Name: İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Öğrenin Saccharomyces cerevisiae'de protein yeniden katlanmasını canlı ortamda floresan mikroskobu ve enzimatik analizlerle izleme yöntemini. Bu teknik, proteostaz ağ bileşenlerinin rollerini araştırmada kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma KAM ve Ayrıca OFF sağlamak için Toronto Üniversitesi&#39;nde John Glover teşekkür JLA için Mikrobiyoloji Robert D. Watkins Yüksek Lisans Araştırma Bursu bir American Society Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS-074.696) bir hibe ile desteklenmiştir GFP kaynak plazmid.

1. Plazmid OFF-GFP İçeren Suşlarının İnşaatı Bu çalışma için, Saccharomyces cerevisiae suşu BY4741 (MAT bir, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) maya nakavt toplama (Açık Biyosistem / Thermo Scientific) bir HSP104 silme suşu ile birlikte kullanılmıştır. Silme Western blot analizi için bir Hsp104 spesifik antikor kullanılarak doğrulandı. OFF-GFP yazarlara talep üzerine Toronto 17 Üniversitesi ve elde de Glover laboratuvar elde edilen plazmid bir LEU2-tabanlı kaynak yapılmış, p426MET25-OFF-GFP ifade edildi. III-gfp plazmit füzyon proteininin ifadesi doğal arttırıcıları olan MET25 metiyonin bastırılabilir promotörü tarafından kontrol edilir. Plazmid Gietz ve arkadaşları uyarlanmış bir protokol kullanılarak, her bir suş dönüştürüldü. arkadaşları, 1995: <ol><li> 25 ml o Santrifüj<html> 2 dakika 4.400 rpm&#39;de 50 ml konik tüp f log fazı hücreleri, çift distile H 2 0 (GKD 2 O) 500 ul ile yıkayın ve yüzen kısım atın. </li><li> TE / LiAc (Tris-HCI 10 mM, pH = 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 M lityum asetat) ve 250 ul içinde süspanse hücreleri. 20 dakika boyunca karıştırmadan 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Taşıyıcı DNA 5 ml (50 mg) ve plazmid DNA 5 ul (0.1-5 mg) ile birlikte, yeni bir tüpe yetkili hücreleri 50 ul aktarın. PEG / TE / LiAc (TE / LiAc artı% 40 polietilen glikol gibi) bu karışıma 300 ul ekleyin ve ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca 30 inkübe hücreleri. </li><li> 6 dakika boyunca 42 de bu karışım ve ısı şoku ° C ila 1/10 hacim (v / v) DMSO (36 ul) ilave edilir. </li><li> 30 sn ve kaldır yüzen kısım için 6.000 rpm karışımı santrifüj. Urasil (SC-URA) eksik sentetik tam medya üzerine steril GKD 2 0 ve plaka hücreleri 100 ul hücreleri tekrar süspansiyon. </li></ol> 2. OFF-GFP indüksiyon önce ısı şok proteini çoğunluğu yeni terminal yaşlanmayla ilişkili hücresel yetersizlikler nedeniyle zaman içinde toplanmış olan proteinler önlemek için yapılır, böylece hücrelerin log fazı bir kez nt &quot;&gt; III-GFP indüklenir. <ol><li> Gün 1: 30 SC-Ura 5 ml inkübe hücreleri ° C döner O / N </li><li> 2. Gün: ölçün OD 600 ve SC-URA OD 600 ~ 0.2 5 ml inokülasyon taze kültür. </li><li> Onlar log fazı OD 600 ~ 0.8-1.0 ulaşmak ° C kadar 30 rotasyon ile kültür inkübe edin. </li><li> GKD 2 0 500 ul 3 dakika, süzün yüzen kısım ve tekrar süspansiyon hücre pelet için 4,400 rpm&#39;de 15 ml konik tüpler hücreleri Santrifüj, bir mikrosantrifüj tüp transferi çözüm. </li><li> 6.000 rpm&#39;de santrifüj ve yüzen kısım atın. </li><li> SC-URA-MET 5 ml süspansiyon hücreleri. Hücreler, 30 ° C&#39;de 1 saat boyunca bu ortam içinde dönen inkübe edilmelidir </li><li> Santrifüj hücreleri ve tekrar GKD 2 0 olarak yıkama ve yüzen kısım atın. </li><li> Resuspe100 ug / protein ekspresyonu inhibe ettiği ve Adım 3 hemen devam etmeye sikloheksimid ml içeren 5 ml SC-URA ortam nd hücreleri. </li></ol> 3. Enzimatik OFF-GFP Kurtarma Testi Bu testte bir popülasyonda aktif enzim düzeylerini belirlemek için nicel bir yaklaşımdır. <ol><li> Bu deney için hazırlanması: <ol class="lroman"><li> Her numune için OD 600 ölçün. </li><li> D-luciferase gerekli miktarda hazırlayın örneklerin sayısına göre ve kopya sayısı artı boru için yaklaşık olarak 1.200 ul istenilen gerekli. D-luciferase son konsantrasyon hücrelerinin 100 ul başına ~ 23 mikrogram olduğunu. Başlangıçta bu 7.5 mg / ml &#39;lik bir stok çözeltisi konsantrasyonda su içinde çözülür ve önceden deneme için 455 ug / SC ml&#39; ye seyreltildi. Her bir örnek D-luciferase kullanılan 2.4 ml toplam sonuçlanan analiz edildi için Şekil 2&#39;de, üç çoğaltır. </li><li> Flaş lumi Programı plaka okuyuculüminesans yöntemi (BioTek Gen5 &quot;Enjeksiyon ile Lüminesans Flaş Testi&quot; uyarlanan; diğer enstrümanlar üreticinin talimatlarına için) <ol class="lalpha"><li> 30 ° C sıcaklık ayarı </li><li> , D-luciferase ekleyin sallamak, ve tek tek her iyi okumak için plaka okuyucu ayarlayın. </li><li> Lüminesans okuyun (nokta okuma, 5 saniye entegrasyon süresi, 180 duyarlılık düzeyi) </li><li> 5 dakika boyunca her bir okuma Karıştırılmış arasında iyileşme testi için, 20 dakika gecikme ve ilave 5 dakika karıştırın. </li><li> Bir enjektörün D-luciferase 50 ul koyun. </li></ol></li></ol></li><li> Hücreler protein sentezi durdurmak için sikloheksimid içeren medya eklendikten sonra ön ısıtma-şok lüminesans hemen ölçülür. <ol class="lroman"><li> Sağlam bir beyaz 96 plaka içine çoğaltır istenilen sayıda her bir örnek için hücrelerin 100 ul aktarın. </li><li> Kontroller bir su boş ve boş bir vektör içeren hücreleri içermelidir. </li><li> SPE ile okuma başlarcifications Yukarıda listelenen. </li></ol></li><li> III-GFP OFF yarımı denatüre etmek için, 42 yaşında bir camdan yapılmış bir kültür tüp içinde 5 ml kültür ° C&#39;de inkübe edin, 25 dakika boyunca sallayın. </li><li> Hücreler zaman noktası sıfırdır inkübatör, kaldırılır sonra Kurtarma test lüminesans okuma hemen başlar. İlk zaman noktası ve 90 dakika boyunca her 30 dakika için yukarıda tarif edildiği gibi aynı ölçüde lüminesans. </li><li> OD 600 (OD 600 ile ön ısıtma-şok değerleri bölmek) göre ayarlanır olan ön ısıtma-şok lüminesans değerlere örnekleri normalleştirmek. </li></ol> 4. Floresan Mikroskopi Bu deney bir hücre popülasyonunda zamanla agrega çözünürleştirme belirlemek için bir yarı-nicel bir yöntemdir. <ol><li> İndüksiyon, Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi, aynı protokol 1-8 adımlar. </li><li> Aynı zaman noktalarında (Bölüm 3, Adım 4) yukarıda tarif edildiği gibi alınmıştır, ancak mikrofon içinroscopy 1 ön ısıtma-şok da hücre ml ve her iyileşme süresi noktası ve ° C kültür tüp içinde 30 dönen inkübe örnekleri toplamak. </li><li> Görselleştirme: <ol class="lroman"><li> 30 sn ve kaldır yüzen kısım için 6.000 rpm hücre 1 ml santrifüj. </li><li> GKD 2 O. 2 ul tekrar süspansiyon hücre pelet </li><li> Pil, slayt üzerinde% 2 düşük erime agaroz 2 ul 2 ul karıştırın ve bir kapak kayma ekleyin. Hücreleri tek bir düzlem elde etmek için hafifçe kapak kayma ortasındaki parmak bastırın ve kapak kayma taşımak zor kadar döndürün. </li><li> Hücreler floresan mikroskop 100X yağ objektif kullanarak raporlarının yer; GFP floresan görselleştirmek için hücreleri ve FITC filtresi görselleştirmek için DIC kullanın. </li><li> Kantitatif için her noktada her bir suş için birden fazla fotoğraf çekmek. Resimler için alanları nicel sonrası deneysel analizi için ~ 15-30 hücreleri içermelidir. </li><li> Agrega içeren hücrelerin yüzdesi hesaplamak için, 50 saymak-100 Hücreleri toplam ve agrega içeren hücrelerin sayısı bölün. </li></ol></li></ol> 5. Tek Hücre Mikroskopi Bu yöntem, zaman içinde tek bir hücrede bireysel agregaların çözündürme takip etmek için kullanılır. <ol><li> Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi III-GFP ekspresyonunu, 1-8 adımlar. </li><li> Sonra ısı-şok, 2 dakika 4.400 rpm&#39;de 15 ml konik tüp santrifüj hücreleri. </li><li> GKD 2 O. 20 ul su ve tekrar süspansiyon 500 ul hücreleri yıkayın </li><li> Her bir suş için, bir SC-URA agar plaka bir 5x5 mm bölümünü kesip Petri kabı, pipet ile agar yüzeyi etrafında hücreleri ve yayılma ul pipet 4 ile temas olan yüzey kullanarak. ~ 1 dakika bekletin. </li><li> Bir ~ 55 mm cam alt çanak No 0 yüzü aşağı agar küp bölümü yerleştirin ve hafifçe bastırın için cımbız kullanın. </li><li> Görselleştirme: <ol class="lroman"><li> Tarikatı i-iii bakiyon 4. </li><li> Set kültür yoğunluğuna bağlı olarak her bir suş için 2-4 odak noktaları için koordine eder. </li><li> (- Bir 0.5-1.0 mikron dilim kalınlığında / + 15 mikron) bir 90 dakika süreyle her 5 dk uygun yelpazesi ile bir Z-yığını ile fotoğraf çekmek için kamera ayarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li>
<li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li>
<li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104%2C+Hsp70%2C+and+Hsp40%3A+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li>
<li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li>
<li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li>
<li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li>
<li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+bioluminescence%3A+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li>
<li>Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorimoto%2C+RI+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22">Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol</a>. 76, 91-99 (2011).</li>
<li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li>
<li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li>
<li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li>
<li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+%28GFPuv%29+at+various+pH+values%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li>
<li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li>
<li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+disaggregase+machinery%3A+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319(2011).</li>
<li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li>
<li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hsp70+subfamily%2C+Ssa%2C+in+protein+folding+in+yeast+cells%2C+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li>
<li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones%3A+budding+yeast+%28Saccharomyces+cerevisiae%29+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda modeli protein FFL-GFP maya disaggregase, Hsp104 protein yeniden-solübilizasyon ve onarım katkıda göstermek için kullanılmıştır. Enzimatik deneyler ve diferansiyel olarak mikroskobik yeniden katlama etkinliği ve verimi belirlemek için, aynı alt-tabaka proteini durumunu sorguya. Enzimatik kurtarma testlerinin sonuçları, verimsiz hsp104D mutant soyu içinde maksimum iyileşme değil sadece olduğunu göstermektedir, ancak açılımı stres başlangıç ​​büyüklüğü mutant suşu (Şekil 2) daha fazla i...

İnsanlarda Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları gibi nörodejeneratif hastalıklar yanlış katlanması ve protein agregasyonu 10 ile bağlantılı olmuştur. Hücreler katlanan aktif yapıları 6 içine hücresel proteinlerin kinetik yakalama önlemek için moleküler şaperonlar kullanır. Chaperones hücre içinde karmaşık etkileşim ağları katılmak, ancak tamamen bu etkileşimlerin toplamı organizma proteostasis nasıl katkıda anlaşılamamıştır. Sitozolik protein katlanması çoğunluğu sorumlu başlıca chaperones biri 70 kD ısı şok proteini (Hsp70) aile 19&#39;dur. Bu, gösterilmiştir ki, Hsp70 azalır maya kaybı olgunlaşmamış heterolog bir şekilde eksprese OFF katlamak ve in vivo 18, 7, endojen proteinin, ornitin transcarbamoylase, yeniden kapatmak için yeteneği. Yakın-gerçek zamanlı çözünürlüğü ile katlama analiz yeteneği anlaşılmasını kolaylaştırmak nasıl ek hücresel faktörler devamBu Hsp70 bağımlı işlemine destek olmaktır. Buna ek olarak, katlama / reaksiyonlar refolding bu katkı proteinler tamamen bağımlı olmayabilir, bu nedenle testleri kinetik ve verimlilik büyük ve küçük değişiklikler hem saptamak için yeterli olmalıdır. Maya hücre disaggregase, Hsp104, toplu katlanan proteinleri tamir hayati bir rol oynar. Hsp104 homologlar mantar ve bitki tespit edilmiş olmasına rağmen, bu aile metazoans yok gibi görünmektedir. Bu tür Hsp110 ailesinin gibi diğer chaperones memeliler 16 bilinen Hsp104 faaliyetlerin bazı gerçekleştirmek ileri sürülmüştür. Hsp104 bir AAA +, heksamerik protein kompleksi olduğunu değişiklik protein agrega için maya fonksiyonları, refolding ve onarım 13 katkıda. Hsp70 maya, Ssa1, ve maya Hsp40, Ydj1 birlikte Hsp104, maya hücreleri 5, 8 denatüre OFF geri kazanımı için gereklidir. Küçük ısı şok proteini, Hsp26, aynı zamanda requi olduğu gösterilmiştirOFF 2 Hsp104 aracılı ayrıştırma için kırmızı. Ffl alt tabaka, aktif sahada lusiferin ve ATP ve oksijen, decarboxylates gerektiren bir konformasyonel değişimin ardından bağlanan bir iki-domenli bir proteindir oxyluciferin, karbon dioksit (CO2), adenozin monofosfat (AMP) ve ışık 11, serbest substrat 9, 3. Ticari olarak temin edilebilen OFF substrat, D-luciferase bir luminometrede 15 kullanılarak tespit edilebilir 550-570 nm arasında ışık yayılması ile sonuçlanır. OFF açılımı üzerine kimyasal veya ısıl işlemler ve hızla agrega gelen denatürasyon için zarif duyarlıdır. 39-45 arasında sıcaklıklara maruz kaldığında ° C OFF geri dönüşümlü gelişeceğini ve inaktif 12 olduğunu. Bunun tersine GFP ve türevleri gerilme 14 açılımı proteini için son derece dayanıklıdır. Bu nedenle, bu iki proteinin füzyon fonksiyonel G hedefleme yeteneğine sahip bir deneysel olarak oynak parçası olarak işlev sağlar OFFFP nüfus ve tek bir hücre düzeyde hem de floresan mikroskobu kullanarak görüntülenebilir mevduat hücre içi. Otomatik mikroskobu ile birleştiğinde bir yarı-otomatik modlu plaka okuyucu enzimatik test uygulanması kinetik ve reaksiyon refolding getirisi görülmemiş eş zamanlı değerlendirilmesi sağlar. Buna ek olarak, ökaryot modeli, Saccharomyces cerevisiae kolay moleküler genetik hassas protein kalitesi kontrol ağ manipülasyon ve hücresel stres tepkisi ve proteostasis katkıda bulunan yeni bir oyuncu tespit etmek Buluşa dayalı yaklaşımlar için fırsat hem de sağlar. Bu çalışmada, III-GFP ifade vahşi tip (WT) ve HSP104 silme suşları protein denatüre ısı şokuna tabi tutulur. OFF-GFP refolding bir iyileşme süresi boyunca ifade proteom tamiri için bir proxy okuma olarak bir enzimatik tahlil ve mikroskopi hem aracılığıyla izlenir. WT hücrelere karşılaştırıldığında, biz th göstermekE Hsp104 silme gerginlik denatüre OFF 2 reaktivasyonu içinde Hsp104 için bir rol kurulması önceki bulguları destekleyen, FFL-GFP refolding de ~% 60 daha az verimlidir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Synergy MX Mikroplaka Okuyucu</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC Konfokal Ters Mikroskop</td><td>Olympus, Tokyo Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumitrac 200 beyaz 96 oyuklu plakalar</td><td>ABD Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0 dijital mikroskopi yazılımı</td><td>Akıllı Görüntüleme Yenilikleri, Inc. Denver, CO, Amerika Birleşik Devletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>(LiAc) Lityum Asetat</td><td>Sigma</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>PEG (polietilen glikol)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>Gündoğumu</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>Gündoğumu</td><td>1306-030</td><td></td></tr><tr><td>sikloheksimid</td><td>Acros Organics</td><td>357420050</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>düşük eriyik agaroz</td><td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>daldırma yağı</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde tahliller<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Protein katlanması / biyogenezi kombine süreçler olarak tanımlanan Proteostasis, refolding / onarım ve bozulması, zararlı sonuçlara 1 önlemek için korunması gerekir hassas bir hücresel dengedir. Bu dengeyi bozabilir iç ve dış faktörler protein toplama, toksisite ve hücre ölümüne yol açabilir. İnsanlarda bu, Huntington, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları gibi nörodejeneratif hastalıkların 10 ile ilişkili semptomlar için önemli bir katkıda bulunan bir faktördür. Bu proteostasis bakım katılan proteinler bu zayıflatan hastalıklar için tedavi geliştirmek amacıyla tespit edilmesi bu nedenle önemlidir. Bu makale yeşil flüoresan protein (FFL-GFP) erimiş modeli protein ateşböceği lusiferaz kullanarak yakın gerçek zamanlı çözünürlükte in vivo protein katlanması izleme teknikleri anlatılmaktadır. OFF kısmı strese bağlı m son derece hassas olduğu için OFF-GFP eşsiz bir model kimerik proteindirenzim 12 inaktive isfolding ve toplama,. Lusiferaz aktivitesi, bir enzimatik deney kullanılarak izlenir, ve GFP kısmı otomatik mikroskopi kullanılarak çözülebilir ya da toplu OFF görüntülenmesi için bir yöntem temin edilmektedir. Bu birleştiğinde yöntemler refolding ve stres sonra enzimin fonksiyonel reaktivasyonu hem analiz etmek için iki paralel ve teknik olarak bağımsız yaklaşımlar içermektedir. Faaliyet kurtarma doğrudan daha iyi protein chaperones gibi protein kalite kontrol faktörler bu işlevleri gerçekleştirmek için işbirliği nasıl anlamak için ayrıştırma ve yeniden çözünmüş kinetiği ile ilişkili olabilir. Buna ek olarak, gen silme ya da mutasyon bu işlem için özel protein veya protein alt birimlerinin katılım test etmek için de kullanılabilir. Bu yazıda bu yaklaşım doğrulamak için protein refolding için, sistemi 5 refolding Hsp40/70/nucleotide değişim faktörü (NEF) ile ortak bilinen protein disaggregase Hsp104 13, katkıları inceleyin.

Maya disaggregase bağlıdır, Hsp104 verimli ısı denatüre proteinlerin yeniden kapatmak için. OFF-GFP faaliyeti bir parlaklık flaş testi Şekil 1 kullanarak, bir 25 dakika ısı şok sonrası izlenmiştir. Şekil 2&#39;de gösterilen bu otomatik test sonuçları, sonuçta WT hücrelerinde&gt;% 80 düzelme sağladı 90 dakika boyunca aktivitesinde kademeli bir artış saptandı. Hsp104Δ gerginlik aynı zaman dilimi içinde, orijinal aktivitesinin% 19 iyileşti. Ayrıca, ilk inaktivasyon ölçüde Hsp104 s...

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif eder<em&gt; In vivo</emIçinde&gt; protein katlanması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bir model ısıyla denatüre edilmiş proteinin yeniden katlanması, bu tepkin madde kullanılarak floresan mikroskop ve protein kalite kontrol proteostasis ağ bileşenlerinin rollerini araştırmak için bir enzimatik deneyi ile aynı anda kontrol edilebilir.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Bu prosedürün genel amacı, proteinin in vivo yeniden çözünmesini ve katlanmasını, floresan mikroskobu ve enzimatik analizler aracılığıyla neredeyse gerçek zamanlı olarak izlemektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin, yeşil floresan proteine füzyonlanmış ateş böceği lusiferazı içeren bir plazmid veya F-F-L-G-F-P ile transforme edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, F-F-L-G-F-P proteininin ekspresyonunun indüklenmesi ve ardından protein üretimini durdurmak için sikloheksimid uygulamasıdır.Ardından, termal denatürasyon öncesinde ve sonrasındaki belirli bir süre boyunca lusiferaz aktivitesini ölçün. Son adım, F-F-L-G-F-P proteininin çözünürlüğünü belirlemek için hücreleri görselleştirmektir. Nihayetinde, birden fazla suşta model bir açılmış enzimin reaktivasyon verimliliğini nicelleştirmek için floresan mikroskobu ve enzimatik analizler kullanılır.Bu tekniğin uç nokta analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein aktivitesini zaman içindeki agregasyon durumuyla ilişkilendirebilmenizdir. Bu iki fenomen arasındaki ilişkiyi belirlemek için bu yöntem; belirli şaperonların ve COS şaperonlarının model bir proteinin disagregasyonuna ve yeniden katlanmasına nasıl katkıda bulundu

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.

Hücre içi Refolding Testi

Bu videoda, deterjan fraksiyonlaması ile birlikte sikloheksimid muamelesi kullanılarak yanlış katlanmış proteinler için bir bozunma testi açıklanmaktadır. Bu yöntem, yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemeye ve protein döngüsünün derinlemesine mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Burada, enzimatik modifikasyon deneyleri için maya yüzeyinde görüntülenen substratların kullanılması için bir protokol sunuyoruz. Platform, temsili bir enzimatik modifikasyon deneyi olarak tirozin fosfataz SHP-2'nin substratlarından birine karşı defosforilasyon aktivitesinin analizi kullanılarak gösterildi.

Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Burada, 80S parçacık oluşumunun analizi için saflaştırılmış, tuzla yıkanmış ökaryot ribozomal alt birimlerin in vitro yeniden ilişkilendirilmesi için ayrıntılı bir protokolü tanımlıyoruz. Bu yöntem, Saccharomyces cerevisiae'nin vahşi tipi bir suşundan izole edilen ribozomal alt birimlerin ve ribozomal protein eL24'te eksik olan mutant suşun analiziyle gösterilmiştir.

In Vitro Tuzla yıkanmış ribozomal alt birimler kullanılarak 80S ribozomal parçacıklarının oluşumunu ölçmek için yeniden ilişkilendirme testi

Öğrenin Saccharomyces cerevisiae'de protein yeniden katlanmasını canlı ortamda floresan mikroskobu ve enzimatik analizlerle izleme yöntemini. Bu teknik, proteostaz ağ bileşenlerinin rollerini araştırmada kullanılır.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller

Daha fazla video keşfet