Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik zebra balıklarında serebrovasküler yapıları değerlendirmektir. Bu, önce döllenmiş zebra balığı yumurtalarının toplanması ve tedavi koşullarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Üç günlük bir büyüme periyodundan sonra, zebra balığı sabit olarak kurban edilir ve numune kapak camına monte edilmeden önce bir göz dikkatlice çıkarılır.

Daha sonra serebro damar sistemi konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Son olarak, damar sisteminin 3D görüntüleri açık kaynaklı yazılım kullanılarak oluşturulur. Sonuç olarak, rekonstrüksiyonların analizi, tedavi koşullarının kan damarı dallanması ve yoğunluğu üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılır.

Gelişmekte olan zebra balığı beyninde. Bu teknik, embriyonik zebra balığının tüm vasküler sistemini değerlendirir. Amiloid beta'nın biyolojisini organ sistemleri düzeyinde incelememize izin verdi.

Bu yöntemin görsel gösterimi, diseksiyon ve görüntü analizinin teknik olarak zor olduğu için öğrenilmesi zor olduğu için kritik öneme sahiptir. Başlamak için, 14 saatlik ışık, 10 saatlik karanlık döngü ile 28.5 santigrat derecede istenen dokularda gelişmiş yeşil floresan proteini eksprese eden bir transgenik zebra balığı türünü yükseltin. Bu örnekte, vasküler endotel hücrelerinde EGFP eksprese eden transgenik balıklar, yumurta toplamadan önceki gece yetiştirilir, erkek ve dişileri ağ tabanlı çiftleşme tanklarında kurar Ertesi sabah, bölücüyü çıkarın ve balığın her 15 dakikada bir yumurtaları kontrol ederek çiftleşmesine izin verin.

Yumurtaları toplamak için bir süzgeç ve yıkamak için E üç ortam kullandıktan sonra, yumurtaları 100 milimetrelik kültür kaplarına aktarmak için E üç kullanın ve serebrovasküler dallanmayı değiştirmek için 28 santigrat derecede inkübe edin. Döllenmeden 24 saat sonra başlayarak, DMSO'da çözündürülmüş gama sekretaz inhibitörü gibi bir kimyasal ekleyin. İstenirse, pigment oluşumunu engellemek için% 0.03 PTU ekleyin.

Embriyolar çözelti içinde 12'lik bir kuyucuklara transfer edildikten sonra, embriyolar istenen gelişim aşamasına ulaşana kadar 28.5 santigrat derecede kuyucuk edilir. Trica'daki embriyoları feda ettikten ve gece boyunca dört santigrat derecede aldehit ile sabitledikten sonra. Embriyoları PBS'de karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.

Gözü embriyodan çıkarmak için keskin bir tungsten iğnesi kullanın ve bir gözü birbirine bağlayan dokunun etrafını kesin. Daha sonra gözü çıkarmak için kasları ve son olarak optik siniri kesin. Göz çıkarıldıktan sonra, embriyoyu boş göz yuvası aşağı bakacak ve kapak camına dokunacak şekilde bir kapak camına ters çevirin.

Embriyoyu yerinde tutmak ve kurumasını önlemek için tüm embriyoyu kaplamak için bir damla% 3 Metilselüloz ekleyin. 20 x plan APO objektif görüntüsü ile ters konfokal mikroskop kullanılarak yapılan görüntüleme sırasında, embriyo hemen, birçok görüntüleme sistemi vasküler yapıları bu numunenin yalnızca yarısında çözebilecektir. Bu durumda, embriyoyu PBS'de resüse edin, askıya alın ve 3D görüntülemeler için optimize edilmiş görüntü J'yi kullanarak serebrovasküler görüntülerin 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek için daha fazla görüntüleme için karşı tarafa yeniden monte edin.

Eklentilere, loci'lere, bio formatları içe aktarıcıya giderek konfokal yığınları içe aktarın ve ardından Nikon yığınları için konfokal dosyayı seçin, hiper yığın ile görünüm yığınını seçin ve renk modunu gri tonlamaya ayarlayın. Ardından otomatik ölçeklendirme ve kanalları bölme seçeneklerini kontrol edin. Bu seçimler dört ayrı kanal paneli açacaktır.

16 bitlik görüntü dışındaki tüm görüntüleri, dosya adı ve ardından c eşittir bir olacak şekilde kapatın. İlgilenilen bölgeye veya yapıya sahip bir dilimi bulmak üzere taramak için alt kısımdaki kaydırma sekmesini kullanarak eşiği ayarlayın. Ardından görüntü ayarlama eşiğine gidin.

Gelen panelde, yapının arka plan üzerinde oldukça iyi görülebilmesi için üst çubuğu sola kaydırın ve yeni bir sekiz bitlik görüntü oluşturmak için alt slaytı olduğu yerde bırakın. b ve w'yi seçin. Sonra koyu arka plan.

Her dilim için farklı ayarlamalar gerekmedikçe her görüntü için eşik hesapla'yı seçmeyin. Ardından, eklentiler 3D görüntüleyici eşiği sıfır yeniden örnekleme faktörü bir veya ikisine gidin ve yeşil bir 3D çıktı elde etmek için kırmızı ve mavi renk kutularının seçimini kaldırın. Aksi takdirde, beyaz bir render üretecektir.

Ardından uygula'yı seçin. Hareketsiz görüntüleri herhangi bir noktada kaydetmek için 3D görüntüyü döndürmek, döndürmek ve yakınlaştırmak için fare ve klavye kontrollerini kullanın. Menüdeki yakalama seçeneğini kullanın.

Ekrandaki görüntü kutusunun boyutu, üretilen görüntünün piksel boyutlarını belirler, bu nedenle yüksek çözünürlüklü bir görüntü isteniyorsa, sağ alt köşeyi sürükleyerek kutuyu büyütün. 360 derece döndürme kaydını görüntüle'yi seçerek dönen bir 3D film oluşturun. Son olarak, dosyayı mevcut birkaç formattan birinde kaydedin ve 3D görüntülemek için ücretsiz açık kaynaklı medya oynatıcı VLC'yi kullanın.

Vasküler yapıların rekonstrüksiyonu, zebra balığı gelişimine kapsamlı ve görsel olarak ilginç bir bakış açısı sağlar. Burada, tek renkli, yeşil veya beyaz renklere sahip endotel hücrelerinde EGFP'yi eksprese eden döllenmeden altı günlük bir zebra balığı embriyosunda vasküler yapıların birkaç açısı gösterilmiştir. Sinyal yoğunluğunu takdir etmek zor olabilir, ancak sahte renklendirme, çakışan yapıların daha iyi derinlik algısına olanak tanıyan bir arama tablosundan görüntü yoğunluğu sağlar.

Örneğin, bu şekil, döllenmeden altı gün sonra bir zebra balığında damar sisteminin sahte renkli bir 3D görüntüsünü göstermektedir. Bu teknik, omurgalı bir beyinde amiloid beta'nın vasküler etkilerini keşfetmemizi sağladı. Bu videoyu izledikten sonra, anjiyogenezi incelemek için ekonomik ve erişilebilir bir sistem sağlayan embriyonik zebra balığındaki vasküler ağların nasıl görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.