Name: Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Öğrenin voltaj kapılı potasyum kanallarının lipit membranlara rekonstitüsyon yöntemini. Bu teknik, iyon kanalı fonksiyonu ve yapısal analiz için biyokimyasal testler, elektriksel kayıtlar ve elektron kristalografisi çalışmaları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jiang laboratuarında KvAP üzerinde çalışmalar Rockefeller Üniversitesi Dr Roderick MacKinnon en laboratuvarından önemli yardım almış. Özel teşekkür onların tavsiyelerini Dr Kathlynn Brown ve Michael McQuire gidip bizim faj ekran deneylere yardımcı olur. Bu çalışma NIH (Q-XJ için GM088745 ve GM093271) ve AHA (Q-XJ için 12IRG9400019) hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane%3A+a+molecular+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203(2005).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62(2004).</li>
<li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caveolae+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199(1998).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems%2C+lipid+rafts%2C+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269(2004).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+from+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: from model membranes to cells.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257(2003).</li>
<li>Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Artificial+Bilayers+for+Electrophysiology+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments.</a> J. Vis. Exp. (20), e1033(2008).</li>
<li>Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-dependent+gating+of+a+voltage-gated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel.</a> Nat. Commun. 2, 250(2011).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775(2006).</li>
<li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180(2003).</li>
<li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884(2012).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597(2012).</li>
<li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. Biochem. 243, 798(1997).</li>
<li>Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+liposome+and+proteoliposome+reconstitution+involving+Bio-Bead-mediated+Triton+X-100+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179(1990).</li>
<li>Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+tubular+crystals+by+reconstitution+of+detergent-solubilized+Ca2%28%2B%29-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase.</a> Biophys. J. 72, 2545(1997).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+sarcoplasmic+reticulum+Ca%282%2B%29-ATPase%3A+mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283(1992).</li>
<li>Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+phospholipid+vesicles+with+planar+phospholipid+bilayer+membranes.+II.+Incorporation+of+a+vesicular+membrane+marker+into+the+planar+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251(1980).</li>
<li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404(1994).</li>
<li>Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Biological+Techniques%22">Biological Techniques</a>. Sattelle, D. B. , Academic Press, Inc. San Diego. 133(1993).</li>
<li>Tien, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTien%2C+HT+%22Bilayer+lipid+membranes+%28BLM%29.+Theory+and+Practice%22">Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice</a>. , Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).</li>
<li>Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+composition+of+some+lipid+bilayer+membranes+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution.</a> The Journal of Membrane Biology. 10, 11(1972).</li>
<li>Henn, F. A., Thompson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+bilayer+membranes+separating+two+aqueous+phases%3A+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies.</a> Journal of Molecular Biology. 31, 227(1968).</li>
<li>Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Kv1.2+and+paddle+chimera+Kv+channels+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers.</a> J. Mol. Biol. 382, 24(2008).</li>
<li>Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054(1984).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li>
<li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291(2009).</li>
<li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753(2002).</li>
<li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64(2001).</li>
<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1(1992).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65(2003).</li>
<li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142(1998).</li>
<li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321(2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295(2007).</li>
<li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2DX+robot%3A+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370(2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Farklı membranlar içine KvAP kanalları sulandırma çeşitli çalışmalar 8-10 kullanılmıştır. Deterjan / lipid karışık miselleri ve protein / deterjan / lipid karışık misel arasında lipid dağılımı sağlanması fikri ardından, çok farklı lipid yapılmış membranlar içine KvAP yaklaşık tam sulandırma ulaşabiliyorlar. Her tetramerik KvAP kanalı tam olarak transmembran alanı kapsayacak şekilde ~ 100 lipid molekülleri ihtiyacı var. Temel gereksinim deterjan kaldırılmadan önce yeterli lipit molekülleri protein / yağ / dete...

Hücreler Döviz malzemeler ve spesifik membran proteinlerin 1 fonksiyonları yoluyla çevre ile bilgiler. Hücre zarlarında membran proteinlerinin pompalar, kanallar, reseptörler, intramembrane enzimler, bağlayıcı ve membranlar arasında yapısal destekçileri olarak işlev. Membran proteinleri etkileyen mutasyonların birçok insan hastalıkları ile ilgili olmuştur. Bu önemli ve hücre zarlarında kolayca erişilebilir olduğu için Aslında, birçok membran protein birincil ilaç hedefleri olmuştur. Bu membranlar çeşitli membran proteinlerinin yapısı ve işlevini anlamak ve mümkün insan hastalıklarda mutant proteinlerden zararlı etkileri hafifletmek için yeni yöntemler bulmak için yapmak bu nedenle çok önemlidir. Lipidler bilayers 2, 3 entegre tüm membran proteinleri çevreleyen. Ökaryotik membranlar, lipidlerin çeşitli farklı türleri microdomains 4, 5 halinde organize edilebilir olduğu bilinmektedir.Birçok zar proteinleri, bu microdomains yanı sıra membran 3, 6, hacimli sıvı faz olarak dağıtılmak üzere gösterilmiştir. Microdomains ve membran proteinlerinin teslim onlara ve bu dağılımlar fizyolojik önemi organizasyonu altında yatan mekanizma açıkça önemlidir ama tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Membran proteinleri üzerinde lipid etkileri okuyan bir önemli teknik zorluk hemen hemen tüm yeniden proteinlerin fonksiyonel 7 böylece biyokimyasal iyi kontrollü lipid kompozisyon membranlar içine membran proteinlerinin saflaştırılmış güvenilir sulandırma olduğunu. Son birkaç yıl içinde, biz sulandırmak için A. prototip voltaj bağımlı potasyum kanal yöntemleri geliştirdi yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için çeşitli 8-10 membran sistemleri içine pernix (KvAP). Diğerlerinden verileri ve hep birlikte lipid muhtemel voltaj algılama konformasyonel değişiklikler belirleyici olduğunu gösterdiBir voltaj kapılı bir iyon kanalı ve etki bu kanallar 11 bazı yapıları şekli olabilir. Bir sonraki, bizim yöntemleri ayrıntılı bir açıklama sağlayacak ve büyük olasılıkla bizim sonuçlarının başarılı üreme ve diğer membran proteinlerinin çalışmalara bizim yöntemlerin uzantısı sağlayacak kritik teknik ipuçları sunacak.

<table><tbody><tr><td>Tripton</td><td>RPI A.Ş.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>RPI A.Ş.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tabanı</td><td>RPI A.Ş.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodesil-&#946;-D-Maltosid</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Sol dereceli</td></tr><tr><td>n-Oktil-&#946;-D-Glukozit </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Ana dereceli</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>RPI A.Ş.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin Bir</td><td>RPI A.Ş.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Boncuk SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-DOPE </td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin agaroz boncuk </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz Tüpü</td><td>Spektrum Laboratuvarları, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentan</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Dekane</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Araştırma Merkezleri</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

yapısal ve İşlevsel araştırmalar için lipid membranlar bir kv kanal sulandırma

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Indirgeyici bir şekilde lipid protein etkileşimi araştırmak için, iyi tanımlanmış bir lipid kompozisyonu membran içine membran proteinleri de dahil için gereklidir. Biz bir prototip voltaj bağımlı potasyum (Kv) kanalında lipid bağlı yolluk etkilerini araştırıyor ve farklı membran sistemlerine sulandırmak kanallarına detaylı işlemleri çalıştım. Bizim sulandırma prosedürler deterjan indüklenen veziküllerin füzyon proteini ve / deterjan lipid / deterjan karışık miseller ile miseller gibi protein / deterjan / lipid ve deterjan arasında lipitlerin bir denge dağılımı ulaşma önemi füzyon hem de dikkate almak / lipid karışık miseller. Bizim veri lipid veziküller içinde kanallarının ekleme yönelimleri nispeten rastgele önerdi ve sulandırma verimliliği saptanabilir protein agrega fraksiyon deneylerde görüldü o kadar yüksektir. Biz sulandırmak kullanmış olmasıFarklı lipid kanalların yapısal durumları belirlemek için d kanalları, düzlemsel çift katlı lipit katmanını dahil kanalları az sayıda, bir faj görüntülenir peptid kütüphane uyum özgü ligandlar için ekranın elektrik faaliyetleri kayıt ve 2D kristallerin büyümesini desteklemek zarlarında kanalları. Burada anlatılan sulandırılması prosedürleri, özellikle ökaryotik voltaj kapılı iyon kanalları lipid etkilerinin araştırılması için, lipid tabakalarıdır Diğer zar proteinleri çalışmak için adapte edilebilir.

Biyokimyasal homojenlik içine KvAP kanalın üretilmesi için deneyler genel akışı Şekil 1A tarif edilmektedir. Proteinin ekspresyonu ve saflaştırılması sırasında tipik örnekleri, Şekil 1B &#39;de SDS-PAGE jel gösterdi. IMAC saflaştırmadan sonra proteinin nispeten saf. KvAP kanalın verimi yaklaşık 1.0 mg / litre cinsinden bir kültürdür. Deterjanlarla lipid veziküllerin çözünmüş lipid vs deterjan her çift için çok çaba harcanması gerekiyor. DM tarafından PAPA / ...

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Bu prosedürün genel amacı, lipidlerin membran proteinleri üzerindeki etkisinin fonksiyonel ve yapısal incelenmesine yönelik tekniklerin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktır. Bu süreç, öncelikle voltaja bağımlı potasyum kanalının eksprese edilmesi ve saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise iyon kanalının yeniden konstitüsyonudur.Ardından, iyon kanalı fonksiyonel çalışması için lipid çift katmanlarındaki iyon kanallarından elektriksel kayıt gerçekleştirilir. Son adım, yapı tayini için membrandaki iyon kanallarının kristalizasyonudur. Nihayetinde, iyon kanallarının voltaj sensörü hareketi üzerindeki lipid etkilerini incelemek için biyokimyasal analizler, elektrofizyolojik yöntem ve elektron kristalografik çalışması kullanılır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, protein rekonstitüsyonu ve biyolojik kayıtların içerdiği birçok teknik detay nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Umuyoruz ki bu film ve süreç, tüm prosedürü tamamlamanıza ve başarılı olmanıza yardımcı olacaktır. Tüm prosedürün uygulaması, laboratuvarımdan Dr. Hui Jim tarafından gerçekleştirilecektir.Lipid hazırlığı öncesinde 14 mililitrelik tek kullanımlık cam test tüpü, vidalı kapaklı cam tüp ve kloroform içer

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Öğrenin voltaj kapılı potasyum kanallarının lipit membranlara rekonstitüsyon yöntemini. Bu teknik, iyon kanalı fonksiyonu ve yapısal analiz için biyokimyasal testler, elektriksel kayıtlar ve elektron kristalografisi çalışmaları sağlar.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Daha fazla video keşfet