakın hücrelerin verimli bir şekilde hedeflenmesine yol açar. Bununla birlikte, cam kılcal damarın saplandığı enjeksiyonlar, beyin dokusu enjeksiyon noktasında yoğun bir floresan sinyaline sahip olacaktır. Enjekte edilen miktar yeterli değilse, zayıf bir floresan sinyali gözlenecektir.

Bu şekil, vivo morfosun ventriküler yüzey içinde birkaç hücre çapına nüfuz edebileceğini ve dolayısıyla kontrole kıyasla ventriküler hücreleri verimli bir şekilde hedefleyebileceğini göstermektedir. Morfo. PCNA'ya karşı morfo enjeksiyonu, ventriküler hücrelerde gen ekspresyonunu etkili bir şekilde azaltır. Bu immünofloresan görüntülerde, A-B-R-D-U nabız takip deneyinden sonra BRDU ve QCD immüno boyama, PCNA'nın antisens morfozlarla yıkılmasının yenidoğan nöronlarında önemli bir azalmaya yol açtığını göstermektedir, bu da CVMI'nin daha sonra fonksiyonel sonuçlara yol açan endojen genleri yıkmak için kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Bu nedenle, geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, balık beyninin yetişkin S'sinin rejeneratör nörojenez tepkisinde yer alan moleküler mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı.