İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller Saccharomyces cerevisiae

Bu prosedürün genel amacı, floresan mikroskobu ve enzimatik tahliller yoluyla proteinin yeniden çözünmesini ve yeniden katlanmasını in vivo olarak izlemektir. Bu, ilk önce hücrelerin yeşil floresan proteini veya F-F-L-G-F-P'ye kaynaşmış ateşböceği lusiferaz içeren bir plazmit ile dönüştürülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, F-F-L-G-F-P proteininin ekspresyonunu indüklemek ve ardından proteinin üretimini durdurmak için sikloheksimid tedavisidir.

Daha sonra, termal denatürasyondan önce ve sonra bir süre için lusiferaz aktivitesini ölçün. Son adım, F-F-L-G-F-P proteininin çözünürlüğünü belirlemek için hücreleri görselleştirmektir. Sonuç olarak, floresan mikroskobu ve enzimatik tahliller, çoklu suşlarda katlanmamış bir model enzimin yeniden aktivasyonunun etkinliğini ölçmek için kullanılır.

Bu tekniğin uç nokta analizi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, proteinin aktivitesini zaman içinde toplanma durumu ile ilişkilendirebilmenizdir. Bu iki fenomen arasındaki ilişkiyi belirlemek için bu yöntem, protein homeostazı alanındaki, spesifik şaperonların ve COS şaperonlarının bir model proteinin ayrışmasına ve yeniden katlanmasına nasıl katkıda bulunduğu ve hücredeki bu iki aktivitenin nasıl birbirine bağlı olduğu gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Ateşböceği lusiferaz yeşil floresan protein füzyon proteini F-F-L-G-F-P, MET 25 metiyonin bastırılabilir promotörün kontrolü altında bu plazmitten eksprese edilir.

Uyarlanmış bir lityum asetat aracılı protokol kullanılarak, plazmid iki croce visier suşuna, vahşi tip bir suşa ve HSP 1 0 4 için silinen bir suşa dönüştürülür, Bir maya, toplanmış yanlış katlanmış proteinlerin onarımında hayati bir rol oynayan bir maya ayrışır. Bu deneyin başarısı zamanında yapılmasına bağlı olduğundan, ortam, mikro santrifüj, tüpler ve lusiferian içeren F-F-L-G-F-P kültür tüplerinin indüksiyonundan önce aşağıdakiler hazırlanmalıdır. İhtiyaç duyulan Lucifer miktarı, numune sayısına ve istenen kopya sayısına ve ayrıca boru için yaklaşık 1.200 mikrolitreye dayanmaktadır.

Sıcak su banyosunu 42 santigrat derece programına önceden ısıtın. Flaş lüminesans testi için plaka okuyucu, sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarladı, Luciferian sarsıntısı eklemek için plaka okuyucuyu ayarlayın ve uç nokta okumaya ayarlanmış lüminesansı okumak için her bir kuyuyu ayrı ayrı okuyun. Her okuma arasında beş saniyelik entegrasyon süresi ve kurtarma testi için 180 hassasiyet seviyesi, beş dakika sallanacak, 20 dakika gecikecek ve beş dakika daha sallanacak şekilde ayarlanmıştır.

Delucci'yi enjektöre yükleyin ve enjektörü, ertesi gün gece boyunca dönerken 30 santigrat derecede urasil SC eksi YURA içermeyen beş mililitre sentetik tam ortamda F-F-L-G-F-P inkübe hücrelerinin indüksiyonu prosedürünü başlatmak için numune başına yaklaşık 23 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon verecek şekilde 50 mikrolitre Lucifer dağıtacak şekilde ayarlayın. OD 600'ü ölçün ve taze kültürleri beş mililitre SC eksi yura içinde yaklaşık 0.2 OD 600'e aşılayın. Kültürleri, üç dakika boyunca 4.400 RPM'de 15 mililitrelik konik tüplerde 0.8 ve 1.0 santrifüj hücreleri arasında OD 600 olan log fazına ulaşana kadar 30 santigrat derecede rotasyonla inkübe edin.

Hücre peletini 500 mikrolitre çift damıtılmış suda boşaltın, süpernatant ve yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 30 saniye boyunca 6.000 RPM'de bir mikro santrifüj tüp santrifüjüne aktarın ve süpernatan reçine süspansiyon hücrelerini, urasil ve metiyonin içermeyen beş mililitre sentetik tam ortamda atın SC eksi YURA eksi YURA eksi bir saat boyunca 30 santigrat derecede dönerken bu ortamdaki inkübe hücreleriyle buluştu. Metiyoninin çıkarılması, F-F-L-G-F-P'nin ekspresyonunu indükleyecektir: Bir saat sonra santrifüj hücreleri süpernatanttan caydırılır ve DD H2O'da yıkanır DDH'yi attıktan sonra, protein ekspresyonunu inhibe etmek için mililitre başına 100 mikrogram sikloheksimid içeren beş mililitre SC eksi edia'da iki O Resus süspansiyon hücresi.

Hemen enzimatik F-F-L-G-F-P geri kazanım testine geçin. Hücreler sikloheksimid içeren ortamda yeniden süspanse edildikten hemen sonra bu işleme başlayın. Ön ısıtma şoku lüminesansını ölçmek için daha sonra D 600 ölçümünden her numuneden bir mililitre çıkarın.

İlk olarak, katı beyaz 96 oyuklu bir plakada bir su boşluğu ve boş bir vektör içeren hücreler içeren kontrolleri ayarlayın, ardından istenen sayıda kopya ile her numune için 100 mikrolitre hücre aktarın. F-F-L-G-F-P'nin FFL MOTY'sini denatüre etmek için plakayı programlanmış özelliklerle okumaya başlayın. Beş mililitrelik kültürü 42 santigrat derecede 25 dakika çalkalayarak inkübe edin.

Hücreler inkübatörden çıkarıldıktan hemen sonra kurtarma tahlili lüminesans okumalarına başlayın, bu da zaman 0.0'dır. Lüminesansı ilk zaman noktası için ve 90 dakika boyunca her 30 dakikada bir ölçün. Hücreleri floresan mikroskobu için hazırlamak için, 30 saniye boyunca 6.000 RPM'de bir mililitre hücreyi santrifüjleyin ve süpernatan resüsü çıkarın.

Hücre peletini iki mikrolitre DDH iki o içinde süspanse edin. İki mikrolitre hücre artı iki mikrolitre %2 düşük eriyik agros'u bir slaytta karıştırın ve bir kapak fişi ekleyin. Tek bir hücre düzlemi elde etmek için, kapak kaymasının ortasına bir parmağınızı hafifçe bastırın ve kapak kaymasının hareket etmesi zor olana kadar döndürün.

Hücreler, 100 x yağ objektifi kullanılarak bir floresan mikroskopta görselleştirilir. Hücreleri görselleştirmek için DIC'yi ve GFP floresansını görselleştirmek için Fitz filtresini kullanın. Her zaman noktasında her suş için birden fazla fotoğraf çekin.

Kantitasyon için, resimler için alanlar, kantitatif deney sonrası analiz için yaklaşık 15 ila 30 hücre içermelidir. Bu prosedüre başlamak için, daha önce gösterildiği gibi F-F-L-G-F-P ekspresyonunu ve ısı şoku hücrelerini indükleyin ve daha sonra hücreleri iki dakika boyunca 4.400 RPM'de 15 mililitrelik bir konik tüpte santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 500 mikrolitre su ile yıkayın.

Suyu attıktan sonra, hücreleri 10 ila 15 mikrolitre SC eksi yura içinde askıya alın. Her suş için, bir SC eksi yura agar plakasının beş ila beş milimetrelik bir bölümünü kesin. Agar bölümünü, agar yüzeyi plakanın altında olacak şekilde yaklaşık 55 milimetre numaralı sıfır cam tabanlı bir tabağa yerleştirin.

Dört mikrolitre hücreyi yüzü yukarı bakacak şekilde pipetleyin ve pipet ucuyla agar yüzeyinin etrafına yayın. Yaklaşık bir dakika bekletin. Ardından, agar bölümünü aynı cam alt tabağa yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek için cımbız kullanın.

100 x yağ objektifi kullanarak hücreleri floresan mikroskopta hafifçe görüntüleyin. Hücreleri görselleştirmek için DIC'yi ve kültürün yoğunluğuna bağlı olarak her suş için iki ila dört odak düzlemi için GFP floresan ayar koordinatlarını görselleştirmek için fit e filtresini kullanın. Fotoğraf makinesini, 90 dakikalık bir süre boyunca her beş dakikada bir uygun aralığa sahip bir Z yığını fotoğraf çekecek şekilde ayarlayın.

Maya HSP 1 0 4 proteininin ısı denatüre proteinlerinin yeniden katlanmasındaki rolünü araştırmak için, ısı şokundan önce ve HSP 1 0 4 delta hücrelerinde F-F-L-G-F-P'nin aktivitesini izlemek için lüminesans flaş testi kullanıldı ve belirtilen her zaman noktası için ısı şokundan hemen sonra, sonuçlar 90 dakika boyunca aktivitede kademeli bir artış olduğunu ortaya koydu ve bu da sonuçta vahşi tipte %80'den fazla bir geri kazanıma yol açtı Hücre. HSP 1 0 4 delta suşu, aynı zaman diliminde orijinal aktivitenin %19'unu geri kazandı. Ayrıca, ilk inaktivasyon derecesi, HSP 1 0 4 deltasında %26 aktivite ile belirtildiği gibi, vahşi tipte %26 aktivite ile gösterildiği gibi çok daha yüksekti, bu oran HSP 1 0 4 deltada ise %11'dir.

Bu, HS P 1 0 4'ün koruyucu bir rol prestresine hizmet edebileceğini veya enzimatik aktivite kaybını azaltmak için termal inaktivasyon adımı sırasında F-F-L-G-F-P'nin denatüre edilmesiyle hızla ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Popülasyon mikroskobu doğrulandı. Enzimatik aktivite test hücreleri, ısı şokundan 0, 30, 60 ve 90 dakika sonra toplandı ve floresan mikroskobu ile görselleştirildi, her bir zaman noktasının temsili görüntüleri burada gösterilmektedir.

Hücrelerin içindeki parlak yeşil punkta, F-F-L-G-F-P agregalarını temsil eder. Kantitasyon, dört ila beş alanda yaklaşık 100 hücre sayarak ve agrega içeren hücrelerin yüzdesini hesaplayarak yapıldı. HSP 1 0 4 delta mutant suşundaki hemen hemen tüm hücrelerin, tek hücreli ısı şokundan sonraki 90 dakika içinde %62 oranında azalan vahşi tip suştaki agrega sayısına kıyasla en az bir F-F-L-G-F-P agregasını koruduğu gözlenmiştir.

Otomatik mikroskopi, vahşi tipte HSP 1 0 4 delta hücrelerine karşı F-F-L-G-F-P'nin daha yüksek bir oranda yeniden çözündüğünü ortaya koydu. Bu şekil, 90 dakikalık bir süre boyunca elde edilen bir ZS yığınından yansıtılan temsili hareketsiz görüntüleri göstermektedir. Ek olarak, protein agregatlarının dinamikleri vahşi tipte çok farklıydı ve HS P 1 0 4, vahşi tip hücre agregatlarındaki delta hücreleri, bu filmde gösterildiği gibi çözünmeden önce kaynaşma eğilimindeydi.

HSP 1 0 4 delta hücrelerinde, agregalar çözünmeden önce kaynaşmaz ve çözünme hızı, bir kez ustalaştıktan sonra vahşi tip hücrelere göre daha düşüktür. Bu teknik, orta logaritmik faz hücrelerinden başlayarak yaklaşık üç saat içinde yapılabilir.