Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Bu prosedürün genel amacı, lipidlerin membran proteinleri üzerindeki etkisinin fonksiyonel ve yapısal incelenmesine yönelik tekniklerin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktır. Bu süreç, öncelikle voltaja bağımlı potasyum kanalının eksprese edilmesi ve saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise iyon kanalının yeniden konstitüsyonudur.

Ardından, iyon kanalı fonksiyonel çalışması için lipid çift katmanlarındaki iyon kanallarından elektriksel kayıt gerçekleştirilir. Son adım, yapı tayini için membrandaki iyon kanallarının kristalizasyonudur. Nihayetinde, iyon kanallarının voltaj sensörü hareketi üzerindeki lipid etkilerini incelemek için biyokimyasal analizler, elektrofizyolojik yöntem ve elektron kristalografik çalışması kullanılır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, protein rekonstitüsyonu ve biyolojik kayıtların içerdiği birçok teknik detay nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Umuyoruz ki bu film ve süreç, tüm prosedürü tamamlamanıza ve başarılı olmanıza yardımcı olacaktır. Tüm prosedürün uygulaması, laboratuvarımdan Dr. Hui Jim tarafından gerçekleştirilecektir.

Lipid hazırlığı öncesinde 14 mililitrelik tek kullanımlık cam test tüpü, vidalı kapaklı cam tüp ve kloroform içeren 250 mikrolitrelik cam şırınga hazırlandı. Ardından test tüpüne 10 mililitre kloroform aktarıldı. POPE ve POPG lipozomlarını hazırlamak için kloroform içindeki 3,75 miligram POPE ve 1,25 miligram POPG vidalı kapaklı cam tüpe aktarıldı.

Görünürde kloroform kalmadığında, lipidleri sürekli bir argon gazı akışı altında kurutun. Lipidleri oda vakumunda bir saat daha kurutmaya çalışın. Ardından, kurutulmuş lipid vorteksine 440 µL düşük tuzlu tampon veya su ekleyin.

Lipidleri hidrate etmek için kullanılan tüp. Lipid süspansiyonu beyazımsı ve bulanık görünmelidir. Ardından, vezikül çözeltisi şeffaf hale gelene kadar lipid süspansiyonunu buz soğutmalı bir banyoda sonike edin.

Ardından, nihai lipid süspansiyonunun 300 millimolar potasyum klorür ve 10 millimolar DM içermesi için karışıma 50 µL üç molar potasyum klorür ve 10 µL 0.5 molar DM ekleyin; lipid deterjan karışık M hücrelerinin oluşumuna izin vermek için çözeltiyi bir rotatörde, oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası süspansiyon, deterjan kaynaklı küçük ELLA veziküllerinin füzyonu nedeniyle hafifçe bulanıklaşmalıdır. Protein konsantrasyonu mililitre başına iki miligramın üzerine çıktığında, nihai hacmi bir mililitreye tamamlamak için belirtilen bileşenleri ve lipid deterjan karışımını ekleyin.

Ardından, cam tüpteki protein lipid deterjan karışımını bir rotatörde iki saat daha inkübe edin. Deterjanla çözünürleştirilmiş DTaP veya DOGS içeren KVAP hazırlığı, P-O-P-E-P-O-P-G vezikülü için yapılan lipid hazırlığına benzerdir. Ancak, hidrate lipidlerin sonikasyonla küçük unilamel veziküllere dönüştürülmesi P-O-P-E-P-O-P-G lipidlerine göre daha uzun sürdüğünden, DOGS vezikülleri yavaşça birbirleriyle birleşerek DTaP veya DOGS'u tamamen çözünürleştirmek için küçük yağ damlacıkları oluşturabilir.

Sonike edilen veziküller, 10 millimolar DM ve 40 millimolar beta og ile karıştırılır. Lipid deterjan karışımı oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir; karışım oldukça berrak olmalı, içerisinde herhangi bir küçük partikül veya damlacık bulunmamalıdır. Ardından, KVAP proteini, deterjan ile çözünür hale getirilmiş DTaP veya DOGS ile bir veya 10'dan küçük bir protein/lipid oranında karıştırılır.

Protein deterjan lipid karışımının, sürekli orbital rotasyon ile oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe edilmesine izin verilir. DM ve Beta og gibi nispeten yüksek CMC değerine sahip deterjanların yavaşça uzaklaştırılmasını göstermek için, önce her bir mililitre karışım için iki litre diyaliz tamponu hazırlayın.

Ardından, uygun uzunlukta bir diyaliz tüpü kesin ve tüpte sızıntı olmadığından emin olmak için DI su ile yıkayarak kontrol edin. Sonra, protein lipid deterjan karışımını diyaliz tüpüne yükleyin. Çözeltinin üzerinde minimum boşluk kalacak şekilde tüpün her iki ucunu kıskaçla kapatın.

Doldurulmuş tüpü, tüpün çözelti içinde yavaşça döneceği şekilde, diyaliz tamponu içeren bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Diyaliz tamponunu her sekiz saatte bir değiştirin. Şimdi, düşük CMC değerine sahip deterjanların uzaklaştırılması için, önce 0,5 gram kuru boncuğu tartarak polistiren boncukları hazırlayın.

Ardından bunları 50 mililitrelik bir Corning tüpüne koyun ve 20 mililitre metanol ekleyip çözeltiyi bir banyoda sonike edin. Hapsolmuş kabarcıkları gidermek için beş dakika boyunca sonikasyon uygulayın ve boncukları 5.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; sonrasında metanolü tamamen boşaltın ve yıkama işlemini etanol ve milli Q su ile tekrarlayın. Ardından yıkanmış boncukları dört derece Celsius'ta %20 etanol içerisinde saklayın ve kullanmadan önce deterjan içermeyen bir tamponla değiştirin. İşlem görecek protein lipit deterjan karışımındaki deterjan miktarını tahmin edin ve deterjanları uzaklaştırmak için gereken boncuk miktarını hesaplayın.

Fazla suyu alınmış ıslak boncukları tartın, doğrudan protein karışımına ekleyin ve boncukların tam etkili olması için en az 15 ila 20 dakika bekleyin. Bir mililitre çözeltideki 8.7 miligram DDM'yi uzaklaştırmak için, bio beads SM2 gibi toplam 87 miligram polistiren boncuk beş eşit porsiyona ayrılır. Protein lipid deterjan karışımını, her bir fraksiyonla oda sıcaklığında, sabit uçtan uca rotasyonla 20 ila 30 dakika boyunca karıştırın.

Boncukları santrifüjleyerek çöktürün, ardından süpernatanı bir sonraki boncuk fraksiyonuna aktarın ve sonuna kadar tekrarlayın. Bu adımda, önce cam bir test tüpünü, Teflon yüzeyli vidalı kapaklı kehribar renkli bir şişeyi ve bir set cam şırıngayı kloroform ile temizleyerek başlayın. Daha sonra kehribar renkli şişeyi argon gazı akımı altında kurutun.

Ardından, amber renkli şişeye kloroform içerisinde 0,75 miligram POPE ve 0,25 miligram POPG aktarın ve kloroformu argon gazı ile uçurun. Daha sonra, kurutulmuş lipidleri çözmek için şişeye 0,2 mililitre pentan ekleyin ve kalıntı kloroformu gidermek için tamamen kurutun. Son olarak, kurutulmuş lipidi çözmek için şişeye 50 mikrolitre decane ekleyin.

Şimdi, lipid solüsyonunun deliğin içine kaçmamasına dikkat ederek, çift katmanlı kabın silindirik yüzeyindeki yuvarlak deliği lipidlerle boyayın. Lipid çift katmanlardaki KVAP kanallarından elektriksel kayıtlar gerçekleştirmek için, dekkanın tamamen buharlaşması amacıyla bir ila iki dakika bekleyin. Kabı kayıt haznesine yerleştirin, tuz köprülerini takın ve elektrotları kayıt kabının iki yanına bağlayın.

Kist solüsyonunu elektrot deliklerine, CYS ve trans solüsyonunu ise odadaki dış ve iç kaplara ekleyin. Ardından kabın iki tarafı arasındaki potansiyel farkı iki milivoltun altına ayarlayın ve kapağın deliği boyunca lipid boyayın. Membran incelene ve nispeten stabilize olana kadar bekleyin.

Membran stabilize olur olmaz, P2 pipet ucunun ince ucunu deliğin hemen üzerine getirerek kanal içindeki veziküllerden 0.5 ile 1 µL arasında bir miktar püskürtün. Veziküller deliğin üzerinden geçerek kabın tabanına düşecektir.

KVAP kanallarını çift katmanda test etmek için, hızlı inaktivasyon ve aktivasyon sonrası yavaş toparlanma nedeniyle, -80 mV tutma potansiyelinden 80 mV'luk kısa bir pals uygulanır; PEPG membranlardaki kanallar için iki pals arasında yaklaşık 120 saniyelik uzun bir aralık bırakılır. Akım büyüklüğü uygun göründüğünde, düşük konsantrasyonlu tarafa ek iyon tuzları ekleyerek membran her iki yanındaki çözeltilerde iyon konsantrasyonlarını dengeleyin.

Burada, kristal optimizasyonunun ortasında, negatif boyanmış bir 2D kristalin görüntüsü yer almaktadır. Şeker nedeniyle bazen birbirlerinin üzerine yığıldıkları için kristaller %6 amonyum molibdat, pH 6.4 ve %0,5 trioz ile boyanmıştır. Buradaki siyah kare kutu, difraksiyon noktaları içeren difraksiyon desenini oluşturan alanı belirtmektedir.

Yaklaşık 20 angstrom çözünürlükte, daha önce gösterilene benzer bir örnekten elde edilen 2D kristalin bir cryo EM görüntüsü burada yer almaktadır. Numune %3 TLOs ile karıştırılmış, doğrudan daldırma yöntemiyle dondurulmuş ve 50.000x büyütmede bir cryo EM altında görüntülenmiştir. Kristal paketlenmesinde yerel kusurların olduğu açıkça görülmektedir.

İşte daha da optimize edilmiş bir kristalin bir başka cryo-EM görüntüsü. Numune %0,75 tannin ve %10 tree hellos içerisine gömülmüş olup görüntü 50.000 x büyütmede alınmıştır. Sıkı paketlemedeki düz çizgiler, bu tip kristallerde kanalların iyi düzenlendiğini göstermektedir; iki siyah ok ise kare vektörleri işaret etmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, lipid ve proteinlerin nasıl doğru şekilde işleneceği konusunda iyi bir fikir edineceğinizi ve bu videonun, membranlardaki lipid-protein etkileşimlerini daha verimli bir şekilde incelemenize yardımcı olacağını umuyorum.