Bir Caenorhabditis elegans Model Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, amiloid beta toksisitesinin nöronal fonksiyon ve sağkalım üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak bir SE duyusal nöronlarında bir GFP raportörü ile bir amiloid beta peptidi eksprese eden transgenik C zarafet solucanlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, bir SE nöronlarında amiloid beta'nın eksprese edilmesinin davranışsal sonucu, bir kemotaksis testi ile değerlendirilir.

Üçüncü adım, bir SE nöronlarının birincil kültürlerini elde etmek ve daha sonra amiloid beta'nın toksik etkisini baskılamak için kültürlenmiş nöronları Q-V-D-O-P-H gibi farmakolojik ajanlarla tedavi etmektir. Sonuç olarak, sonuçlar, davranışsal ve farmakolojik testler yoluyla amiloid beta toksisitesinin bir SE nöronlarının işlevi ve sağkalımı üzerindeki etkilerini gösterebilir. Bu yöntem, spesifik hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması gibi nörodejenerasyon ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Amiloid beta oligomerlerinin altta yatan nörotoksik etkileri. Prosedürleri göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Dr.Zing Dwan olacak Dönüşüm için,% 2 agros enjeksiyon pedleri gereklidir. Suda eritilmiş bir damla sıcak aros damlasını bir cam kapak astarına yerleştirin ve damlanın üzerine hızlıca ikinci bir kapak fişi yerleştirin ve hafifçe vurun.

Enjeksiyon karışımını yaparken, kalıntı ve diğer kirleticilerden arındırılmış üst beş mikrolitreyi santrifüjlediğinizden ve enjeksiyon yükü için yeni bir tüpe aktardığınızdan, enjeksiyon karışımını ve plazmidi kılcal hareketle bir enjeksiyon pipetine boşalttığınızdan emin olun. Enjeksiyon pipetindeki açıklığı genişletmek için 100 solucan enjekte etmek için genellikle yarım mikrolitre yeterlidir, ucunu bir cam sürgü üzerine monte edilmiş bir kapak kızağının kenarına sürtün. Halo karbon 700 yağı. Açılışın kalitesi çok önemlidir.

Uç şekline ve en önemlisi akış hızına göre değerlendirilir, akış ve enjeksiyon basıncına yanıt olarak pipet ucunda oluşan kabarcıkların boyutu ile değerlendirilir. Şimdi bir enjeksiyon pedine bir damla 700 yadigar karbon yağı koyun ve birkaç solucanı pede aktarın. Solucanları arolara yapışana kadar pedin üzerine itmek için bir solucan penası kullanın.

Solucanlar, ventral tarafları aynı hizada olacak şekilde sıralar halinde yönlendirilmelidir. Kafalarına dokunmaktan kaçının. Birkaç denemeden sonra solucanlar pede yapışmazsa, yeni bir ped deneyin veya pedin agros kalınlığını veya konsantrasyonunu artırın.

Şimdi pipeti solucanın içine yerleştirin. İlk olarak, solucanı pipetin altına yerleştirmek için sahneyi hareket ettirin, ikincisi. Pipeti gonadın merkezi çekirdeğinin yanına yerleştirin.

Sitoplazması birçok germ hücre çekirdeği tarafından paylaşıldığından, bu, enjekte edilen DNA'nın döllere geçme olasılığını artırır. Pipet solucana neredeyse paralel olmalıdır. Üçüncüsü, cilt bastırılana kadar ucu vücuda doğru dikey olarak hareket ettirin.

Son olarak, uçların yerleştirilmesini sağlamak için manipülatöre hafifçe vurun. Şimdi DNA çözeltisini enjekte edin. Gonad şişene kadar pipete baskı uygulayın.

Ardından akışı durdurun ve solucanı pipetten çekin. İğnelerin akışını test edin ve ardından bir sonraki solucana geçmeden önce diğer gonadları enjekte edin. Enjeksiyonlardan sonra, solucanlara yaklaşık 10 mikrolitre kurtarma tamponu ekleyin ve yüzmeye başlamalarını bekleyin.

Yüzdükten sonra, eşit miktarda M dokuz tampon ekleyin. Solucanlar yüzmeye devam ettiğinde, çözelti çoğunlukla M dokuz olana kadar M dokuz eklemeye devam edin. Şimdi her bir solucanı oturmuş bir tabağa aktarın.

GR solucanlarını 50 mililitrelik bir şahin tüpünde bir mililitre M dokuz tamponunda toplayın. Daha sonra M dokuz tamponu kullanarak, solucanları yıkamadan sonra M dokuz berraklaşana kadar tekrarlanan santrifüjleme ve çözelti değiştirme ile yıkayın. Daha sonra, bitlere 10 hacim bazik hipoklorit çözeltisi ekleyin.

Peletlenmiş solucanlar, solucanları oda sıcaklığında, yaklaşık beşte dördü kırılana kadar kuluçkaya yatırır, bu da tipik olarak 10 dakika sürer. Mikroskopla görüntülemek için alikotlar alarak reaksiyonu izleyin. Eşit hacimde steril yumurta tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Daha sonra yumurtaları ve karkasları beş dakika boyunca 450 G'de santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı yavaşça çıkarın. Eşit hacimde yumurta tamponu ekleyin ve tüpü tekrar 450 G'de beş dakika santrifüjleyin.

Tampon temizlenene kadar prosedürü tekrarlayın. Şimdi yumurtaları gece boyunca M dokuz tamponunda kuluçkaya yatırın ve ertesi gün standart NGM plakalarına tohumlayın. Bir tarafı kabaca yarım santimetre olan birkaç küp agar hazırlayın.

Agar parçalarını, istenen cezbedici maddeyi içeren bir çözelti içinde iki saat bekletin. Test noktasının ve bir kontrol noktasının konumunun işaretlendiği 10 santimetrelik bir test plakasına bir agar parçası koyun. Deney başına bu tür beş tabak hazırlayın.

Plakaları ertesi gün gece boyunca 20 santigrat derecede bırakarak kimyasal bir gradyan oluşturmasına izin verin. Deneyden önce, plakalardaki her noktaya 10 mikrolitre 20 milimolar sodyum azid ekleyin. Bu bir anestezik görevi görür.

Deneyin amacına, 20 adet yaş senkronize solucanı plakanın ortasına yerleştirin ve ardından plakayı bir saat boyunca 20 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bir saat sonra, testteki hayvanları kontrol noktaları üzerinden sayın ve CI indeksini hesaplayın. Gr solucanları parçaladıktan ve yumurtaları ve karkasları daha önce anlatıldığı gibi temizledikten sonra, iki mililitre steril yumurta tamponunda tekrar süspanse edin ve yumurta tamponuna iki mililitre steril% 60 sükroz ekleyin.

Daha sonra yumurtalar tamamen yeniden süspanse olana kadar tüpü elle veya girdapla karıştırın. Yeniden askıya alınan yumurtaları 15 dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra yumurta dolu süpernatanı dikkatlice toplayın ve kalan sakarozu çıkarmak için damağı atın, yumurtaları yumurta tamponunda tekrar süspanse edin ve beş dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı nazikçe toplayın ve atın ve ardından temizleme işlemini davlumbazda üç kez tekrarlayın. Peletlenmiş yumurtaları yeniden süspanse etmek için mililitre kitinaz başına bir birim içeren steril yumurta tamponu kullanın. Yumurtaların oda sıcaklığında 30 dakika sindirilmesine izin verin ve ardından reaksiyonu ters hücre kültürü mikroskobu altında izlemeye başlayın.

Yumurta kabuklarının% 70 ila 80'i sindirildiğinde, beş mililitre tam L 15 kültür ortamı veya CM 15 ekleyin. Hücreleri izole etmek için, hücreleri 27 gauge bir iğneden birkaç kez geçirerek küme oluşturmayacak şekilde ayırın. Şimdi çözeltiyi beş mikron filtreli bir şırıngadan geçirin.

Ayrışmış hücre süspansiyonunu 15 dakika boyunca 450 G'de santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra süpernatanı çıkarın ve peletlenmiş hücreleri CM 15'te yeniden süspanse edin. Hücrelerin ayrıştığından emin olmak için, süspansiyonu mikroskop altında kontrol edin.

Son olarak, ayrışmış hücreleri daha önce kaplanmış cam kapak kızakları üzerine yerleştirin. Yer fıstığı lektini ile hücreler normal hava ile oda sıcaklığında iki haftadan fazla tutulabilir. Açıklanan dönüşüm teknikleri kullanılarak, kemotaksis tahlili kullanılarak biyotin gibi suda çözünür cezbedicileri tespit eden nöronlar olan a SE nöronlarında insan Beta 42'yi eksprese etmek için bir transgenik solucan inşa edildi.

Yedi günlük transgenik solucanlar test edildi. Kontroller biyotin bulmakta hiç zorlanmadı. Buna karşılık, beta 42'yi ifade eden sadece birkaç solucan cezbedici noktayı bulabilirdi.

Biyotin için kemotaksis indeksi, üç ila dört gün sonra kontrol ve deney solucanları için sırasıyla 0.68'e karşı 0.12 idi. Endekste de küçük ama tespit edilebilir bir düşüş oldu. Dört günlük kültürlenmiş bir A SER nöronu, dokuz günlük yaşamdan sonra hala GFP'yi ifade eder.

Bununla birlikte, GFP floresansı kayboldu ve bu teoriyi test etmek için apoptozdan şüphelenildi. Primer A SER nöronları tarif edildiği gibi hazırlandı ve geniş spektrumlu bir kaspaz inhibitörü ile desteklendi. Beklendiği gibi, tedavi floresan kaybını durdurdu ve insan A beta 42 ekspresyonunun A SER nöronlarında apoptozu tetiklediğini doğruladı.

Bu videoyu izledikten sonra, zarif transgenik solucanların nasıl inşa edileceğini, bunları davranışsal denemelerde nasıl inceleyeceğinizi ve Ambrose'dan birincil kültürün nasıl elde edileceğini iyi anlamalısınız.