Name: Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Keşfedin embriyonik zebra balığında serebrovasküler yapıların 3D görüntülenmesi yöntemini. Konfokal mikroskopi ve açık kaynaklı yazılım kullanarak damsal gelişimi inceleyin. Bu teknik anjiyogenez ve vasküler biyoloji araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu teknikler geliştirmeye yardımcı laboratuarlarımızda geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür ederim. Kısmi finansman Rejeneratif Tıp / CIRM (RN1-00538) için California Institute hibe tarafından DE sağladı.

1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği, Embriyo Üretimi ve Tedavisi <ol><li> Kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) gözetiminde ve NIH veya diğer düzenleyici kurumlar / kurallar hayvan bakımı kurallar içinde aşağıdaki Zebra balığı protokolleri Davranış. </li><li> Belirli dokulara, hücrelere veya organlarda floresan proteinleri ifade Zebrafish suşları Zebrafish Uluslararası Resource Center (Zirc) den temin edilebilir. Örneğin, Tg (KDR: EGPF) Bu protokol gösterildiği gibi tam bir 3D vasküler yapılar üretmek için kullanılabilen vasküler endotel hücrelerinin 6, EGFP ifade s843. Transgenik zebrafish hatları Diğer Zirc mevcuttur. </li><li> PH, tuzluluk, sıcaklık, çözünmüş oksijen, ışık, ve diğer çevresel faktörler 7 izler uygun bir yetiştiricilik sisteminin Evi yetişkin zebrabalıkları. Burada gösterilen zebra balığı bir 14 saat lig ile 28.5 ° C&#39;de bir Aquaneering Inc sistemi (San Diego, CA) barındırılmıştırht/10 saat karanlık döngüsü. Yetişkin Zebra tuzlu su karidesi ve NRD 4/6 Balık yemek (Artemia Direct, Ogden, Utah) dengeli bir diyet besleyin. </li><li> Yetişkin erkek ve üreme çağındaki kadın zebra balığı çiftleşme başarılı artırmak için ayrı muhafaza edilmelidir. </li><li> Birlikte yumurta yoluyla düşmek için yeterince büyük delikli bir örgü dibi vardır bir çiftleşme kapta dişileri (2-4) ve erkek (4-6) koyarak yumurtalamasını ve gübreleme teşvik, ama çok küçük Zebrafish yetişkin geçmek için . Önce akşam çiftleşmesi kurmak; yumurta gündüz ışık döngüsü yavaş yavaş yoğunluğu (şafak) artar, genellikle ise, sabaha yakın koyulur. Çiftleşme kabın alt her 15-30 dakika da yumurta kontrol edin. </li><li> E3 tamponu (5 mM NaCI, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCI2, 0.33 mM MgSO 4) ile bir kafes süzgeç kullanılarak ve temiz yumurta toplamak. Bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde E3 tamponu ve mağaza ile doldurulmuş 100 mm kültür plakalarına yumurta aktarın. </li><li> Cer değiştiren kimyasallar çalışmaebrovascular arzu edilen kimyasal konsantrasyonlarda eklemek dallanma. Örneğin neovasular dallanma 24, başlangıç ​​γ-sekretaz inhibitörü 4 DMSO içinde çözülmüş (CBS IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)]-S-phenylglycinet-butil ester) ile indüklenebilir saat sonra döllenme (hpf). O zaman noktası embriyolar koryon içinde hala vardır ve birçok kimyasal bunun 8 geçebilir. Bir tedavi durum koryon ücretsiz kırmak için embriyoların yeteneğini bozabilir nöral veya motor etkileri varsa, o embriyolar Pronaz 2 ya forseps ile yapılabilir 24 ve 48 hpf arasında de-chorionated edilmelidir. Sağlanan görüntülerde gösterilen embriyolar yavaşça iki bilenmiş forseps ile koryon kapma ve açık şekilde yırtılarak dechorionated edildi. </li><li> Gerekirse / istenirse, pigment oluşumu 24 hpf E3 tampona% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) eklenmesi ile inhibe edilebilir. </li></ol> Serebrovasküler Struct 2.. Konfokal GörüntülemeSabit Zebra balığı Embriyolar ures <ol><li> 250 mg / L Tricaine metansülfonat embriyolar kurban, ve daha sonra 2 daldırılarak onları gidermek - 4 ° C&#39;de bir gece% 4 paraformaldehit Floresan embriyolar ile Konteynerler folyo sarılmış olmalıdır. Bir kez, sabit görüntülenmiş kadar, embriyolar, 4 ° C&#39;de PBS içinde saklanmalıdır - EGFP floresan yoğunluğu yaklaşık bir hafta sonra daha az çözülmüş hale gelir, ancak morfoloji (parlak alanda gösterildiği gibi) çok daha uzun süre korunur. </li><li> Önce bir bilenmiş tungsten iğne kullanılarak bir gözü kaldırarak embriyo monte hazırlayın. Göz bağlayan doku etrafında kesin ilk önce kas kesilir ve son olarak bir göz yerinden için optik sinir kesti. (Not: her iki tarafını görüntülenmesi isteniyorsa kaldırmak hem de gözleri.) </li><li> Göz kaldırıldıktan sonra,% 3 metilselüloz bir damla kullanarak coverglass embriyo monte. Kaldırılan gözle yan coverglass bakan ve mümkün olduğunca cam olarak yakın böylece embriyo yönlendirin. Mctil ile tüm embriyo Kapakgörüntüleme sırasında kuruma önlemek için lcellulose. </li><li> Resim hemen yüksek kaliteli bir 20x objektif Plan Apo (sayısal açıklık = 0.75 ya da daha iyi) ile donatılan bir ters konfokal mikroskop kullanılarak monte embriyo. Bu yapılandırma, iki cam düzlem arasındaki embriyo sandviç ve üst camın embriyo presleme gerektirecek olmayan bir ters mikroskop tercih edilir. </li><li> Orta veya büyük diyafram ayarını kullanarak 1 mikron aralıklarla optik dilimleri toplayın. 2.5 um&#39;lik Büyük adımları da kullanılabilir, ama daha küçük nesnelerin uzaysal sırasını belirlemek için daha zor olabilir. Küçük delikler keskin detay üretmek, ancak gerekli olan uzun tarar EGFP çamaşır suyu ve de elde edilebilir embriyonun içine görüntüleme derinliğini sınırlayabilir. Bir konfokal mikroskop bir embriyo üzerinden yarım yaklaşık görüntüleme için izin verir. </li><li> Tüm balık görüntüleme isteniyorsa, (adım 3.2 Not) başlangıçta iki gözü kaldırmak, hayal gerçekl sonra embriyo döndürmekKarşı taraf için 2.5 - g bir tarafı ve tekrar 2.3 adımları. </li></ol> Embriyonik Zebra balığı Cerebrovasculature 3. 3D İmar <ol><li> Ücretsiz, 3D görüntü için optimize ve PC, Mac ve Linux bilgisayarlar ile uyumlu olan açık kaynak ImageJ Fiji dağılımını 3 (http://fiji.sc) kullanın. </li><li> Eklentiler&gt; LOCI&gt; BioFormats İthalatçı 9, sonra Nikon yığınlarının (Şekil 2A) örneğin name.ids konfokal dosyayı seçmek için giderek Fiji İthalat konfokal yığınları. Bölünmüş kanalları kontrol, AutoScale kontrol gri tonlama: hyperstack, Renk modu gör yığını seçin. </li><li> Bu seçimler dört ayrı kanal panel açılacaktır; EGFP için tek, genellikle üçüncü bir aşağı gerekli olacaktır. C = 1 (Şekil 2A) ardından uzun bir adı olan 16-bit görüntü bırakarak, diğer üç panelleri (kırmızı, mavi ve alfa) kapatın. </li><li> Görüntü kaydırma ta kullanarak rağmen tarayarak ayarlayabilirsiniz.Özellikb ilgi bölgeyi ya da yapıya sahip bir dilim bulmak için alt kısımdaki, sonra (Şekil 2C)&gt; Eşik ayarlama&gt; Görüntü gidin. </li><li> Gelir panelinde, yapı arka plan üzerinde oldukça iyi görülebilir, böylece sol üst bar (siyah seviyesi) kaydırın ve (Şekil 2B) olduğu alt slayt (beyaz düzey) bırakın. B &amp; W tuşuna, Koyu arka plan seçin. Farklı ayarlamalar her dilim için, Siyah arka plan seçmek gerekli olmadıkça her resim için hesapla Eşik seçmeyin. Bu süreç, yeni bir 8-bit görüntü oluşturur. </li><li> UYARI: Eşik sökülme veya kaydedilmiş ImageJ, yani konfokal yığını bir değişiklik gerektiğinde, her zaman yeniden gerekecektir olamaz. Numaralarını yazmak ve istenen sonuç elde edilene kadar farklı ayarları deneyin. </li><li> Faktörü 1 (iyi) ya da 2 (iyi) örneklemek, Eklentiler&gt; 3D Görüntüleyici&gt; Eşik 0 yazan yeşil bir 3D çıkış yapmak için kırmızı ve mavi renk kutuları kaldırın - aksi takdirde will beyaz bir render üretmek - (Kendiliğinden) (Şekil 2E) Uygula&#39;yı seçin. </li><li> , Döndürmek spin ve fare ve klavye kontrolleri (Şekil 2F) kullanılarak 3D görüntü yakınlaştırma. </li><li> Menüsünden yakalama seçeneğini kullanarak herhangi bir noktada hareketsiz görüntüleri kaydetmek. Ekrandaki görüntü kutusunun boyutu üretilen görüntünün piksel boyutlarını belirler böylece yüksek çözünürlüklü bir görüntü makyaj sağ alt köşesini sürükleyerek kutu büyük isteniyorsa. </li><li> Görünüm&gt; Record 360 ° rotasyon (Şekil 2G) seçerek dönen bir 3D film oluşturun. Adım başı 2 derece dönme varsayılan, ama çok daha küçük dosya boyutları yaratacak örneğin 5 derece, değiştirilebilir, ancak animasyon silkeleme ekleyebilirsiniz. </li><li> Daha sonra, medya oynatıcılar ile inceleyen internete yükleyerek veya PowerPoint sunumları kullanmak için birkaç mevcut biçimlerden birinde dosyayı kaydedin. Açık kaynaklı medya oynatıcı VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>) :/ / www.videolan.org / vlc / index.html tp, ücretsiz ve çok iyi bu videoları işler. </li></ol>

<ol><li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s-related+peptide+amyloid-%CE%B2+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+husbandry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li>
<li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272(2012).</li>
</ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan yöntemler zebrafish gelişmekte olan damar sistemi görsel çalışmalar için bir temel sağlar. Sabit örnekleri yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme. Drosophila ve C için kullanılabilir ise canlı örnekleri, kalp hızı ve kalp vuruş hacmi olarak fizyolojik parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir elegans tüm vücut görüntülemesi için izin verir, ama omurgalıların zebra balığı ve bir endotel hücre-kaplı damar sistemi de dahil olmak üzere omurgalı dokular için yararlı bir model sağlar. Bu çalışmalar Zebrafish araştırma eden önemli transgenik hatları ve genomik kaynaklar dahil edebilirsiniz. 3D rekonstrüksiyonu ve embriyonik zebrabalıkları ikinci eş odaklı görüntü oluşturma, burada açıklandığı gibi, damar dallanması ve bu sıçan ve fareler gibi daha büyük hayvan modelleri ile mümkün değildir damar yoğunluğu ile bir sistem biyoloji yaklaşımı için izin verir. Ayrıca, Zebra balığı değiştirilebilir bir ortamda (E3 tampon) geliştirmek amniotları gibi, nerede bir kolaylıkla c ekleyebilirsinizdamar gelişimini etkileyen belirli enzimleri veya diğer süreçlerini engelleyen hemicals. Kimyasal teslim konsantrasyonu ve zamanlaması araştırmacı ince ayar tedavi koşulları sağlayan, değiştirilebilir. 1.. Değişiklikler ve sorun giderme Bu sistem değişiklikler doku, organ veya bölgeye özel desenler 10 çeşitli EGFP ya da diğer floresan proteinleri ifade zebrabalıkları transjenik çizgileri dahil olabilir. Bundan başka, zebra balığı retinada neovasküler değişikliklerin analizi son 5 yayınlanmıştır. Büyük embriyolar ve yetişkin zebrabalıkları pigmentasyon problemleri ölçekli pigmentler veya retina pigment üretemez transgenik hatları ile geçerek telafi edilebilir. Azalmış floresan Sorunları genellikle uygunsuz tespit koşullarından kaynaklanabilir. 1 gün boyunca paraformaldehit (% 4) uygun olduğu, ancak bu glutaraldehit, ozmiyum tetroksit veya alkol gibi güçlü bir sabitleyici, mayEGFP floresan yok eder. Fiksasyon sonra, embriyolar 4 ° C&#39;de PBS tutulmalı ve her zaman doğrudan güneş ışığından korunmalıdır. Bu tekniğin 2. Sınırlamalar Bu protokol ile üretilen 3D görüntü kalitesi ve çözünürlüğü oluşturulan görüntülerin kalitesine bağlıdır. Bu embriyolar ile ışık penetrasyon standart bir konfokal mikroskop kullanılarak orta sajital düzlem ile sınırlıdır. Bu görüntüleme yönü büyük embriyolar ve yetişkinlerde görüntüleme derinliğini sınırlar, ancak daha gelişmiş çoklu foton mikroskopi sistemleri derinlikte görüntüleme için izin. Mevcut yöntemlere göre 3. Önemi Bu protokol, bütün bir hayvan dahil bir sistem bir düzeyde kan damarı ağları analizlerine bir yaklaşım sağlar. Bu verilerin daha önceki temsilleri sık sık birlikte ortaya koydu görüntülerin dizi dayanıyordu, ancak 3D render mekansal Yakınlarının daha iyi çözünürlük sağlariçeriyordu tin. 4. Gelecek uygulamalar Görüntüleme ve doku işleme yeni gelişmeler yaşlı embriyolar veya yetişkin şeffaf 11-14 yaparak içerebilir, bu yöntemler için yeni uygulamalar sağlayacaktır. Geliştirilmiş şeffaflık büyük ölçüde konfokal ve çoklu foton lazerler doku penetrasyonu artacak. Bundan başka, kamera ve foto çoklayıcı tüplerin hızı gibi yakında bir analiz 4. boyuta sağlayan, gerçek zamanlı olarak balık 3D kaplamalar üretmek mümkün olabilir artar. 5.. Kritik adımlar Bu protokol kritik bir adım, tam sabitlemeyi içeren görüntüleme için hazırlıktır. Görüntüleme mevcut en iyi sayısal deliklere sahip yüksek kalite hedefleri ile tespitin ardından en kısa sürede yapılmalıdır. Çözünürlük kullanılan görüntüleme sistemine bağlıdır, çok yüksek kalite sistemleri genellikle daha iyi. 3D render üreten, yoğun bellekbellek ve iyi bir grafik işlemciler büyük bir miktarı ile çok daha yeni, yüksek-uç bilgisayarlar için tavsiye edilir. Bu yöntemler, nöronlar, kas, bezler ya da herhangi bir sayıda popülasyonlarında, GFP ya da diğer floresan proteinleri ifade eden transgenik embriyo adapte edilebilir olsa da, burada açıklanan görsel biyoloji sistemi, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebrabalıkları için optimize edilmiştir Diğer hücreler. Bu sistemle birlikte çalışma konusunda büyük avantajı sabit ve / veya canlı hayvanlarda, bu gelişim sürecinde herhangi bir anda tüm embriyo neler olduğunu incelemek için yeteneğidir.

Zebra balığı gelişim biyolojisi okumak için güçlü bir sistem sağlamak ve onların embriyoların göreceli saydamlık görüntüleme bazlı çalışmalarda 1 elverişlidir. Zebrafish on yıllardır omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. Zebra balığı dahil Teleost&#39;un, omurgasızlar hiçbir makul homoloğunu sahip basitleştirilmiş bir omurgalı damar sistemi var. Kan bu oksijenli solungaçları yoluyla iki bölmeli bir kalbin ön odasından pompalanır. Solungaçları Kan dorsal aorta yakınsarsa ve daha küçük ve daha küçük damarları içine şube arterler, organ dokularında sonunda ulaşan kılcal damarlar yoluyla geçer. Kılcal kısımlar, oksijen içinde serbest bırakılır ve karbon dioksit emilir. Kapiller venöz kan tarafında daha büyük ve büyük damarlar içine akar ve son olarak döngü tekrar kalp, posterior odacık içine çekilir. Bir yetişkin zebrabalıkları bir seferde 200 veya daha fazla yumurta, ve onc olabilire döllenmiş, hızla 2 gelişir. Bir gün içinde vücut ekseni de koryon zarı içinde etrafında embriyo hareket sözleşme ve kaslar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. 2-7 günden sonrası fertilizasyon (DPF) çoğu vücut sistemleri gözleri ve gıda doğru veya uzakta parlak ışıktan yüzme koordine bir merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere, gelişir. Kadar 7 dpf&#39;e embriyolar mikroskobu ile görselleştirme için izin vermek için yeterince küçük. Floresan proteinleri sentezleyen transgenik hatları konfokal veya floresan mikroskobu ile görüntülü olabilir. Konfokal görüntüleme vasküler gelişimin bir sistem biyolojisi bakış açısı sağlamak Zebra balığı embriyolarının tam vasküler yapıların 3 boyutlu görüntü oluşturmak için açık kaynak yazılım 3 ile eşleştirilmiş olabilir. Bu damar ağlarının 4,5 bir sistem düzeyinde analiz için izin verir gibi vasküler ve serebrovasküler karmaşıklığı değişiklikleri ile ilgili çalışmalar, bu protokol yararlanacaktır. Yöntemleri ve kaynakların bir derleme sağlamak vardırembriyonik Zebrafish vasküler yapıların görüntülemesi gerektiren çalışmalar için kolay benimsenmesi ve bu tekniklerin izin d. Bir hayvan modeli olarak zebrabalıkları maliyet etkinliği, omurgalı gelişimi ve homeostazında moleküler yollarının anjiyojenik etkisini değerlendirmek için yeni platformlar sağlamak için ortaya çıkan görüntüleme teknolojileri ile bir araya getirmektedir.

<table><tbody><tr><td>N &ndash; Feniltiüre&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, katalog #41972</td><td></td><td>E3 tamponunda 0.2 M, 4 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>E3 tamponu</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Cam alt tabaklar</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX / DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Diflorofenasetil-L-alanil)]-S-fenilglisinet-bütil ester EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, kedi # 351147</td><td></td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri&nbsp;</td><td>VWR, cat # 414004-001</td><td></td><td>VWR tek kullanımlık transfer pipetleri</td></tr><tr><td>Metil-selüloz&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>E3 tamponunda %3</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Balık yemi&nbsp;</td><td>Salamura Karides Doğrudan</td><td></td><td>Kurutulmuş</td></tr><tr><td>Salamura Karides</td><td>Salamura Karides Doğrudan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canlı Tungsten tel&nbsp;</td><td>Küçük Parçalar # TW-016-60</td><td></td><td>0.016" OD</td></tr><tr><td>Trikain</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>E3 tamponunda Trikain metansülfonat 250 mg / L</td></tr></tbody></table>

görüntüleme ve embriyonik zebra balığı serebrovasküler yapıların 3d İmar

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebra balığı, in vivo gelişimsel biyoloji ve patoloji incelemek için güçlü bir araçtır. Küçük boyutu ve zebra balığı embriyoların nispi şeffaflık gibi kalp ve damar gelişimi gibi süreçlerinin görsel inceleme için özellikle kullanışlı hale getirir. Birçok son çalışmalarda, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebra balığı görüntü için kullanıldı ve konfokal mikroskopi kullanılarak, beyinde ve retinada kompleks vasküler ağların analiz. Tanımlar, hazırlama ve tedavi resim gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ifade zebra balığı embriyolar ve daha sonra serebrovasküler sistemin kapsamlı 3D kaplamalar oluşturmak için temin edilmiştir. Protokoller embriyoların tedavi, konfokal görüntüleme ve EGFP floresan korumak tespit protokolleri bulunmaktadır. Ayrıca, bu tür zararlı yakındaki sinir doku olmadan çıkarılması göz gibi serebrovasküler yapıların, yüksek kaliteli görüntüler elde etme hakkında yararlı ipuçları verilmektedir. Potansiyel tuzaklarkonfokal görüntüleme ile serbestçe kullanılabilir açık kaynak kodlu yazılım kullanarak konfokal görüntü yığınlarının 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için gerekli adımları birlikte tartışılmıştır.

Vasküler yapıların 3 boyutlu rekonstrüksiyon Zebra balığı bir gelişme kapsamlı ve görsel olarak ilginç bir bakış açısı sağlar. Onlar genellikle yapıldığı gibi 1 ve 2 yöntemleri Rakamlar. Şekil 3. endotel hücreleri EGFP ifade Zebra balığı embriyo dpf&#39;e 6 vasküler yapıların çeşitli açılarını göstermektedir. Bir katı yeşil veya beyaz renk ile bu sinyal yoğunluğunu takdir etmek zor olabilir; pseudo-boyama bir look-up-tablodan görüntü yoğunluğunu sağlamak ve yapıları örtüştüğü zaman daha iyi bir derinlik algısı sağlar. In damar bir sözde renkli 3D görüntü bir örneği, bir 6 zebra balığı, Şekil 4&#39;te sağlanmıştır dpf. Canlı embriyo Floresan Görüntüleme göz ve vücut hareketi içerir fizyolojik özelliklerini incelemek için kullanılabilir ve kalp aktivitesi. 3 ve 4, Şekil transgenik Zebrafish satırını kullanarak, bu yöntemlerle elde edilen temsili sonuçlar göstermektedir<html> tarif. Görüntüleme çözünürlüklü mikroskop özelliklerine bağlıdır, ancak EGFP sinyalinin parlaklık en ticari sistemler ile iyi görüntü kalitesi için yeterlidir. 3D temsillerinin İmar ve render tutarlı ve bu açık kaynak yazılım içindeki seçenekleri sürekli iyi sonuçlar sağlar. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. Göz giderme. A) bir tungsten ihtiyacı olan sabit bir 3 dpf embriyo göze yanına yerleştirilir. Doku) bu pozisyon. B göz çevresinde kesilir gözü düşer ve altta yatan oküler kaslar ve optik sinir kesilir. Boş göz soket kesik daire ile gösterilir. C) Aynı embriyo üzerinde döndü ve metil-selüloz ile monte edilir, yukarı bakacak sağlam gözle.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2. Adım-adım bir konfokal görüntü yığını 3D rekonstrüksiyon. A) ilgi bölge ile bir dilim bulduktan sonra. B) seçmek için Eklentiler&gt; LOCI&gt; Bioformat kullanarak Fiji içinde yüklü dosyayı aç (4104.1.ids), eşik ayarı gösterilmiştir. C) olarak seçilen eşik üst kullanılarak 214 ayarlanır kaymak ve uygulamak seçilir. gösterildiği gibi D) 3D görüntüleyici denir. E) 3 boyutlu rekonstrüksiyon yönlendirme için sağlam göz ile bir zebrabalıkları. F) görüntü yakınlaştırılmış ve. G) A 360 derece dönüş filmi döndürülmüş gelmiştir gösterilir gösterildiği gibi yapılır.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3.. 3D rekonstrüksiyon Perspektifler. A) 10x objektif ile görüntülü 6 dpf&#39;e embriyonun medial perspektif, ağız sağda, ağız içinde değil solungaçları. B aynı embriyo) Yanal, not fin ortada bir döngü. 20x objektif ile görüntülenmiş C) Aynı embriyo, 20x objektif görüntüleme medial perspektif, not solungaç çözünürlük. D) Yanal perspektif. Fin panelinin sağ kenarında. 20x objektif görüntüleme E) ön-medial görünümü, sağa bir 20x objektif, baş onunla görüntülü aynı embriyo ağız içinde not solungaçları. F) Karın. Sağ alt kısmında yumurta sarısının üzerine damarsal unutmayın.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Sinyal yoğunluğu için bir Pseudocolor look-up-tablosunu kullanarak 6 dpf yeniden 6 dpf&#39;e embriyo Şekil 4. Yoğunluk farklılıklar. Image. Ağız, beyin, solungaçları ve yolk kesesi yönelim etiketli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> 4 dpflik zebrabalıkları yeniden damar sisteminin Şekil 5. Movie. Balık 2,5 mikron ile görüntülendi. Görüntüler vardıEmbriyonun yarısını görüntüleme dan. Şekil 6&#39;da yer alan bir GSI ile muamele edilmiş zebrabalıkları yapılarla vasküler yapıları karşılaştır. Baş kan damarlarının daha düşük yoğunluklu ve daha büyük solungaçları not edin. (Yüklemeler altında &quot;Zfish_spin.avi&quot; ek dosyasına bakınız) <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Şekil 6. 4 dpf&#39;e bir GSI-tedavi edilen embriyo damar sistemi 3D Film. Balıklar orta hatta lateral boyunca 2.5 mikron ile görüntülendi. Şekil 5&#39;te gösterilen balık dpf&#39;e kontrolü 4 ile vasküler yapıları karşılaştırın. Kemerli sırt ve küçük boyutu bu kimyasal ile tedavi embriyoların tipiktir. (Yüklemeler altında &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; ek dosyasına bakınız)

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik zebra balıklarındaki serebrovasküler yapıları değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle döllenmiş zebra balığı yumurtalarının toplanması ve uygulama koşullarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Üç günlük bir büyüme döneminden sonra zebra balıkları sakrifiye edilip fikse edilir ve örnek lamel cam üzerine monte edilmeden önce bir göz dikkatlice çıkarılır.Ardından serebral vaskülarite konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Son olarak, açık kaynaklı yazılım kullanılarak vaskülaritenin 3D renderları oluşturulur. Nihayetinde, yeniden yapılandırmaların analizi, tedavi koşullarının kan damarı dallanması ve yoğunluğu üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılır.Gelişmekte olan zebra balığı beyninde. Bu teknik, embriyonik zebra balıklarının tüm vasküler sistemini değerlendirir. Bu yöntem, amyloid beta biyolojisini organ sistemleri düzeyinde incelememize olanak sağlamıştır.Diseksiyon ve görüntü analizi teknik açıdan zorlayıcı olduğu için öğrenilmesi güçtür; bu nedenle yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Başlangıç olarak, istenen dokularda geliştirilmiş yeşil floresan protein eksprese eden transgenik bir zebrafish hattını 28.5 °C'de, 14 saat ışık ve 10 saat karanlık döngüsünde yetiştirin. Bu örnekte, vasküler endotel hücrelerinde EGFP eksprese eden transgenik balıklar, yumurta toplama işleminin bir önceki gecesinde gözenekli tabanlı çiftleşme tanklarına yerleştirilen erkek ve dişi balıklarla birlikte yetiştirilmiştir. Ertesi sabah ayırıcıyı kaldırın ve balıkların çiftleşmesine izin vererek her 15 dakikada bir yumurta kontrolü yapın.Yumurtaları toplamak ve yıkamak için süzgeç ve E3 ortamı kullandıktan sonra, yumurtaları 100 mm'lik kültür kaplarına aktarmak için E3 kullanın ve serebrovasküler dallanmayı değiştirmek için 28 °C'de inkübe edin. Döllenmeden 24 saat sonra başlayarak, DMSO içinde çözündürülmüş gama sekretaz inhibitörü gibi bir kimyasal ekleyin. Arzu edilirse, pigment oluşumunu engellemek için %0,03 PTU ekleyin.Çözelti içindeki embriyoları 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktardıktan sonra, embriyolar istenen gelişim aşamasına gelene kadar 28,5 °C'de inkübe edin. Embriyoları trica ile sakrifiye edip aldehit ile gece boyunca 4 °C'de sabitledikten sonra, embriyoları karanlıkta 4 °C'de PBS içinde saklayın.Gözü embriyodan çıkarmak için, sivriltilmiş bir tungsten iğne kullanarak bir gözü bağlayan dokunun çevresini kesin. Ardından, gözü çıkarmak için kasları ve son olarak optik siniri kesin. Göz çıkarıldıktan sonra, embriyoyu boş göz çukuru aşağı bakacak ve lamel camına temas edecek şekilde lamel camı üzerine ters çevirin.Embriyoyu sabit tutmak ve kurumayı önlemek için tüm embriyoyu kaplayacak şekilde bir damla %3 Metilselüloz ekleyin. 20 x plan APO objektifli ters konfokal mikroskop kullanılarak yapılan görüntüleme sırasında embriyoyu hemen görüntüleyin; birçok görüntüleme sistemi bu örneğin yalnızca yarısındaki vasküler yapıları çözümleyebilecektir. Eğer durum böyleyse, embriyoyu PBS içinde süspanse edip yeniden askıya alın ve 3D render işlemleri için optimize edilmiş olan Image J kullanarak serebrovasküler görüntülerin 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek amacıyla karşı taraftan yeniden monte edin.Plugins, loci, bio formats importer adımlarını takip ederek konfokal yığınları içe aktarın ve ardından Nikon yığınları için konfokal dosyayı seçin; view stack with hyper stack seçeneğini işaretleyin ve renk modunu gray scale olarak ayarlayın. Ardından auto scale ve split channels seçeneklerini işaretleyin. Bu seçimler dört ayrı kanal paneli açacaktır.Dosya adının ardından c=1 ifadesi bulunan 16 bit görüntüsü dışındaki tüm pencereleri kapatın. İlgi duyulan bölgeyi veya yapıyı içeren bir kesit bulmak için alttaki kaydırma sekmesini kullanarak eşik değerini ayarlayın. Ardından image adjust threshold (görüntü eşik ayarı) kısmına gidin.Açılan panelde, yapının arka plan üzerinde net bir şekilde görülebilmesi için üst çubuğu sola kaydırın ve yeni bir sekiz bit görüntü oluşturmak için alt sürgüyü olduğu gibi bırakın. b ve w seçeneğini seçin. Ardından koyu arka planı seçin.Her bir kesit için farklı ayarlamalar gerekmedikçe, her görüntü için eşik değerini hesapla (calculate threshold for each image) seçeneğini işaretlemeyin. Ardından, plugins 3D viewer threshold zero resampling factor one or two kısmına gidin ve yeşil bir 3D çıktı elde etmek için kırmızı ve mavi renk kutularının seçimini kaldırın. Aksi takdirde, beyaz bir görüntüleme oluşturulacaktır.Ardından uygula'yı seçin. Herhangi bir noktada sabit görüntüler kaydetmek için 3D görüntüyü döndürmek, çevirmek ve yakınlaştırmak için fare ve klavye kontrollerini kullanın. Menüdeki yakala seçeneğini kullanın.Ekrandaki görüntü kutusunun boyutu, üretilen görüntünün piksel boyutlarını belirler; bu nedenle, yüksek çözünürlüklü bir görüntü isteniyorsa, sağ alt köşeyi sürükleyerek kutuyu büyütün. "view record 360 degree rotation" seçeneğini belirleyerek dönen bir 3D film oluşturun. Son olarak, dosyayı mevcut birkaç formatdan birinde kaydedin ve 3D görüntüleme için ücretsiz açık kaynaklı medya oynatıcı VLC'yi kullanın.Vasküler yapıların rekonstrüksiyonu, zebra balığı gelişimine dair kapsamlı ve görsel olarak ilgi çekici bir perspektif sunar. Burada, endotelyal hücrelerde EGFP eksprese eden, döllenme sonrası altıncı gündeki bir zebra balığı embriyosundaki vasküler yapıların monokrom yeşil veya beyaz renklerdeki çeşitli açıları gösterilmektedir. Sinyal yoğunluğunu fark etmek zor olabilir, ancak yalancı renklendirme bir arama tablosundan görüntü yoğunluğu sağlayarak üst üste binen yapıların derinliğinin daha iyi algılanmasına olanak tanır.Örneğin, bu şekil, döllenmeden altı gün sonraki bir zebra balığının damar sisteminin gelişiminden sonraki yalancı renkli 3D görüntüsünü göstermektedir. Bu teknik, amiloid betanın bir omurgalı beynindeki vasküler etkilerini incelememize olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, anjiyogenezi incelemek için ekonomik ve erişilebilir bir sistem sunan embriyonik zebra balıklarında vasküler ağların nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Nöral tüp oluşumu sonra neuroepithelium daraltır ve tüp embriyonik beyin ventriküller oluşturmak için embriyonik beyin omurilik sıvısı (eCSF) ile doldurur katlanabilir. Biz daha iyi, canlı embriyo nöroepitelyal şekli aksine sıvı dolu boşluk görselleştirmek için bu ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi.

Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Burada, larva zebra balıklarının üç boyutlu floresan mikroskobu kullanılarak in vivo tüm beyin görüntülemesi için bir protokol sunulmaktadır. Deneysel prosedür numune hazırlama, görüntü toplama ve görselleştirmeyi içerir.

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için düşük maliyetli bir ışık mikroskobu yöntemini açıklar ve gelişmiş görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duymadan gelişimsel kardiyotoksisitenin tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Standart Mikroskopi ve Video Analizi Kullanılarak Fonksiyonel Kardiyak Görüntüleme: Çevresel ve Biyomedikal Araştırmalarda Uygulamalar

Keşfedin embriyonik zebra balığında serebrovasküler yapıların 3D görüntülenmesi yöntemini. Konfokal mikroskopi ve açık kaynaklı yazılım kullanarak damsal gelişimi inceleyin. Bu teknik anjiyogenez ve vasküler biyoloji araştırmaları için değerlidir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Daha fazla video keşfet