Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kızılötesi lazer aydınlatmasının in vitro işitsel nöronlar üzerindeki etkilerini incelemek için bir model sistem üretmektir. Bu, elektriksel özelliklerini keşfetmek için tüm hücre konfigürasyonunda işitsel nöronların yama klemplenmesi, kültürlenmesi ile elde edilir. Daha sonra, nöronları lazer ışınlamasına maruz bırakmak, maruz kalan hücrede bir yama kelepçesi kurulumu ile ölçülebilen elektriksel tepkiler ortaya çıkarabilir.

Aydınlatma parametreleri ve çevresel değişkenler daha sonra lazer kaynaklı elektrik tepkileri üzerindeki etkilerini gözlemlemek için değiştirilebilir. Lazer ışığına maruz kalan işitsel nöronlar, daha sonraki analizler için her lazer darbesine yanıt olarak tekrarlanabilir elektriksel aktivite sergileyecektir. Bu yöntem, spiral ganglion nöronlarının kızılötesi stimülasyonunun altında yatan mekanizmalar hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu yöntem, özellikle spiral ganglion hücrelerinin kızılötesi stimülasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, ilgili fiziksel süreçleri daha da aydınlatmak için diğer hücre tiplerine veya lipid çift katmanları gibi basitleştirilmiş modellere de genişletilebilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, ışık iletimli optik fiberin doğru konumlandırılmasını sağlamak için önemlidir, çünkü ortaya çıkan parlaklık maruziyeti kritik bir parametredir, İki ila altı mega ohm dirençli kayıt mikro pipetleri hazırlayın. CO2 lazer çektirme ile ödünç alınan silikat camdan çekilebilirler.

Fiber bağlantılı lazeri hazırlayın. Geniş bir fiber optik yelpazesi çalışacaktır. FCPC konektörleri ile bir yama kablosu konfigürasyonunda bir fiberi yarıya kesmek, bir ucunda bir konektör ve diğer ucunda açıkta kalan fiber ile iki fiber bağlantısı üretir.

Bunlar at kuyrukları. Fiber kılıfı çıkararak, etanol ile temizleyerek ve mikroskop altında uygun bir aletle parçalayarak bir at kuyruğunun ayı ucunu hazırlayın. Ucun fiber eksenine dik olduğunu ve düz göründüğünü kontrol edin.

Fiber pigtailin diğer ucunu, gerekirse uygun bir geçiş konektörü kullanarak stimülasyon lazerinin çıkışına bağlayın. Bu noktada, her zaman fiberden çıkan lazer gücünü ölçtüğünüzden emin olun. Bunu, daha fazla ipucu manipülasyonundan sonra da yapın.

Şimdi fiberi bir aynaya yerleştirin ve aynayı uygun mikro konumlandırıcıya sabitleyin. Ardından, optik fiberin bir kapak kayması ile yaptığı açıyı belirleyin. Düzenlemenin bir fotoğrafını çekin ve görüntüyü J kullanarak açıyı hesaplayın.Şimdi, lazeri yama kelepçesi veri toplama sistemi ile senkronize eden bağlantıları sabitleyin.

Yama kelepçesi veri toplama sisteminden gelen dijital çıkış, harici bir fonksiyon üreteci aracılığıyla lazere bağlanmalı, bu da veri toplama sisteminden bağımsız olarak lazer darbe parametrelerinin belirlenmesini mümkün kılmalı, lazeri tetiklemek için kullanılan sinyal, lazer darbelerinin zamanlamasının ve uzunluğunun elektrofizyolojik sinyalle aynı anda kaydedilebilmesini sağlamak için veri toplama sisteminin bir girişine geri bağlanmalıdır, Perfüzyon sisteminin akış hızını dakikada bir ila iki mililitre arasında ayarlayın. Çözeltinin hızlı bir şekilde ısıtılması için bir hat içi ısıtıcıya ve kullanılmış çözeltiyi emme yoluyla uzaklaştırmak için bir peristaltik pompaya sahip yerçekimi beslemeli bir sistem çalışacaktır. Kuyu. Yüksek büyütmeli suya daldırma objektifi ve faz kontrastı kullanarak dik bir mikroskobun kayıt odasına kültürlenmiş hücrelerle bir kapak fişi yerleştirin, bir spiral ganglion nöronu bulun.

Tipik bir spiral ganglion nöronu, belirgin bir çekirdeğe sahip, parlak, yuvarlak ve yaklaşık 15 mikron çapındadır. Uygun bir nöron bulunduktan sonra, daha düşük bir büyütme hedefine geçin ve hedef nöronu bulun. Ardından, uç hem yatay hem de dikey düzlemlerde hedef nörona yakın olana kadar optik fiberi hareket ettirmek için mikro konumlandırıcıyı kullanın.

Yüksek büyütme hedefine geri dönün ve optik fiberin ucunu nöronun yanında amaçlanan konumuna yerleştirin. Elyafın dikey konumunu ayarlarken, elyafın alt kenarının kaplama dudağına dayanması önemlidir. Fiberin konumundaki belirsizliği en aza indirmek için, temas noktası mikroskop görüntüsündeki görsel ipuçlarından tanımlanabilir.

Elyaf yerine oturduktan sonra, mikro pipetin konumunu etkilememek için uzunlamasına ekseni boyunca bilinen miktarda dışarı doğru hareket ettirin. Mikro pipet, hücre içi çözelti ile doldurulmalı ve amplifikatörün baş tablasındaki yerine güvenli bir şekilde yerleştirilmelidir. Mikro elektrot tutucunun yan tarafına takılı hortumu kullanarak, mikro pipetin tıkanmasını önlemek için az miktarda pozitif basınç uygulayın.

Bir mikrom manipülatörü kullanarak, mikro pipeti hedef nöronun hemen üzerindeki konuma getirin ve bir giga ohm sızdırmazlık sağlamaya devam edin. Akıma takılan üstel eğriden belirlenen membran kapasitans serisi direncinin ve giriş direncinin bir kaydını yapın. Sızdırmazlık testi sırasında nabız.

Amplifikatör üzerindeki CP hızlı ve CP yavaş kontrollerini ayarlayarak geçici kapasitans geçişini en aza indirin. Ardından amplifikatörü tam hücre moduna geçirin ve SEAL testi sırasında düz bir akım gözlemlenene kadar kapasitans ve direnç kompanzasyonunu değiştirin. Daha sonra, düz bir test sızdırmazlık tepkisini korumak için kapasitans ve direnç kompanzasyon kontrollerini ayarlayarak yaklaşık% 70 düzeltme,% 70 tahmin ile seri direnç kompanzasyonu uygulayın.

Ardından amplifikatörü akım kelepçesi moduna geçirin. Akım enjeksiyonu olmadığında dinlenme membranı potansiyeline dikkat edin. Şimdi membran potansiyelini istenen seviyede stabilize etmek için bir tutma akımı ayarlayın.

Pipet kapasitansını nötralize edin ve voltaj düşüşünü dengelemek için köprü dengesini ayarlayın. Depolarize edici akımla uyararak nöronun ateşleme özelliklerini kontrol edin. Bu noktada, başlangıçta nöronun düzlemine odaklanan ve daha sonra optik fiberin üst kenarına odaklanan görüntüleri yakalayan bir CCD kameraya bağlı görüntüleme yazılımını kullanarak optik fiberi nöronun yanındaki konuma geri getirin.

Optik fiberin üst kenarının hedef nöronun merkezine göre konumu olan delta değerini belirlemek için görüntüleri analiz edin. Optik fiberin konumunu doğru bir şekilde bilmek çok önemlidir. Bunun nedeni, hedef hücreye iletilen birim, alan veya ışıma başına maruz kalma enerjisinin, kızılötesi nöral stimülasyon için kritik bir parametre olması ve bu, lifin hücreye göre konumundan önemli ölçüde etkilenebilmesidir.

Bu lazer optik güçtür, lazere doğrudan bir giriş yoluyla bilgisayar tarafından kontrol edilir ve her kayıttan önce manuel olarak belirtilebilir. Darbe uzunluğu ve tekrarlama hızı, daha önce açıklandığı gibi fonksiyon üreteci aracılığıyla kontrol edilebilir, verilerin hem yama kelepçesi kanalından hem de lazer tetikleme kanalından 0,25 ila beşte bir buçuk ila 15 milisaniye lazer darbesi kaydettiğinden emin olun. Milijouller tipik olarak ölçülebilir elektriksel tepkiler verir. Başlangıçta.

İstenmeyen etkileri en aza indirmek için lazer darbelerinin tekrarlama oranını bir hertz veya daha düşük bir değere ayarlamak yararlı olabilir. Tüm lazer parametreleri ayarlandıktan sonra. Veri toplamaya devam edin.

Spiral ganglion nöronları, hem voltaj kelepçesinde hem de akım kelepçesinde tekrarlanabilir dalga formlarıyla lazer aydınlatmasına yanıt verir 2,5 milisaniye 0,8 milijoule lazer darbelerine yanıt olarak konfigürasyonları kaydeder. Tipik bir hücre, çeşitli tutma potansiyellerinde net bir içe doğru akım üretir. Mevcut kelepçe kayıtları, bu lazer darbeleri boyunca sabit bir membran depolarizasyonunu ve ardından darbeden sonra dinlenme membran potansiyeline doğru yaklaşık üstel bir azalma olduğunu göstermektedir.

Bazı durumlarda, lazer darbesini takiben küçük bir ek membran depolarizasyonu da vardır. Aşırı enerji ile aydınlatma veya büyük sıcaklık artışlarına maruz kalma, hücre elektriksel özelliklerinin bozulması veya anlık hücre ölümü yoluyla gözlenen hücre hasarına neden olabilir. Bu prosedürü izleyerek, çözelti sıcaklığı veya kimyasal faktörler gibi bir dizi çevresel parametre, bunların lazer kaynaklı elektriksel aktivite üzerindeki etkisini test etmek için değiştirilebilir.

Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve standart güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın. Bunlar, lazer güvenlik gözlükleri, uyarı işaretleri kullanmayı ve ışının istemeden yüksek oranda yansıtıcı yüzeylerle kesişmemesini sağlamayı içerir.