Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Bu prosedürün genel amacı, sıçan dokusundaki spesifik bir proteini hedeflemektir. Bu, önce dokunun izole edilmesi, sabitlenmesi ve parafin gömülmesi, ardından dokunun bölümlere ayrılması ve slaytlara monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, parafine gömülü doku bölümlerini deparafin ve rehidre etmek ve daha sonra endojen peroksidazı bloke etmektir.

Daha sonra, epitoplar antijen alımı ile ortaya çıkarılır. Daha sonra, antikorları eklemeden önce spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için blokaj gerçekleştirilir. Son adım, primer ve sekonder antikorlarla immüno-etiketleme yoluyla spesifik epitopu tespit etmek ve etiketli sekonder antikordan gelen sinyali geliştirmektir.

Sonuç olarak, sinyal, doku bölümlerindeki protein lokalizasyon modelini göstermek için ışık mikroskobu kullanılarak görselleştirilir. Bu yöntem, sıçan merkezi sinir sistemindeki ve periferik lenf düğümlerindeki protein lokalizasyonu ve ekspresyon paternleri hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer organlara ve türlere de uygulanabilir. Prosedürü göstermek için bir teknisyen olacaktır.

Adı, Karolinska Enstitüsü'ndeki mikrobiyoloji tümör ve hücre biyolojisi merkezinin çekirdek tesisinden Katalin Benedek. Doku hazırlığına başlamak için, disseke edilmiş beyin, omurilik ve periferik lenf nodu dokusunu yüzde dört paraformaldehite batırın ve 24 saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Dokular sabitlendikten sonra, dokuyu PBS'ye aktarın ve daha sonraki işlemlere kadar dört santigrat derecede saklayın.

Dokuyu işlemeye başlamak için, dokuyu yaklaşık beş milimetre büyüklüğünde porsiyonlara kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Ardından, bir vakum infiltrasyon işlemcisi ile doku sertleştirme işlemini başlatın. Standart prosedür, artan etanol konsantrasyonlarına, ardından ksilol ve son olarak parafine daldırmaya dayanır.

Ardından, dokuyu bir kalıba yerleştirin. Bir parafin bloğu oluşturmak için sıvı parafini numunenin etrafına dökün ve oda sıcaklığında saklayın. Dokuyu bölümlere ayırmadan önce, parafin bloğunu gece boyunca soğuk plakada veya buzdolabında soğutun.

Parafin bloğu soğutulduktan sonra, bloğu bir bıçak üzerinde ileri geri hareket edebilen bir kızak mikrotomunun sabit tutucusuna yerleştirin. Ardından, bloğu ve mikrotom bıçağını, bıçak geometrisine ve kesme hızına ve tekniğine bağlı olarak en uygun açıya ayarlayın. Parafin bloğundan beş mikron kalınlığında üç kesit kesin.

Ardından, kesilen bölümleri bir su kabına aktarın ve sudan gelen bölümleri önceden kaplanmış ticari bir yapışkan cam slayt üzerine monte edin. Ardından, kalan suyu ve olası hava kabarcıklarını gidermek için monte edilen bölümü bir kağıt havluya dikkatlice bastırın. Monte edilmiş slaytları 50 ila 60 santigrat dereceye ayarlanmış bir ocakta birkaç saat kurutun.

Slaytlar kuruduktan sonra, slaytları her biri 15 ila 20 dakika boyunca iki kez ksilole batırın. Ardından, her slaytı yüzde 99 etanol ile durulayın. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için, bölümleri yüzde 0.25 hidrojen peroksit içeren bir metanol çözeltisi içinde 30 dakika inkübe edin.

Ardından, artan su içeriği içeren etanol çözeltileri ile durulayarak doku bölümlerini yeniden sulandırmaya devam edin. Son rehidrasyon adımını damıtılmış suda gerçekleştirin. Kapak fişleri monte edilene kadar bölümleri nemli tuttuğunuzdan emin olun.

Antijeni almak için, slaytları ev tipi bir buharlı pişirici ve EDTA tamponu ile pH 8.5'te 60 dakika ısıtın. Ardından slaytları oda sıcaklığında yaklaşık bir saat soğutun. Slaytlar soğuduktan sonra, her slaytı üç ila beş kez Tris tamponlu tuzlu su veya TBS ile durulayın.

Daha sonra, spesifik olmayan arka plan reaksiyonlarını bloke etmek için doku bölümlerini oda sıcaklığında yüzde 10 fetal buzağı serumu ve yüzde 90 yıkama tamponu içeren bir bloke edici solüsyon içinde 30 dakika inkübe edin. Doku bölümleri bloke edildikten sonra, bloke edici solüsyonda gerekli miktarda primer antikor seyreltin ve slaytları bu primer antikor solüsyonunda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, slaytları T-B-S tamponu ile üç ila beş kez durulayın.

Daha sonra slaytları, oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin. Daha sonra, slaytları T-B-S tamponu ile üç ila beş kez tekrar durulayın. Daha sonra, slaytları avidin yaban turpu peroksidaz kompleksi ile inkübe edin, bloke edici çözelti içinde bir ila 100 oranında seyreltilmiş, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bir saatlik inkübasyon tamamlandıktan sonra, slaytları TBS tamponu ile üç ila beş kez durulayın. Metin protokolünde anlatıldığı gibi hızlı mavi çözeltiyi hazırladıktan sonra, tabağı hafifçe çalkalayın ve elde edilen karışımı süzün. Çözeltiyi cam küvetteki slaytların üzerine dökün.

İnkübasyona 37 santigrat derecede başlayın ve her 15 ila 30 dakikada bir ışık mikroskobu altında gelişen süreci gözlemleyin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, slaytları T-B-S tamponu ile üç ila beş kez durulayın ve ardından slaytları PBS tamponuna aktarın. D-A-B hidrojen peroksit geliştirme çözeltisini yapmak için, önce bir mililitre D-A-B stok çözeltisini 49 mililitre PBS ile seyreltin.

16,5 mikrolitre hidrojen peroksit ekleyin ve ardından çözeltiyi süzün. Çözeltiyi slaytların üzerine dökün ve belirli sinyali maskeleyebilecek yüksek arka plandan kaçınmak için geliştirme sürecini ışık mikroskobu altında kontrol ettiğinizden emin olun. Ardından, slaytları PBS ile üç ila beş kez durulayın, ardından damıtılmış su veya musluk suyu ile son bir yıkama yapın.

Kızakları kapak kızakları ile sulu montaj ortamı kullanarak doğrudan sudan monte edin. Kapak kayma ile sürgü arasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Bölümleri monte ettikten sonra, montaj ortamının tamamen kurumasını sağlamak için slaytları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Kurutulmuş slaytları oda sıcaklığında saklayın. Aşılamadan sonraki yedinci günde sıçanlardan izole edilen periferik lenf nodu doku kesitlerinin çift boyanması, cd8 pozitif T lenfositlerinin kemokin C-C-L 11 salgılamadığını ortaya çıkardı. Alternatif olarak, C-C-L 11'in, aktive edilmiş makrofajlarda lizozomal protein için bir belirteç olan E-D ile birlikte lokalize olduğu bulundu.

Bir sıçanın omuriliğinin IHC çift boyanması, nöronal perikarya, dendritler ve aksonlarda C-C-L on bir üretimini tanımladı, ancak I-B-A bir pozitif makrofajlarda ve beyinde yerleşik mikroglia hücrelerinde değil. Ek olarak, E-D bir pozitif makrofajların ve beyinde yerleşik mikroglia hücrelerinin çoğunluğunun da C-C-L 11 pozitif olmadığı bulundu. Bu videoyu izledikten sonra, proteinin doğrudan doku kesitlerinde spesifik ve güvenilir bir immünohistokimyasal hedeflemenin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.