Name: Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Öğrenin sıçan santral sinir sistemi ve çevresel lenf nodu dokularında çift immunohistokimyasal boyama yöntemini. Bu protokol protein lokalizasyonunu görselleştirerek sinirbilim ve immünoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hans Lassmann ve Jan Bauer'e rehberlikleri ve destekleri için teşekkür ederiz. Ayrıca mükemmel teknik yardım için Katalin Benedek'e ve eleştirel ve dilbilimsel değerlendirme için Caroline Westerlund'a teşekkür ederiz.
Bu çalışma Biogen Idec, Wenner-Gren Vakfı, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Nörolojik Engelli Kişiler Derneği, İsveç Beyin Vakfı, AB 6TH Çerçevesi EURATools (LSHG-CT-2005-019015) ve Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

etik Beyanı Bu çalışma Laboratuvar Hayvanları için İsveç Ulusal Kurulu ve Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi gelen kurallarına uygun olarak yapılır etik izinler altında (86/609 / EEC) N338 / 09, N15 / 10 ve N65 / 10, onaylı edildiği Kuzey Stockholm Hayvan Etik Komitesi. 1. Doku Hazırlanması <ol><li> Perfüzyon ve fiksasyon <ol><li> sol ventrikül aracılığıyla transcardial perfüzyon gerçekleştirmek için izofluran ile hayvan anestezisi. 0.1 M PBS (PFA) içinde% 4 paraformaldehit ve ardından kan bileşiklerinin ayrılması için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile damar durulama başlatın. </li><li> PFA içine batırılarak disseke beyinleri, omurilik ve periferik LN doku sabitleşmek. 4 ° C&#39;de 24 saat sonra, daha fazla işlem kadar 4 ° C &#39;de PBS içine PFA doku ve mağaza aktarın. Alternatif ticari PBS, 250 ml S &amp; 9 gr NaCl çözülür# 246; rensen tampon ve 750 ml deiyonize su ekleyin (dH 2 O); 2.5 L dH 2 O. HPO 2 PO 4 x 2H 2 O 4 x 1 H H2O ve 71.2 g 2 Na 0.2 M Sörensen tamponu (pH 7.4) çözülür 13.8 gr NaH hazırlamak </li></ol></li><li> Dehidrasyon ve gömme <ol><li> Bir ustura kullanılarak yaklaşık 5 mm kalınlığında parçalar halinde doku kesilir. </li><li> Ksilen ve nihayet parafin (Tablo 1) takip Tissue-Tek VIP Vakum Sızma İşlemci (etanol konsantrasyonları artan içine dalma dayalı standart bir prosedür kullanılarak doku sertleşmesi işlemi (dehidratasyon) başlatın. </li><li> bir kalıpta doku yerleştirin ve &quot;parafin blok&quot; oluşturmak için numune etrafında sıvı parafin dökün. Uzun süreli saklama, oda sıcaklığına (RT) gerektirir. Bununla birlikte, kesit önce, gece boyunca, örneğin, 4 ° C&#39;de (O / N) blokları soğumaya tavsiye edilir.</li></ol></li></ol> 2. Kesit <ol><li> bıçak boyunca ileri ve geri hareket edebilen kızak mikrotom sabit tutucu, içine parafin blok yerleştirin. blok ve mikrotom bıçak (o bıçak geometrisine bağlı değil, aynı zamanda kesme hızı ve tekniği) arasında optimum açısını ayarlayın. </li><li> parafin blok 5 mikron kalınlığında kesitler - 3 kesin. </li><li> bir su kabına sadece kesilmiş bölümü aktarın ve cam slayt üzerine su sonradan monte edin. </li><li> kalan suyu ve potansiyel hava kabarcıklarını çıkarmak için kağıt havlu karşı dikkatli monte bölümü basın. Ticari olarak önceden kaplanmış yapışkan cam slaytlar tavsiye ediyoruz. </li><li> 60 ° C - Kuru 50 bir sobada birkaç saat için slaytlar monte edilebilir. </li></ol> 3. Parafinden arındırma lamların (Rehidratasyon &amp; Engelleme Endojen Peroksidaz) <ol><li> slaytlar ksilen içine 2x daldırın (alternatif ksilen yerineXEM-200), her zaman 15-20 &#39;. </li><li> % 99 etanol içinde durulayın. </li><li> Endojen peroksidaz aktivitesi engellemek için,% 0.25 hidrojen peroksit içeren metanol çözeltisi içinde &quot;30 için bölümler inkübe edin. </li><li> Su içeriği (% 99,% 70 artış damıtılmış su içine biten etanol kullanılarak rehidrasyon devam edin. </li><li> Kapağın montajı kadar bu noktadan sonra bölümler nemli tutulması gerekir kayar. </li></ol> 4. Antijen Alma <ol><li> Çalışma hazırlamak, 60 &#39;&#39; (bu durumda EDTA pH 8.5 tamponu içinde), bir antijen alma çözeltisi slaytlar kaynamaya bir gıda gemi kullanarak (EDTA tampon stok çözeltisi DH 2 O 50 ml, 1.21 g Tris ve 0.37 g EDTA içerir 47.5 ml dH 2 O) çözelti seyreltik 2.5ml EDTA stok solüsyonu. </li><li> yaklaşık RT slaytlar soğumasını. 1 saat karıştırıldı ve daha sonra 3 yıkayın - Tris 5x tuz (TBS, kullanımı, alternatif olarak, PBS), 0.05 M Tris ve 0.15 M NaCl içeren tampon; pH 7.5 ayarlanır, wiinci HCI. Alternatif ticari TBS kullanın. </li></ol> 5. belirsiz Cilt Siteleri Engelleme <ol><li> , Spesifik olmayan arka plan reaksiyonları önlemek% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 90 DAKO tampon içeren bloke edici çözelti içinde &quot;30, oda sıcaklığında ilgili bölümleri kuluçkalanması. </li></ol> 6. Çift ile immün: Primer Abs ile eş zamanlı Kuluçka <ol><li> bloke çözeltisi içinde birincil antikor gerekli miktarda seyreltilir ve O / N 4 ° C&#39;de inkübe edin. (; 1 ED1: 1,000) α-CD68 ile veya α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) ya da α-Cd8α (Ox-8; 1: 200):; çift immün için α-eotaksin (300 1 Ccl11) birleştirmek . </li><li> slaytlar TBS tamponu ile 3-5x Durulama (alternatif 10x seyreltilmiş DAKO tampon kullanın). </li><li> bloke çözeltisi içinde ve oda ile 1 saat inkübe edilir: sekonder antikor miktarı (200 biyotinlenmiş anti-keçi, AP-konjüge edilmiş anti-fare, her ikisi de 1) ile seyreltilir. </li><li> (Bizi TBS tamponu ile 5x - slaytlar 3 durulayıne, alternatif olarak 10 x) DAKO tampon seyreltilmiştir. </li><li> RT, 1 saat boyunca bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş Avidin-yaban turpu peroksidaz kompleksi (HRP) ile slaytlar inkübe edin. </li><li> slaytlar 3 durulayın - TBS tamponu (alternatif 10x seyreltilmiş DAKO tampon kullanın) ile 5 kat. </li></ol> 7. Görselleştirme <ol><li> Bağlı AP-etiketli ikincil antikor Görselleştirme <ol><li> 1 L dH 2 O 12.1 g Tris çözülmesiyle 0.1 M Tris-HCl tamponu hazırlayın ve HCl ile pH ayarlanır. 1 M levamisol solüsyonu hazırlamak için, aynı Tris-HCl tampon kullanın. DH 2 O. taze% 4 NaNO 2 çözüm hazırlayın </li><li> (37 (bir standart cam küvet için gerekli hacim) Hızlı Mavi (FB) alt-tabaka bir cam tüp içinde 312.5 ul DMF içinde 6.25 mg Naftol-AS-MX-fosfat çözülür ve önceden ısıtılmış 50 ml ilave edin, 50 ml elde etmek için C) Tris-HCI tampon maddesi. 312,5 ul 2 N HCI içinde 12.5 mg FB RR Tuz çözmek için prepa önce bir 312,5 ul% 4 NaNO 2 çözeltisi, kırmızı ve önceden ısıtılmış Tris-HCI tampon maddesi, aynı 50 ml karıştırın. sarı sıvı berrak hale gelinceye kadar hafifçe çalkalayın ve nihayet önceden hazırlanmış 1 M Levamisole solüsyonu 77 ul ekleyin. Süzüntü karışım elde edilmiş ve bir cam küvet içinde yer slaytlar üzerine dökün. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübasyon başlatmak ve yaklaşık ışık mikroskobu altında geliştirme sürecinde kontrol eder. her 15 - 30 dk. bulanık dönüm Eğer taze karışımı ile FB çözümü değiştirin. </li><li> PBS tamponu içine sonradan TBS tamponu ve transfer 5x - slaytlar 3 durulayın. </li></ol></li><li> Bağlı biotinlenmiş sekonder antikor görselleştirme <ol><li> DAB / H2O 2 49 mi, PBS içinde 1 mi DAB stok solüsyonu (1 mi PBS başına 25 mg DAB) seyreltilerek solüsyon geliştirilmesi hazırlayın. Dökme önceki bölümlerde üzerine 16.5 ul H 2 O 2 ve süzüntü ekleyin. </li><li> tetikleyici kaş içine kromojen DAB Dönüşümn pigment hemen olabilir. (Yüksek arka plan yükseltmek ve belirli bir sinyal maskeleyebilir saniye daha uzun inkübasyon bile birkaç) ışık mikroskobu altında gelişen süreci kontrol. </li><li> Kahverengi pigment çökelti yoğunluğu, alternatif olarak 5 &#39;% 2 bakır sülfat ve% 0.9 NaCl&#39;den oluşan çözelti içinde inkübe edilerek artırılabilir. </li><li> Slaytlar 3 durulayın - PBS ile 5x ve nihayet dH 2 O ile, alternatif olarak musluk suyu kullanın. </li><li> Kapak sulu GelTol montaj orta kullanarak sudan doğrudan fişleri ile slaytlar monte edin. hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. </li><li> Montaj orta tam kurutma, örneğin, O / N 4 ° C&#39;de izin verin. Mağaza RT slaytlar kurutulmuştur. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % Etanol </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % Etanol </td><td> 60# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 3.. </td><td> % Etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % Etanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % Etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % Etanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % Etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % Etanol </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> ksilol </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> ksilol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> Parafin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> Parafin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 13.. </td><td> Parafin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> Parafin </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> Doku Tek VIP Vakum Sızma İşlemci Tablo 1. Doku İşleme.

<ol><li>Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Mason, D. Y., Sammons, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+peroxidase%3A+anti-peroxidase+complexes+for+immunocytochemical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use.</a> Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).</li>
<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).</li>
<li>Polak, J. M., Van Noorden, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolak%2C+JM+%22Introduction+to+immunocytochemistry%22">Introduction to immunocytochemistry</a>. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).</li>
<li>Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+detection+efficiency+of+the+peroxidase+antiperoxidase+%28PAP%29%2C+avidin-biotin+peroxidase+complex+%28ABC%29%2C+and+peroxidase-labeled+avidin-biotin+%28LAB%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods.</a> American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of immunohistochemistry.</a> Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Ccl11+associates+with+immune+response+modulation+and+protection+against+neuroinflammation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats.</a> PloS one. 7, 39794(2012).</li>
<li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+in+PLP-overexpressing+transgenic+rats%3A+gray+matter+oligodendrocytes+are+more+vulnerable+than+white+matter+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuropathology+and+experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes.</a> Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).</li>
<li>Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+contribution+of+CD4+and+CD8+T+lymphocytes+to+T-cell+infiltration+of+the+intact+and+the+degenerative+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord.</a> The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).</li>
<li>Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+populations+of+microglia%2Fmacrophages+in+the+retina+and+their+activation+after+retinal+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury.</a> Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).</li>
<li>Hirasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microglia+in+living+tissues+using+Iba1-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice.</a> Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).</li>
<li>Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+adhesion+mediated+by+CD8+and+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules.</a> Nature. 336, 79-81 (1988).</li>
<li>Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+formaldehyde+fixation+irreversibly+reduces+immunoreactivity+of+Bcl-2+in+the+nuclear+compartment+of+breast+cancer+cells%2C+but+not+in+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).</li>
<li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+M+%22Microscopy%2C+Immunohistochemistry+and+antigen+retrieval+methods+for+light+and+electron+microscopy%22">Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy</a>. , Kluwer Academic. New York. (2002).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+and+heat-retrieved+tissue+antigens%3A+a+comparison+of+their+immunoreactivity+in+experimental+antibody+diluents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).</li>
<li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).</li>
<li>Huang, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+demonstration+of+hepatitis+B+core+and+surface+antigens+in+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).</li>
<li>Taylor, C. R., Shi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval%3A+call+for+a+return+to+first+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval: call for a return to first principles.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).</li>
<li>Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formic+acid+pretreatment+enhances+immunostaining+of+cerebral+and+systemic+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).</li>
<li>Nelson, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pathology+%3A+MP%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies.</a> Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).</li>
<li>Van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+der+Loos%2C+C+%22Immunoenzyme+multiple+staining+methods%22">Immunoenzyme multiple staining methods</a>. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).</li>
<li>Elias, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElias%2C+J+%22Immunohistopathology.+A+practical+approach+to+diagnosis%22">Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis</a>. , ASCP Press. Chicago. (2003).</li>
<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Letter%3A+Cleavage+of+heme+from+horseradish+peroxidase+by+methanol+with+inhibition+of+enzymic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).</li>
<li>Streefkerk, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+erythrocyte+pseudoperoxidase+activity+by+treatment+with+hydrogen+peroxide+following+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).</li>
<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).</li>
<li>Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+biotin+on+phosphorylation%2C+acetylation%2C+methylation+of+rat+liver+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+reports%22%5BJournal%5D)">Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones.</a> Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).</li>
<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Standart İHK prosedürleri genellikle yaygın geniş deneyime değil, aynı zamanda &quot;deneme yanılma&quot; yaklaşımı ima optimal bir sonuç elde etmek özel ayarlamalar gerektirir. Doku hazırlık hedef görselleştirme kadar protokolde neredeyse her adımı tek tek nihai sonucu iyileştirmek için değişiklik tasarlanmış tabi tutulabilir. Burada sunulan Çift boyama protokolü, özellikle nöro etkilenen formalin ile fikse, parafine gömülü sıçan MSS ve LN doku kesitlerinde bizim ilgi hedef proteinleri arasındaki ilişkileri değerlendir...

methylome, transcriptome hatta proteom düzeyde yapılan analizler gelişmiş yüksek verimlilik kullanımı rağmen, immün doku numunesi, hücre kültürü doğrudan protein tespiti veya bir hücre smear için altın standart olmaya devam etmektedir. yerelleştirme / dağıtım modelini ortaya çıkararak, immünhistokimya (İHK) göreli oranları ve hedef proteinlerin topografik ilişkileri değerlendirmek, ve hatta onların biyolojik aktiviteleri gösterebilir. Bu nedenle, IHC yaygın klinik ve araştırma tanı amacıyla, örneğin, tedavi değerlendirmeleri, hastalık mekanizmaları, hayvan modellerinde fonksiyonel ve fenotipik değişiklikler, vb çalışma için kullanılır Esasen histoloji, patoloji, biyokimya ve immünoloji oluşan İHK anlamlı floresan etiketli antikorlar enfekte dokuda 1 Pnömokok antijenleri tespit etmek ilk kez kullanıldı 1941 yılından bu yana ilerlemiştir. Vselüler ürünlere ve IHC bileşenlerin isualization spesifik antijen (Ag) antikorlar (ABS) bağlanması üzerine dayanır. Fluorofor etiketli antikorlar kullanılarak Bunun yanı sıra, bağışıklık tepkisi de peroksidaz 2,3 ya da alkalin fosfataz 4 gibi enzimler kullanılarak görüntülenebilir. Radyoaktif etiketler otoradyografi ile görselleştirilmektedir ve daha ileri koloidal altın-etiketli antikorlar 5, ışık ve elektron mikroskopi hem spesifik bir antijen-antikor etkileşimi saptamak için kullanılır. Ag-Ab immünreaksiyon doğrudan ve dolaylı yöntemlerle tespit edilebilir. Direkt yöntem doğrudan birincil Abs 6 etiketli kullanır gibi esasen daha hızlı ve basittir. Bununla birlikte, duyarlılık önemli olmadığı için, direkt ve indirekt yöntemler olanlar tercih edilir. İki aşamalı indirekt algılama prosedürleri, ikinci kat 7 olarak, birincil Abs yönelik ikincil Abs ilk olarak, birincil Abs etiketsiz ve etiketli gerektirir.Sinyal büyütme daha dahil ederek elde edilebilir, enzime bağlanmış üçüncül antikor (üç aşamalı bir dolaylı yöntem) orta Ab bağlar. Yaygın olarak kullanılan dolaylı saptama yöntemleri avidin-biotin ve peroksidaz antiperoxidase (PAP) bulunmaktadır. Seçenek olarak ise, alkalin fosfataz antialkaline fosfataz (APAAP) kompleksi yerine PAP yöntemi kullanılabilir. Özellikle, alkalik fosfataz (AP) yöntemleri immunperoksidaz yöntemle 4 daha fazla hassas gibi görünmektedir. Avidin-biyotin kompleksi (ABC) yöntemi işaretlenen avidin-biyotin kompleksi (LAB) ile kombinasyon halinde biyotinlenmiş sekonder Ab kullanan, ya da streptavidin-biyotin kompleksi (levha) etiketli. Algılama duyarlılık da peroksidaz veya alkalin fosfataz 8 ile etiketlenmiş avidin dahil ederek arttırılabilir. Kullanılan diğer saptama yöntemleri polimerik etiketleme, tiramin büyütmesi ve bağışıklık haddeleme daire 9 vardır. Özellikle, farklı tespit yöntemleri, aynı dokuda çok Ag tespiti için birleştirilebilirBurada yer alan 1978 4. eşzamanlı yapılan olarak çift immün ilk kez bildirilmiştir örneği sırasıyla peroksidaz-bağlı AP-konjuge sekonder antikor ile formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan CNS LN doku kesitlerinde uygulandı. sinyalleri sırasıyla, (FB) APAAP kompleksi 3,3&#39;-diaminobencidine (DAB) kromojen ve Fast Blue kullanılarak görselleştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><güçlü>Reaktif</güçlü></td></tr><tr><td>izofluran (İzofluran): 1-Klor-2,2,2-trifloretil (diflormetil eter) 2-Klor-2- (diflormetoksi)-1,1,1-trifloretan (C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>Göz ışınlaması. Muhtemelen doğurganlığı etkiler ve rahimdeki bebeğe zarar verir. Sadece yeterli donanımlı anestezi ortamında uygulayın.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin (PBS), tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 1x PBS'de %4</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>Sağlık tehlikesi. Aşındırıcı. Yanıcı. Akut toksisite.</td></tr><tr><td>Etanol &#8805; %99,5, mutlak (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>Yanıcı.</td></tr><tr><td>Ksilen (Ksilenler, histolojik derece; C6H4(CH3)2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Yanıcı. Akut toksisite.</td></tr><tr><td>Histo-Comp Parafin Balmumu</td><td>Dokusu-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>Yapıştırıcı Mikroskop Slaytları</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>Ksilol ikamesi XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>Solunum hassasiyeti. Kanserojenlik.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) fare anti-sıçan, birincil antikor</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Iba1 (AIF1) fare anti-sıçan, birincil antikor</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) fare sıçan önleyici, birincil antikor</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-eotaksin C-19 (CCL11) keçi anti-sıçan, birincil antikor</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin fosfataz (AP) konjuge ikincil antikor</td><td>Dakopatts, Danimarka</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile ikincil antikor</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>Avidin-yaban turpu peroksidaz kompleksi (HRP) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-MX fosfat (C19H18NO5P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>Akut toksisite.</td></tr><tr><td>Hızlı Mavi RR Tuzu, Azoik Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hidroklorür (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>Akut toksisite.</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB Kromojen)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>Son derece yanıcı. Zehirli.</td></tr><tr><td>Bakır sülfat (CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>Akut toksisite. Çevresel tehlike.</td></tr><tr><td>GelTol Sulu Montaj Ortamı Termo</td><td>Elektron Şirketi</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit,% 30 (H < alt > 2 < / alt > O < alt > 2 < / alt >)</td> <td>Merck</td><td>107210</td><td>Akut toksisite.</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>Akut toksisite. Solunum hassasiyeti. Kanserojenlik. Yanıcı.</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan, TRIS bazı (C4H11NO3</td>)<td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>Cilt ve göz tahrişi.</td></tr><tr><td>Tris Tamponlu Tuzlu Su (TBS), tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>Di- Sodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na2HPO4 x 2H < alt > 2 O)</td> <td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat (NaH < alt > 2 < / alt >PO < alt > 4< / alt > x 1H < alt > 2 < / alt >O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO sitomasyon yıkama tamponu 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>2-8 °C'de saklanmalıdır; Bakteri üremesini engellemek için C. Köpürmekten kaçının.</td></tr><tr><td>N, N-Dimetilformamid; DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>Yanıcı. Akut toksisite.</td></tr><tr><td>Cam lameller 24 x 36 mm </td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit, conc. (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>Aşındırıcı, tahriş edici, geçirgen. Akciğer hassaslaştırıcı (asit sisi olarak). Zehirli.</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit çözeltisi hacimsel, 2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>Aşındırıcı, tahriş edici, geçirgen. Akciğer hassaslaştırıcı (asit sisi olarak). Zehirli.</td></tr><tr><td>Sodyum nitrit, ReagentPlus, &#8805; % 99.0 (NaNO2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>Oksidan. Zehirli. Çevre için tehlikelidir.</td></tr><tr><td>Etilenedinitrilotetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>Oral maruziyetler üreme ve gelişimsel etkilere neden olabilir.</td></tr><tr><td colspan="4"> Equipment</td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P Vakum Sızma İşlemcisi</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz</td><td></td></tr><tr><td>Hacker-Bright 8000 Serisi Taban Kızağı Mikrotom </td><td>Hacker aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ev tipi yemek vapuru </td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sıçan santral sinir sistemi immunohistokimyasal analizi ve Çevresel lenf nodu doku bölümler

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

İmmünohistokimya (İHK) son derece özgün, güvenilir ve çekici protein görselleştirme sağlar. Bir IHC tabanlı renkli etiketleme doğru performans ve yorumlama gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gibi yüksek yağ içeriğine sahip dokusunda hedef proteinler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için kullanılan, özellikle zordur. Bizim protokol, özellikle fare sinir sistemi ve nöro etkilenen periferal lenf düğümleri (LN), hem de yapısal ve çözünebilir proteinlerin tespiti için düzeltilmiş standart immün tekniğinin bir arıtma temsil eder. Bununla birlikte, daha fazla değişiklik olan veya olmayan, protokol olasılıkla da burada sunulan başka organ ve türlerde, diğer ilgili protein hedeflerinin tespiti için kullanılabilir.

Çift immunostainings (ko-boyama) formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan CNS LN bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. 3-5 mikron kalınlığında doku dilimleri önceden kaplanmış yapışkan cam slaytlar üzerine sonradan monte edilmiş ve daha önce 10,11,12 tarif edildiği gibi muamele, bir kızak mikrotom kullanılarak kesilmiştir. Kısaca, deparaffinizing doku rehidrasyon ve endojen peroksidaz inaktivasyonu ardından bölümler, spesifik olmayan bağlama merkezlerini ortadan kaldırmak ...

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Bu prosedürün genel amacı, sıçan dokusundaki spesifik bir proteini hedeflemektir. Bu işlem; önce dokunun izole edilmesi, fikse edilmesi ve parafine gömülmesi, ardından dokunun kesilmesi ve lamlara monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise parafine gömülmüş doku kesitlerinin deparafine edilmesi ve rehidrasyonu, ardından endojen peroksidazın bloke edilmesidir.Ardından, antijen geri kazanımı ile epitoplar açığa çıkarılır. Sonrasında, antikorlar eklenmeden önce spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için bloklama işlemi gerçekleştirilir. Son adım, primer ve sekonder antikorlarla immunetiklemede spesifik epitopu saptamak ve etiketli sekonder antikordan gelen sinyali geliştirmektir.Sonuç olarak, doku kesitlerindeki protein lokalizasyon örüntüsünü göstermek için ışık mikroskobu kullanılarak sinyal görselleştirilir. Bu yöntem, sıçan merkezi sinir sistemindeki ve periferik lenf düğümlerindeki protein lokalizasyon ve ekspresyon örüntüleri hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer organlara ve türlere de uygulanabilir. Prosedürün gösterimi bir teknisyen tarafından gerçekleştirilecektir.Kendisi, Karolinska Institutet'teki mikrobiyoloji, tümör ve hücre biyolojisi merkezinin temel tesisinden Katalin Benedek. Doku hazırlığına başlamak için, diseke edilmiş beyin, spinal kord ve periferik lenf nodu dokularını yüzde dört paraformaldehit içine daldırın ve 24 saat boyunca dört derece Celsius'ta bekletin. Dokular fikse edildikten sonra, dokuyu P-B-S içerisine aktarın ve ileri işlemlerleye kadar dört derece Celsius'ta saklayın.Dokuların işlemine başlamak için, dokuyu yaklaşık beş milimetrelik parçalara ayırmak amacıyla bir jilet kullanın. Ardından, vakumlu infiltrasyon işlemcisi ile doku sertleştirme işlemini başlatın. Standart prosedür; artan konsantrasyonlarda etanole daldırma, ardından ksilol ve son olarak parafin kullanımı üzerine kuruludur.Ardından, dokuyu bir kalıba yerleştirin. Parafin blok oluşturmak için örneğin etrafına sıvı parafin dökün ve oda sıcaklığında saklayın. Dokuyu kesme işleminden önce, parafin bloğu soğuk plaka üzerinde veya buzdolabında gece boyunca soğutun.Parafin blok soğuduktan sonra, bloğu bir bıçak boyunca ileri geri hareket edebilen bir sledge mikrotomun sabit tutucusuna yerleştirin. Ardından, bloğu ve mikrotom bıçağını; bıçak geometrisine, kesme hızına ve tekniğine bağlı olan optimal açıya ayarlayın. Parafin bloktan beş mikron kalınlığında üç adet enine kesit alın.Ardından, kesilen kesitleri bir su kabına aktarın ve kesitleri sudan alarak ticari, önceden kaplanmış yapışkanlı bir cam lama monte edin. Sonra, kalıntı suyu ve olası hava kabarcıklarını gidermek için monte edilen kesiti dikkatlice bir kağıt havluya bastırın. Monte edilen lamları, 50 ile 60 degrees Celsius dereceye ayarlanmış bir etüvde birkaç saat boyunca kurutun.Lamlar kuruduktan sonra, lamları iki kez, her seferinde 15 ila 20 dakika boyunca ksilol içerisinde bekletin. Ardından, her lamı yüzde 99 etanol ile durulayın. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için kesitleri, yüzde 0,25 hidrojen peroksit içeren bir metanol çözeltisinde 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, artan su içeriğine sahip etanol çözeltileri ile durulayarak doku kesitlerinin rehidrasyonuna devam edin. Son rehidrasyon adımını distile su içerisinde gerçekleştirin. Lamel kapama işlemi tamamlanana kadar kesitlerin nemli kaldığından emin olun.Antijeni geri kazanmak için, lamları bir ev tipi buhar makinesi ve pH 8.5 EDTA tamponu ile 60 dakika boyunca ısıtın. Ardından, lamları oda sıcaklığında yaklaşık bir saat boyunca soğutun. Lamlar soğuduktan sonra, her lamı Tris tamponlu salinde (T-B-S) üç ila beş kez durulayın.Ardından, spesifik olmayan arka plan reaksiyonlarını engellemek için doku kesitlerini, yüzde 10 fetal calf serum ve yüzde 90 yıkama tamponu içeren bir bloklama solüsyonunda, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Doku kesitleri bloklandıktan sonra, gerekli miktardaki primer antikorları bloklama solüsyonunda seyreltin ve slaytları bu primer antikor solüsyonunda dört degrees Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, slaytları T-B-S tamponu ile üç ila beş kez durulayın.Ardından lamları, bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş sekonder antikorlar ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, lamları tekrar üç ila beş kez T-B-S tamponu ile yıkayın. Daha sonra lamları, bloklama çözeltisi içinde 1:100 oranında seyreltilmiş avidin yaban turp peroksidaz kompleksi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Bir saatlik inkübasyon tamamlandığında, lamları T-B-S tamponu ile üç ila beş kez durulayın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde fast blue çözeltisini hazırladıktan sonra, kabı hafifçe sallayın ve elde edilen karışımı süzün. Çözeltiyi cam küvet içindeki lamların üzerine dökün.İnkübasyona 37 °C'de başlayın ve gelişme sürecini her 15 ila 30 dakikada bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin. İnkübasyon tamamlandığında, slaytları T-B-S tamponu ile üç ila beş kez durulayın ve ardından slaytları P-B-S tamponuna aktarın. D-A-B hidrojen peroksit geliştirme solüsyonunu hazırlamak için, önce bir mililitre D-A-B stok solüsyonunu 49 mililitre P-B-S ile seyreltin.16,5 µL hidrojen peroksit ekleyin ve ardından çözeltiyi filtreleyin. Çözeltiyi lamların üzerine dökün ve spesifik sinyali maskeleyebilecek yüksek arka plan gürültüsünü önlemek için belirginleşme sürecini ışık mikroskobu altında kontrol ettiğinizden emin olun. Daha sonra lamları üç ila beş kez PBS ile durulayın ve son olarak distile su veya musluk suyu ile yıkayın.Suda bulunan lamları, sulu montaj medyumu kullanarak doğrudan kapatma camlarıyla kapatın. Kapatma camı ile lam arasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Kesitleri kapattıktan sonra, montaj medyumunun tamamen kuruması için lamları dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.Kurutulmuş lamları oda sıcaklığında saklayın. İmmünizasyonu takiben yedinci günde sıçanlardan izole edilen periferik lenf nodu doku kesitlerinin çift boyaması, cd8 pozitif t lenfositlerinin C-C-L 11 kemokinini salgılamadığını ortaya çıkarmıştır. Buna karşılık, C-C-L 11'in aktive olmuş makrofajlarda bir lizozomal protein markörü olan E-D one ile ko-lokalize olduğu saptanmıştır.Bir sıçanın spinal kordunun IHC çift boyaması; CCL11 üretiminin nöronal perikaryalarda, dendritlerde ve aksonlarda tespit edildiğini, ancak IBA1 pozitif makrofajlarda ve beyinde yerleşik mikroglia hücrelerinde tespit edilmediğini göstermiştir. Ek olarak, ED1 pozitif makrofajların ve beyinde yerleşik mikroglia hücrelerinin çoğunluğunun da CCL11 pozitif olmadığı bulunmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, doku kesitlerinde doğrudan proteinin spesifik ve güvenilir bir immünohistokimyasal hedeflemesinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, fare beyninin bölümlerinin Meynert bölgesinin çekirdek bazalisindeki kolinerjik liflerin immünohistokimyasal boyanmasını göstermektedir. Bölümler bloke edilir ve kolin asetiltransferaza karşı primer ile tedavi edilir, ardından biyotinile edilmiş sekonder antikorlar takip edilir. İkincil antikorlara bağlanan avidin-biotin-peroksidaz kompleksleri eklenir, ardından kromojenik substrat gelir. Kesitler daha sonra kurutulur ve mikroskop altında görselleştirmeden önce monte edilir.

Fare Beyninin Meyner Çekirdeği Basalis'teki Sinir Liflerinin İmmünohistokimyasal Boyanması

Kaynak: Evilsizor, M. N., et. al., Kriyoseksiyonlu Sıçan Beyin Dokusunda İmmünohistokimya için Primer: Mikroglia ve Nöronlar için Örnek Boyama. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, mikroglia ve nöronların mekansal düzenlemesini görselleştirmek için kriyoseksiyonel sıçan beyin dokusu üzerinde adım adım bir immünohistokimya boyama prosedürünü göstermektedir.

Sıçan Koronal Doku Kriyoseksiyonlarının Mikroglia ve Nöronlar için İmmünohistokimyasal Boyanması

Bu giriş seviyesi protokolü, örnek olarak mikroglia ve nöronal elementler için belirteçler kullanarak, kemirgen beyinlerinin immünohistokimyasal boyamasını tamamlamak için gereken reaktifleri, ekipmanı ve teknikleri açıklar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Burada, lenf nodu (LN) kriyokesilere yapışkan tümör hücrelerinin sayısallaştırılmasını sağlayan basit ve ucuz bir yöntemi tanımlıyoruz. LN-yapışık tümör hücreleri ışık mikroskobu ile kolayca tanımlanır ve floresan tabanlı bir yöntemle doğrulanır, tümör hücre bağlayıcılığını LN parenkime bağlayan bir adezyon indeksi verir.

Lenf Nodu Kriyosiyonlarında Tümör Hücre Adezyonunun Ölçülmesi

Büyük pelvik gangliyonlar pelvik organları innerve parasempatik ve sempatik nöronlar içerir. Burada bir diseksiyon yöntemi tanımlamak ve bu gangliyonlar ve ilişkili sinirlerin belirlenmesi için şemalar sağlar. Bu yöntemler daha fazla çalışma için in vivo veya removal post-mortem bu ganglia deneysel manipülasyon uygulanabilir.

Erkek ve Dişi Sıçanlarda Pelvik Otonom Ganglia ve İlişkili Sinirlerin Diseksiyonu

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.

Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Fare merkezi sinir sisteminin histolojik analizi için uygun bir yerçekimi beslemeli perfüzyon yöntemi sunulmaktadır. Fosforile α-sinükleinin immünofloresan tespiti, Parkinson hastalığının bir fare modelinde gösterilmiştir. Bu çalışma aynı zamanda transkardiyal perfüzyon, diseksiyon, doku dondurma/gömme ve dondurulmuş kesit adımlarını kapsamlı bir şekilde tanımlamaktadır.

Fare Merkezi Sinir Sisteminin Histolojik Analizi için Yerçekimi Beslemeli Transkardiyal Perfüzyon Yöntemi

Bu protokol, alerjik rinitin sıçan modelini değerlendirmek için çok renkli bir immünofloresan tekniğini açıklar.

Allerjik Rinit Sıçanlarının Nazal Mukoza Dokusu Kesitlerinde Çok Renkli İmmünoassay ile İmmünofloresan Etiketleme

Öğrenin sıçan santral sinir sistemi ve çevresel lenf nodu dokularında çift immunohistokimyasal boyama yöntemini. Bu protokol protein lokalizasyonunu görselleştirerek sinirbilim ve immünoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Daha fazla video keşfet