Name: Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Öğrenin, kızılötesi lazer stimülasyonunun işitme nöronları üzerindeki etkilerini tam hücre patch kelepçe yöntemiyle nasıl inceleneceğini. Bu teknik, nörofizyoloji araştırmalarında sinirsel yanıtları detaylı analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Bağlantı Projesi hibe LP120100264 altında Avustralya Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.

1. Spiral ganglion nöronlar Kültür <ol><li> Bir otoklav küçük turu (örneğin 10 mm çapında) cam lamelleri ve kavisli bir forseps sterilize edin. Steril forseps kullanılarak steril 4 halka 35 mm petri ya da 4-plaka ayrı kuyu içine sterilize lamelleri aktarın. En fazla 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde lamel yeri ve üst yüzeyi (37 ° C) ile poli-L-ornitin (500 mg / ml) ve fare laminin (0.01 mg / ml) 150 ul uygulanır. Lamelleri kuyunun dibinde uzak yüzer yok emin olun. </li><li> 47.5 ml Neurobasal A, 0.5 ml 2 N takviyesi, 1 mi B27 takviyesi, 0.5 ml L-glutamin, ve 0.5 ml penisilin-streptomisin: Her sinir kültürü için 50 ml steril Neurobasal ortamı (NBM) hazırlayın. Not: Ek dondurulabilir, -20 ° C&#39;de depolanır ve gerektiğinde günde ortam ilave edildi. </li><li> Daha önce 20,21 açıklandığı gibi doğum sonrası günlük 4-7 sıçan yavrular spiral ganglion nöronları ayırmak, bizeenzimatik (tripsin% 0.025 ve% 0.001 DNase I) &#39;in ve mekanik teknikler de ing. Whitlon ve ark. 22 ve Vieira et al. 23 bakınız modiolus izolasyon bir gösteri için spiral ganglion nöron kültürü, ya da Parker ve ark. 24 ayrıntılı yordamlar için. </li><li> Lamelleri kalan tüm poly-L-ornithine/laminin çözüm aspire ve NBM ile kısa bir süre yıkayın. </li><li> Bir kuluçka (37 ° C,% 10 CO 2) içine lamelleri ve yere ayrışmış spiral ganglion nöron süspansiyon 150-200 ul ekleyin. Not: 20 kadar lamelleri 8 sıçan yavruları bir defada doğurulan ortalama yavru yola çıkılarak kolayca hazırlanabilir. </li><li> Dört saat kaplama nöronlar sonra, hücre enkaz kaldırmak ve 150-200 ul ısıtılmış taze NBM ile değiştirin çözüm aspire. Not: Medya dehidratasyonu önlemek için günlük ikmal gerektirebilir. </li><li> Elektrofizyolojik kayıtlar için gerekli kadar inkübatör lamelleri dönün. Not: ayrışmış spiralGanglion nöron kültürleri dört saat sonra ve daha sonra çözülme fazla iki gün için elektrofizyolojik deneyler için kullanılabilir. In vitro zaman sonuçlarının analizi sırasında dikkate alınmalıdır. Her 24-48 saat NBM yenileyin. </li></ol> 2. Patch Kelepçe Kayıtlar Hazırlık <ol><li> Çözümler hazırlayın <ol><li> Hücre içi (mikropipet) çözeltisi: 115 mM K-glukonat, 7 mM KCI, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, MgATP 2 mM, 0.5 mM Na 2 GTP (KOH ile pH 7.3 &#39;e ayarlanır; 295 ayarlamak sukroz ile mOsmol / kg) verildi. Steril bir filtre (0.2 um) aracılığıyla çözüm geçmek ve kayıt güne kadar -20 ° C&#39;de depolanmak üzere 200 ul hacimde ayrılır. </li><li> Hücre dışı (banyo) çözeltisi: 137 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glükoz (NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın, sukroz ile 300-310 mOsmol / kg&#39; a ayarlayın) . Bu çözüm, kaydın gün yapılır. </li></ol></li><li> MQ 2-6 bir direnç ile kayıt mikropipetler hazırlayın. Ve borosilikat cam (1.0 mm dış çapı 0.58 mm iç çapı; 75 mm uzunluk), biz bir CO2 lazer çektirmesi (Sutter Aletleri P-2000) kullanın. </li><li> Lazer hazırlayın. Bu protokol, OPTOTECH P / L, bu tür 1.870 nm Kızılötesi sinir uyarıcısı olarak bir fiber çiftli lazer ile kullanım için tasarlanmıştır Deneylerde ışık teslimat için kullanılan fiber optik iki ucunda bir sayısal 0.22 diyafram ve FC-PC konektörler ile 200/220 mikron çekirdek / kaplama çapı silika elyaftır (AFW Teknolojileri MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Patch kablo iki fiber pigtail (yani bir ucunda Konnektörlü ve diğer de bölünmüş) üretmek için ikiye kesilmiştir. Lif çekirdek çapı ve lazer kaynaklı ısı değişiklikleri sayısal açıklık etkileri Thompson ve arkadaşları tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır. 25 <ol><li> Bölünme, standart teknikler kullanılarak, ışık dağıtım lif ucuve elde edilen ucu bir optik mikroskop (yani ucu lif eksenine dik olması ve görsel denetim üzerine düz görünmelidir) ile gözlem ile yüksek kalitede olduğundan emin olun. Bağlayıcı (örneğin Thorlabs ADAFC2) aracılığıyla uygun bir uyarım kullanılarak lazer elyaf çiftli çıkışına ışık dağıtım lif bağlayın. </li><li> Uygun bir alet (LM-3 dedektör kafası ile örneğin Tutarlı FieldMate) kullanarak ışığı teslim lif bölünmüş ucundan çıkış lazer gücünü ölçün. Bu lazer güç ışığı teslim lif bölünmüş ya da önemli bir ayar (örneğin bir laboratuvar diğerine ulaşım) lazer yapılır her zaman kontrol edilmesi önerilir. </li><li> Bir fiber ayna veya eşdeğer cihaz ve yapıştırın uygun micropositioner için ayna ışık teslim lif yerleştirin. Bu doğru fiber optik lamel ile yaptığı açı θ tespit edebilmek için önemlidir. Bu anglE deneysel düzenlemenin bir fotoğraf çekme ve açısını elde etmek için görüntü işleme yazılımı (örneğin İmageJ) kullanılarak ölçülebilir. Özellikle mikroskopta - açısı θ (veya olası açıları aralığı) öncelikle deneysel düzenleme mekansal sınırlamaları ile sınırlıdır. Bizim deneylerde θ tipik değerleri (dik bir mikroskop dayalı) 36 ° civarında, ancak en iyi açısı (ters bir mikroskop kullanarak bu gibi) alternatif kurulumları için önemli ölçüde farklılık gösterebilir. </li><li> Lazer ve Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, yama kelepçe veri toplama sistemi (örneğin Digidata 1440A, Molecular Devices) ile bağlantı kurarlar. Yama kelepçe veri toplama sisteminden dijital çıkış mümkün veri toplama sisteminden bağımsız lazer darbe parametreleri belirlemek için yapım, harici bir fonksiyon jeneratörü ile lazer bağlanmalıdır. Alternatif olarak bu çıkış doğrudan bağlanabilirlazer sürücüsü (darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı veri toplama yazılımı tarafından ayarlanacak gerektiren). Her iki durumda da, lazer tetiklemek için kullanılan sinyal lazer darbelerinin zamanlaması ve süresi elektrofizyolojik sinyali ile eş zamanlı olarak kaydedilebilir sağlamak için bilgi elde etme sisteminde bir girişine geri bağlanmış olması gerekir. </li></ol></li></ol> 3. INS incelenmesi için yama Kelepçe Kayıtlar <ol><li> Hücre-dışı çözelti ile perfüzyon sistemi uygun bir kap doldurun ve 1-2 ml / dakika arasında bir oranda banyosunun perfüzyon sağlamak için akış hızını ayarlamak. Bu çözeltinin hızlı ısıtma ve emme tarafından harcanan çıkarmak için çözelti bir peristaltik pompa sağlamak için bir in-line bir ısıtıcı ile yerçekimi beslemeli sistemi (aspiratör şişesi, sıkıştırma valfi ve PE tüp) kullanın. </li><li> Dik bir mikroskop kayıt odasına (banyo) içine kültürlenmiş hücreler ile bir lamel yerleştirin. Bir yüksek büyütme su daldırma hedefi (E kullanarak40X. G.) Ve faz-kontrast (örneğin diferansiyel girişim kontrast veya Dodt degrade kontrast), görsel kültürü içinde spiral ganglion nöronları bulun. Şekil 1a gösterildiği gibi tipik bir spiral ganglion nöron, önemli bir çekirdek ile çapı faz-parlak, yuvarlak ve yaklaşık 15 mikron. </li><li> Bir nöron bulunan sonra, daha düşük bir büyütme hedefi (örneğin 10X) geçmek ve görme alanı içinde hedef nöron bulun. </li><li> Aşağıdaki yordamı (veya eşdeğeri) kullanarak yerine ışık teslim fiber optik hareket: <ol><li> Ucu, yatay ve dikey düzlemde hem de hedef nöron yakın kadar çıkış elyaf hareket ettirmek için micropositioner kullanın. Lif ucunun dikey konumunu nesnel yukarı ve aşağı hareket (odak tarama) tarafından doğrulanabilir. </li><li> Yüksek büyütme hedefi geri dönmek ve t yanındaki istediğiniz konumda fiber optik ucu pozisyono nöron (Şekil 2 ilave bakınız). Fiberin dikey pozisyonunun ayarlanması, bu fiber alt kenarı fiberin konumda belirsizlik en aza indirmek için, lamel (yani sadece dokunarak) üzerine oturtulmuş olması önemlidir. Yatay düzlemde en iyi şekilde sıraya elyaf lamel ve lif r yarıçapı ile yaptığı θ açısına bağlıdır. Hedef nöronun merkezi lif ekseni boyunca uzanır, böylece lif konumlandırmak için, fiberin üst kenarı ile hedef hücre arasındaki yatay mesafe olmalıdır Δ target = r (Cosec θ - 2 sin θ), negatif değerler işaret eder nerede fiber optik çıkıntılar hücre. Fiber hizalama olduğunda, elyaf üst kenarı ve nöronun arasındaki Δ hedef bir mesafe yaklaşık görsel muayene ile elde edilebilir. Ancak Δ hedef için tasarlanmıştırsadece kaba bir kılavuz olarak hizmet vermektedir. Fiberin üst kenarı ve nöron merkezi arasındaki gerçek mesafe Δ Δ hedef (Şekil 1&#39;de gibi) ölçülebilir farklı şekilde lif Konumlandırma ortasından her iki radyal yer değiştirme (yani yürürlüğe fikir sağlayabilir Hedef nöron göre kirişin kiriş) ve eksenel yer değişimi (yani lif ekseni boyunca). Tipik modlu fiberler için ışın profili de bir üst şapka dağıtımı 26, yerel olarak emilen enerji (sıcaklık) düşüş ile yaklaşık olarak bu yana yani - Örneğin, Δ ayarı ≈ 0 hücrenin çevresinde yerel sıcaklığını artırmak için beklenir kirişin merkezinde yer değiştirme nedeniyle yakın hücreye fiber uç yüzü hareket emilen enerji artışı ile karşılaştırıldığında çok azdır. Bakımı gibi doğru ve tekrarlanabilir bir po gibi lif konumlandırmak için alınması gerekirkengörsel ipuçları, hedef nöron (örneğin Δ) göre lif konumu hassas ölçüm kullanarak ssible önceden belirlenmiş bir mesafe uzakta konumlandırma daha büyük önem taşımaktadır. Protokolün adım 3.8.2 &#39;de tarif edilene Δ resim analizi ile (± 3 um arasında bir tahmin edilen maksimum belirsizlik ile) tespit edilebilir. Bazı deneylerde 5,8 olarak, beyaz ışık kaynakları ve istenen hücre hedeflemek için fiber üzerinden akuple edilmiştir. Bu yaklaşım, hedef bölge saçılan ışığın yoğunluğunu bu sığ açıları (θ) nispeten düşük olduğu gibi, dik bir mikroskop kurulum etkisiz olduğu bulunmuştur. </li><li> Lif konumda sonra, mikropipet basit konumlandırma sağlamak için bilinen bir miktar dışarı hareket ettirin. Fiber sonra sinir kayıt elde edilir orijinal konumuna iade edilebilir. </li></ol></li><li> Hücre içi çözüm mikropipet doldurun ve güvenli başlarına yerine uygunamplifikatör millere (örneğin Multiclamp 700B, Molecular Devices). Mikroelektrot tutucunun tarafına bağlı tüp kullanarak, mikropipet tıkanmasını önlemek için pozitif basınç küçük bir miktar uygulanır. </li><li> Bir micromanipulator kullanarak, sadece hedef nöron üzerinde pozisyona mikropipet hareket ettirin. </li><li> Tüm hücre kayıtları için Protokol: <ol><li> Amplifikatör gerilim-kelepçe modunda 10 msn, +10 mV kare dalga darbe (örneğin Seal Test) uygulayın ve 0 nA için temel sinyal mikropipet potansiyeli (pipet offset) ayarlayın. Sızdırmazlık da mikroelektrot direnişini istenen aralığı (- MQ 6 örneğin 2) içinde olup olmadığını belirlemek için kullanılmalıdır. </li><li> Direncinin izlenmesi sırasında, yavaşça hedef nöron yüzeyi üzerine mikropipet konumlandırmak için mikromanipülatör ince ayar kullanımı. Mikropipet nöron ile temas halinde olduğunda, direnç (~ 0,5-1 MQ) tarafından artacaktır. Benmmediately direnç artışı takiben, pozitif sıvı basıncı kaldırmak ve küçük bir negatif basınç uygulayın. Bir kez direnci 10 geçti - 20 MQ, bir holding düzeyinde (-60 mV civarında örneğin) potansiyel membran düzeltmek. </li><li> Bu 1 GΩ aşana kadar elektrot direnci etkili bir mühür (&#39;gigaseal&#39; olarak adlandırılan) hücre zarı ve mikropipet arasında oluşan olduğunu simgeleyen, artmaya devam etmelidir. Bu noktada, mikropipet tüm sıvı basıncı çıkarın. </li><li> Gigaseal oluşmuştur sonra, kısa akım darbeleri (25 to 100 mikrosaniye, +1 V) kullanın veya kopma hücre zarı negatif sıvı basıncı kısa bakliyat ve tüm hücre yapılandırma elde. </li><li> Membran kapasitans, seri direnç ve sızdırmazlık darbe sırasında mevcut takılı üstel eğrisinden belirlenen giriş direnci kaydedin. Sonra switc, amplifikatör üzerindeki CpFast ve CpSlow kontrolleri ayarlayarak, kapasitans geçici aza indirmekh tüm hücre moduna amplifikatör ve düz akım kadar kapasite ve direnç telafi sızdırmazlık sırasında görülmektedir. Düz test işareti yanıt korumak için kapasitans ve direnç kontrolleri ayarlayarak,; seri direnç tazminat (% 70 tahmini ~% 70 düzeltme) uygulayın. </li><li> Amplifikatör akım kelepçe moduna geçin. Istirahat membran potansiyeli (mevcut enjeksiyon yokluğunda) dikkat edin. Istenen seviyede (örneğin -60 mV) de membran potansiyeli stabilize etmek için bir holding akımı ayarlayın. Pipet kapasitans nötralize ve gerilim düşümü dengelemek için köprü dengesini ayarlar. </li><li> (; 300 milisaniye süresi +10 pA adımda 10-200 pA) mevcut depolarizan ile uyararak nöron ateşleme özelliklerini kontrol edin. </li></ol></li><li><ol><li> Nöron yanında pozisyona fiber optik geri hareket ettirin. Bir CCD kamera birleştirilmiş görüntüleme yazılımı kullanılarak, hedef nöro ile ilgili lif pozisyonu görüntülerini yakalamakN, fiber optik (bkz. Şekil 1) üst kenarında daha sonra ilk olarak bir nöronun düzlem üzerinde odaklanarak, ve. </li><li> Ortaya çıkan görüntüler sonraki analiz (örneğin, Şekil 1b ve 1c) tarafından tam olarak Δ (hedef nöronların merkezi optik fiber göreli üst kenarının konumu) belirlemek mümkündür. Sonra Δ bilinmektedir, bu tür fiber uç yüzü olan hedef nöron (lif ekseni boyunca) Z ve kiriş δ r merkezi nöron radyal yer değiştirmesi için mesafe parametreleri basit trigonometrik ilişkiler kullanılarak hesaplanabilir: z = r sin 2θ + Δ cos θ δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + δy 2) 1/2, δy lif ekseni ve yukarıda da görüleceği gibi nöron merkezi arasındaki mesafe olduğu (örneğin see Şekil 1). Bu konumu parametrelerin doğru bilgi uyarılması işlemleri 25 arasındaki olası farklılıkları gidermek için gerekli olabilecek Analizi, hücreden hücreye hesap pozisyonel varyasyonları almalıdır. </li></ol></li></ol> 4. INS Deneyler <ol><li> Akım kelepçe veya gerilim kelepçe yapılandırmaları birinde elektrofizyolojik veri kaydederken, istenen parametreleri (örneğin güç, darbe uzunluğu, tekrarlama oranı vb) de uyarılması lazer çalıştırın. Bizim lazer, optik güç lazer sürücü doğrudan bir giriş üzerinden kontrol edilir ve her kayıttan önce manuel olarak belirtilir. Darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı, harici sinyal üreteci veya veri toplama yazılımı (, adım 2.3.4 &#39;de açıklandığı gibi) ya da kontrol edilebilir. Veri yama kelepçe kanal ve lazer tetikleyici kanal hem de kaydedilir emin olun. </li></ol> Arasında değişen uzunlukları ile lazer darbeleriyaklaşık 500 mikro-saniyeye 15 msn ve darbe başına ~ 0,25-5 mJ enerjileri tipik olarak ölçülebilir elektrik yanıtları verim. Bu parametre etkilerini en aza indirmek çünkü 1 Hz ya da daha az olduğu lazer darbelerinin tekrar oranının ayarlanması, ilk deneyler için faydalı olabilir. Kaydedilen sinyal değişikliği tipik sonuçları aşağıdaki bölümde sunulmuştur.

<ol><li>Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+infrared+light+for+in+vivo+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Application of infrared light for in vivo neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).</li>
<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stimulation+with+optical+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).</li>
<li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+mechanisms+of+transient+optical+stimulation+of+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve.</a> Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736(2012).</li>
<li>Bec, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+laser+stimulation+by+near+infrared+pulses+of+retinal+and+vestibular+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).</li>
<li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effect+of+shorter+pulse+duration+and+penetration+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth.</a> Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).</li>
<li>Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+laser+versus+electrical+energy+for+peripheral+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).</li>
<li>Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+the+facial+nerve%3A+A+new+monitoring+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique.</a> Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).</li>
<li>Jenkins, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+pacing+of+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Optical pacing of the embryonic heart.</a> Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of the auditory nerve.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system%3A+A+comparison+of+optic+and+electric+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli.</a> J. Biomed. Opt. 12, 021008(2007).</li>
<li>Richter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effects+of+acute+and+chronic+deafening%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening.</a> Hearing Research. 242, 42-51 (2008).</li>
<li>Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+single+auditory+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of single auditory nerve fibers.</a> Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parameter+variability+in+laser+nerve+stimulation%3A+A+study+of+pulse+duration%2C+repetition+rate%2C+and+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable-membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291, 1-14 (2012).</li>
<li>Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+explant+co-cultures+promote+the+differentiation+of+stem+cells+into+bipolar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons.</a> Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).</li>
<li>Whitlon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+morphology+of+auditory+neurons+in+dissociated+cultures+of+newborn+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion.</a> Neuroscience. 138, 653-662 (1016).</li>
<li>Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+stimulation+of+neurite+outgrowth+in+a+serum-free+culture+of+spiral+ganglion+neurons+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice.</a> Hearing Research. 230, 17-23 (2007).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.</a> J. Vis. Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 17, 075002(2012).</li>
<li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+AW+%22Optical+Waveguide+Theory%22">Optical Waveguide Theory</a>. , Chapman and Hall. (1983).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li>
<li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda belirtilen protokolleri kullanarak ayıklamak ve kültür spiral ganglion nöronları ve tüm hücre yama kelepçe deneyler yaparak lazer uyarılmış elektriksel aktivite araştırmak mümkündür. In vitro olarak kullanıldığında, yama klemp tekniği, in vivo olarak ulaşılabilir değildir deney parametreleri üzerinde bir kontrol düzeyi sağlar. Bu dalga boyu, darbe enerjisi, darbe uzunluğu, darbe şekil ve darbe tekrarlama dizileri olarak lazer stimülasyon parametreleri tekrarlanabilir bir ortamda incelenebilir...

Nörofizyoloji ve tıbbi biyonik alanlarında nöral dokuda elektrik tepkilerin kontrol uyarılması izin teknikleri temeline dayanmaktadır. Elektrik stimülasyonu sinir uyarım olarak altın standart olmaya devam ederken sinir yanıtları, ve doku 1 çevredeki içine akım yayılmasını nedeniyle stimülasyon özgüllük eksikliği kaydederken, bu tür stimülasyon eserler varlığı gibi sakıncaları bir dizi çekiyor. Son yirmi yılda optik aracılı stimülasyon teknikleri 2 gelişimi gördük. Bu tekniklerin bazıları ya da belirli bir molekülün eklenmesi (kafesli moleküller) 3 ya da bir araştırma ayarı dışında uygulamak kolaydır ikisi de genetik manipülasyon çeşit (örneğin optogenetik, 4) vasıtasıyla, hedef doku değişiklik gerektirir. Özellikle ilgi çekici bu nedenle kızılötesi sinir stimülasyonu (INS), whereb olduğuy sinir doku darbeli kızılötesi lazer ışık heyecanlı. INS sinir doku 2 çok özel, temassız stimülasyon sağlayarak elektrik stimülasyonu eksikliklerin birçok üstesinden gelmek için potansiyeline sahiptir. INS başarılı in vivo ayarları çeşitli gösterilmiştir Ancak,, uyarma mekanizması tam olarak bilinmese kalır. Bazı yeni yayınlar 5-7 INS arkasındaki mekanizma ortaya çıkarılması doğru ilerleme göstermiştir. Su ile lazer ışığının emilimi nedeniyle hızlı ısıtma önemli bir rol oynar. Ancak, bunun ötesinde bir fikir birliği henüz ulaşmış olmaktır. Shapiro ve ark. 7 hızlı bir ısıtma ve daha sonra hücre zarı depolarizasyon kapasitans bir değişime yol açan, hücre zarı bitişik yüklü parçacıklar dağılımı içinde bir karışıklık sebep olur, son derece genel mekanizma önerilmiştir. Buna ek olarak, Albert ve arkadaşları. 5 olduğu iddia LASEr kaynaklı ısıtma iyonlarının hücre zarından geçmesine izin, ısıya duyarlı iyon kanalları (geçici reseptör potansiyeli vanilloid kanal), belirli bir sınıf aktive eder. Bu aşamada tespit edilmesi henüz daha faktörler olup olmadığını gerçekten bu mekanizmaların bir araya nasıl belirsiz, ya da. Bir yayın az sayıda (referans 5,7-9), in vitro incelenmiştir INS olmasına rağmen, bu alanda yayınlanan çalışma bölgesinin büyük bir kısmı (örneğin, referans 1,6,10-18) in vivo olarak gerçekleştirilmiştir. Işitsel sinirlerin Kızılötesi uyarılması koklear implant 10,14-18 içinde potansiyel uygulamaları nedeniyle özel bir ilgi alanı olmuştur. In vivo deneyler, çeşitli ortamlarda teknik, in vitro çalışmalar tarafından sağlanan kontrol artan seviyesi Mech daha detaylı bir anlayış yol açması beklenmektedir etkililiğini doğrulamak için önemli olmakla birlikte,INS sorumlu olarak tarif etmişler. Bu rapor ayrıca, işitsel sistemin mevcut verilerin büyük gövdesine bağlantı sırasında temel mekanizmaları incelemek için kullanılabilir olarak, yama kelepçe araştırmalar için kültürlenmiş spiral ganglion nöronlarının hazırlanmasını tarif etmektedir. Yama kelepçe tekniği tek hücrelerinde elektriksel aktivite kayıt aracı sağlayan ve bireysel temel akımları 19 katkısı eğitim, elektrofizyolojik olayların araştırmalar için mükemmel bir araçtır. Bu teknik, kültür spiral ganglion nöronları gibi birincil nöronların, in vitro hazırlanmasında istikrarlı uygulandığında, bu derinlik sinirsel aktivite kontrol ve manipüle edildiği mekanizmaları eğitim için bir fırsat sunuyor. Yama kelepçe ile spiral ganglion nöronları elektriksel özellikleri üzerine lazer stimülasyon etkisini araştırmak için bu çalışma taslak yöntemleri belirtilen protokollerikayıtları. Yaklaşım standart mikroskop konfigürasyonu değiştirmek için gerek kalmadan güvenli operasyon gibi kolay ve tekrarlanabilir uyum sağlayan, daha çok bir boş-alan lazer daha fiber çiftli lazer dayanmaktadır. Bu protokollerin dayanarak, daha açık bir şekilde INS arkasında mekanizmasında veya mekanizmalarında belirlemek için deneyler geniş bir yapmak mümkün olmalıdır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Hücre kültürü malzemeleri ve ekipmanları </td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Lomb Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>4 halkalı hücre kültürü kabı </td><td>VWR International</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli forseps</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Dumont #5 cımbız (45 derece açı ucu)</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td>ThermoScientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 1. Hücre kültürü malzemeleri ve ekipmanları.</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobazal media</td></tr><tr><td>Neurobazal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 serumsuz takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Hücre içi çözelti</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum D-glukonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü> Hücre dışı çözelti</güçlü> </td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 2. Hücre kültürü ve yama kelepçesi için çözümler. a) Nörobazal ortam. b) Hücre içi çözelti. c) Hücre dışı çözelti.</td></tr><tr><td>Dik mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AxioExaminerD1</td><td>Dodt kontrast ile donatılmıştır </td></tr><tr><td>Suya daldırma objektifi</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Platform ve XY aşaması </td><td>ThorLabs</td><td>Burleigh Cebelitarık</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Titreşim izolasyon masası</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Kamera Teşhis Cihazları</td><td>RT1200</td><td></td></tr><tr><td>Kamera yazılımı</td><td>Teşhis Cihazları</td><td>SPOT Basic</td><td></td></tr><tr><td>Hat içi çözüm ısıtıcısı</td><td>Warner</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Yama kelepçesi amplifikatörü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Yama kelepçesi veri toplama sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Digidata 1440A</td> Mikromanipülatör <td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Aletleri</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet camı</td><td>Sutter Aletleri</td><td>GBF100-58-15</td><td>Filamentli borosilikat cam</td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instruments</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt Yazılımı</td><td>AxoGraph</td><td></td><td>Lab paketi ve elektrofizyoloji araçları</td></tr><tr><td>Aspiratör şişesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS12201L</td><td>1 L Pyrex aspiratör şişesi, boru çıkışlı</td></tr><tr><td>PE Boru</td><td>Harvard</td><td>PolyE # 340</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex peristaltik pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07554-85<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Tablo 3.Yama kelepçesi ekipmanı.</güçlü></td></tr><tr><td>1,870 nm lazer diyot</td><td>Optotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 &mu; m çaplı çok modlu fiber optik yama kablosu (FC / PC)</td> <td>AFW Technologies</td><td>MM1-FC2-200 / 220-5-C-0.22</td><td>Işık iletimli fiber optik, silika çekirdek ve kaplama, 0.22 NA</td></tr><tr><td>Konektör aracılığıyla fiber optik (FC / PC)</td> <td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optik balta</td><td>EREM</td><td>FO1</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optik sıyırma aleti (0,25 - 0,6 mm) </td><td>Siemens</td><td></td><td>Fiber optik kılıfı çıkarmak için</td></tr><tr><td>Fiber optik sıyırma aleti (0,6 - 1,0 mm)</td><td>Siemens</td><td></td><td>Yama kablosunun dış kaplamasını çıkarmak için</td></tr><tr><td>Sinyal üreteci</td><td></td><td></td><td>Gerekli darbe şekillerini verebilen ve harici olarak tetiklenebilen herhangi bir sinyal üreteci</td></tr><tr><td>Fiber optik konumlandırıcı</td><td></td><td></td><td>Özel yapım konumlandırıcı. Yama kelepçesi deneyleri için kullanılan standart mikro konumlandırıcı ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Fiber optik ayna</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td></td></tr><tr><td>Lazer güç ölçer ve dedektör kafası</td><td></td><td>LM-3 (dedektör kafası) ile Tutarlı FieldMate (güç ölçer)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 4. Lazer ekipmanı.< / güçlü></td></tr></tbody></table>

kızılötesi sinir stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm hücre patch kelepçe

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Bu darbeli, kızılötesi lazer ışık hedef doku arasında herhangi bir başka değişiklik bağımsız olarak, sinir dokusu elektrik yanıtları ortaya çıkarmak için kullanılabilir, son yıllarda gösterilmiştir. Kızılötesi sinir uyarımı işitsel sinir nöronların uyarılması gösterilen özel bir ilgi ile, in vivo periferik ve duyusal sinir dokusu çeşitli rapor edilmiştir. INS bu ayarları çalışmak gösterilmiştir Ancak,, kızılötesi ışık sinir uyarım neden olan mekanizma (veya mekanizmaları) şu anda iyi anlaşılmış değildir. Burada sunulan protokol kültürlenmiş birincil işitsel nöronlar içinde kızılötesi sinir stimülasyonu soruşturma kolaylaştırmak için tasarlanmış bir bütün hücre yama kelepçe yöntem açıklanır. İyice kontrollü şartlar altında in vitro kızılötesi lazer aydınlatma için bu hücrelerinin yanıtı ile karakterize, bu temel Physica geliştirilmiş bir anlaşılmasını sağlamak için mümkün olabilirl ve biyokimyasal süreçleri kızılötesi sinir stimülasyonu altında yatan.

Spiral ganglion nöronlarının voltaj-kıskaç ve akım kelepçe kayıt konfigürasyonlarının tekrarlanabilir dalga lazer aydınlatma yanıt. Şekil 3a, bir 2.5 ms, 0.8 mJ lazer darbeli (6 ortalama müdahale yanıt olarak bir hücre zarından akımı tipik değişiklikler gösterir -70 mV, -60 mV ve -50 mV düzenlenen membran potansiyeli ile 1 sn aralıklarla) tekrarlanan lazer darbeleri,. Net içe akımları sürekli aydınlatma kesildikten sonra başlangıç ​​değerlerine dönen, lazer darbeleri yanıt olarak uyarılır. Lazer kaynakl...

Kızılötesi sinir stimülasyonu işitme sistemi ile ilgili olanlar dahil olmak üzere, sinir tipleri, bir dizi elektrik stimülasyonu için bir alternatif olarak önerilmiştir. Bu protokol, birincil işitsel nöronların bir kültür içinde kızılötesi sinir stimülasyonu mekanizmasını incelemek için bir yama kelepçe yöntem açıklanır.

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kızılötesi lazer aydınlatmasının in vitro ortamdaki işitsel nöronlar üzerindeki etkilerini incelemek için bir model sistem oluşturmaktır. Bu, elektrik karakteristiklerini araştırmak amacıyla kültürlenmiş işitsel nöronların tüm hücre konfigürasyonunda patch clamp yöntemiyle analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, nöronların lazer ışınımına maruz bırakılması, maruz kalan hücrede patch clamp düzeneği ile ölçülebilen elektriksel yanıtlar oluşturabilir.Lazerle tetiklenen elektriksel yanıtlar üzerindeki etkilerini gözlemlemek amacıyla aydınlatma parametreleri ve çevresel değişkenler çeşitlendirilebilir. Lazer ışığına maruz kalan işitsel nöronlar, daha sonra analiz edilmek üzere her lazer darbesine yanıt olarak tekrarlanabilir elektriksel aktivite sergileyecektir. Bu yöntem, spiral ganglion nöronlarının kızılötesi stimülasyonunun altında yatan mekanizmalar hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem, özellikle spiral ganglion hücrelerinin kızılötesi uyarımı hakkında bilgi sağlayabilse de, ilgili fiziksel süreçleri daha ayrıntılı bir şekilde açıklamak için diğer hücre tiplerine veya lipid çift tabakaları gibi basitleştirilmiş modellere de genişletilebilir. Işık iletimi yapan optik fiberin doğru konumlandırılmasını sağlamak için bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir; çünkü ortaya çıkan radyans maruziyeti kritik bir parametredir. İki ila altı mega ohm dirence sahip kayıt mikro pipetleri hazırlayın. Bunlar, bir CO2 lazer çekicisi ile borosilikat camdan çekilebilir.Fiber kuplajlı lazeri hazırlayın. Geniş bir optik fiber yelpazesi kullanılabilir. FCPC konnektörlü bir patch cord konfigürasyonundaki fiberin ortadan kesilmesi, bir ucunda konnektör, diğer ucunda ise açıkta fiber bulunan iki fiber bağlantısı oluşturur.Bunlar pigtail'lerdir. Bir pigtail'in çıplak ucunu; fiber kılıfını çıkararak, etanol ile temizleyerek ve bir mikroskop altında uygun bir araçla kırarak hazırlayın. Ucun fiber eksenine dik olduğunu ve düz göründüğünü kontrol edin.Fiber pigtail'in diğer ucunu, gerekirse uygun bir ara konnektör kullanarak stimülasyon lazerinin çıkışına bağlayın. Bu noktada, fiberden çıkan lazer gücünü her zaman ölçtüğünüzden emin olun. Bunu, uçla ilgili yapılacak diğer tüm manipülasyonlardan sonra da tekrarlayın.Şimdi fiberi bir mandren içine yerleştirin ve mandreni uygun mikro konumlandırıcıya sabitleyin. Ardından, optik fiberin bir lamel ile oluşturduğu açıyı belirleyin. Düzeneklerin fotoğrafını çekin ve Image J kullanarak açıyı hesaplayın. Şimdi, lazeri patch clamp veri toplama sistemiyle senkronize eden bağlantıları güvenli hale getirin.Patch clamp veri toplama sisteminden gelen dijital çıkış, harici bir fonksiyon jeneratörü aracılığıyla lazere bağlanmalıdır; bu durum, lazer darbe parametrelerinin veri toplama sisteminden bağımsız olarak belirlenebilmesini sağlar. Lazer darbe zamanlamasının ve uzunluğunun elektrofizyolojik sinyalle eş zamanlı olarak kaydedilebilmesini sağlamak için, lazeri tetikleyen sinyal veri toplama sisteminin bir girişine geri bağlanmalıdır. Perfüzyon sisteminin akış hızını dakikada bir ila iki mililitre arasına ayarlayın. Çözeltinin hızlı ısıtılması için hat içi bir ısıtıcıya ve kullanılmış çözeltiyi vakumla uzaklaştırmak için bir peristaltik pompaya sahip olan yerçekimi destekli bir sistem yeterli olacaktır. Kültürlenmiş hücrelerin bulunduğu bir lamel camı, yüksek büyütmeli su daldırma objektifi ve faz kontrastı kullanarak dik mikroskobun kayıt haznesine yerleştirin ve bir spiral ganglion nöronu bulun.Tipik bir spiral ganglion nöronu, belirgin bir çekirdeğe sahip, parlak yuvarlak görünümlü ve yaklaşık 15 mikron çapındadır. Uygun bir nöron bulunduğunda, daha düşük büyütmeli bir objektife geçerek hedef nöronu belirleyin. Ardından, optik fiberin ucu hem yatay hem de dikey düzlemlerde hedef nörona yakınlaşana kadar mikro konumlandırıcıyı kullanarak fiberi hareket ettirin.Yüksek büyütmeli objektife geri dönün ve optik fiberin ucunu nöronun yanındaki hedeflenen konuma yerleştirin. Fiberin dikey konumu ayarlanırken, fiberin alt kenarının lam örtü camının kenarına dayanması önemlidir. Fiberin konumundaki belirsizliği en aza indirmek için, temas noktası mikroskop görüntüsündeki görsel ipuçlarından belirlenebilir.Fiber konumlandırıldıktan sonra, mikro pipetin konumlandırmasını etkilememek için fiberi boyuna ekseni boyunca bilinen bir miktarda dışarı kaydırın. Mikro pipet hücre içi solüsyon ile doldurulmuş olmalı ve amplifikatörün kafa kısmına güvenli bir şekilde yerleştirilmelidir. Mikro elektrot tutucunun yanına bağlı tüpler yardımıyla, mikro pipetin tıkanmasını önlemek için küçük bir miktarda pozitif basınç uygulayın.Bir mikro manipülatör kullanarak mikro pipeti hedef nöronun hemen üzerindeki konuma getirin ve giga ohm sızdırmazlığının (seal) oluşturulması işlemine geçin. Sızdırmazlık test darbesi sırasında, akıma uydurulan eksponansiyel eğriden belirlenen membran kapasitansı, seri direnç ve giriş direncini kaydedin.Amplifikatör üzerindeki CP fast ve CP slow kontrollerini ayarlayarak kapasitans geçişini minimize edin. Ardından amplifikatörü whole cell moduna geçirin ve SEAL testi sırasında düz bir akım gözlemlenene kadar kapasitans ve direnç kompanzasyonunu modifiye edin. Sonra, yaklaşık %70 düzeltme (correction) ve %70 öngörü (prediction) ile seri direnç kompanzasyonunu uygulayarak, düz bir test seal yanıtını korumak için kapasitans ve direnç kompanzasyon kontrollerini ayarlayın.Ardından amplifikatörü akım kenetleme (current clamp) moduna getirin. Akım enjeksiyonu yokken dinlenme membran potansiyelini kaydedin. Şimdi, membran potansiyelini istenen seviyede stabilize etmek için bir tutma akımı (holding current) ayarlayın.Pipet kapasitansını nötralize edin ve voltaj düşümünü dengelemek için köprü dengesini ayarlayın. Depolarizan akım ile stimülasyon yaparak nöronun ateşleme özelliklerini kontrol edin. Bu noktada, bir CCD kameraya bağlı görüntüleme yazılımını kullanarak optik fiberi tekrar nöronun yanındaki konumuna getirin; önce nöron düzlemine odaklanmış, ardından optik fiberin üst kenarına odaklanmış görüntüler yakalayın.Optik fiberin üst kenarının hedef nöronun merkezine göre konumunu belirten delta değerini belirlemek için görüntüleri analiz edin. Optik fiberin konumunun doğru şekilde bilinmesi çok önemlidir. Bunun nedeni, hedef hücreye iletilen birim alan başına enerjinin veya radyans maruziyetinin, kızılötesi nöral stimülasyon için kritik bir parametre olması ve bunun, fiberin hücreye göre konumundan önemli ölçüde etkilenebilmesidir.Bu lazerin optik gücü, lazere yapılan doğrudan bir giriş aracılığıyla bilgisayar tarafından kontrol edilir ve her kayıt öncesinde manuel olarak belirlenebilir. Puls uzunluğu ve tekrarlama hızı, daha önce açıklandığı gibi fonksiyon jeneratörü aracılığıyla kontrol edilebilir; verilerin hem patch clamp kanalından hem de lazer tetikleme kanalından kaydedildiğinden emin olun. Genellikle 0,25 ile 5 mJ arasındaki, yarım ile 15 ms uzunluğundaki lazer pulları, başlangıçta ölçülebilir elektriksel yanıtlar verir.İstenmeyen etkileri en aza indirmek için lazer darbelerinin tekrarlama hızını bir hertz veya altına ayarlamak faydalı olabilir. Tüm lazer parametreleri ayarlandıktan sonra veri toplama işlemine geçiniz.Spiral ganglion nöronları, 2,5 milisaniyelik 0,8 milijoule lazer darbelerine yanıt olarak, hem voltaj klempi hem de akım klempi kayıt konfigürasyonlarında tekrarlanabilir dalga formları ile yanıt verirler. Tipik bir hücre, çeşitli tutma potansiyellerinde net bir içe doğru akım üretir. Akım klempi kayıtları, bu lazer darbeleri boyunca sabit bir membran depolarizasyonu ve ardından darbeden sonra dinlenim membran potansiyeline doğru yaklaşık eksponansiyel bir azalma gösterir.Bazı durumlarda, lazer darbesini takiben küçük bir ek membran depolarizasyonu da meydana gelir. Aşırı enerji ile aydınlatma veya sıcaklıktaki büyük artışlara maruz kalma, hücrenin elektriksel özelliklerinin bozulması veya anlık hücre ölümü şeklinde gözlemlenen hücre hasarına yol açabilir. Bu prosedür izlenerek, lazerle tetiklenen elektriksel aktivite üzerindeki etkilerini test etmek amacıyla çözelti sıcaklığı veya kimyasal faktörler gibi bir dizi çevresel parametre değiştirilebilir.Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve standart güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın. Bu önlemler arasında lazer güvenlik gözlüklerinin kullanılması, uyarı levhalarının yerleştirilmesi ve lazer ışınının yüksek yansıtıcılığa sahip yüzeylerle kazara kesişmediğinden emin olunması yer alır.

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Video, transfekte edilmiş bir fare hipokampal beyin dilimindeki sinaptik etkileşimleri ve nöronal tepkileri incelemek için bir protokol göstermektedir. Aksiyon potansiyellerini tetiklemek için uzun menzilli duyusal nöronların aydınlatılmasını ve elde edilen uyarıcı post-sinaptik potansiyellerin tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılarak kaydedilen nöronda kaydedilmesini içerir.

Fare hipokampal dilimlerindeki nöronların fotostimülasyon ve tam hücre yama kelepçesi kayıtları

Bu video, iç kulak duyusal nöron hücre gövdelerindeki iyonik akımları ölçmek için yama-kelepçe tekniğini göstermektedir. Hücre içi koşulları korurken iyon hareketine izin vermek için zarı delen amfoterisin B içeren dahili bir çözelti ile doldurulmuş cilalı bir yama kelepçeli pipetin hazırlanmasını ve kullanımını detaylandırır. Voltaj darbeleri, iyon kanalı aktivitesini tetiklemek ve kaydetmek için uygulanır ve özellikleri ve davranışları hakkında bilgi sağlar.

İç Kulak Duyusal Nöron Hücre Gövdelerinin Delikli Yama-Klemp Kayıtları

Bu video, reobaz ve membran potansiyelini ölçmek için yama kelepçesi tekniği kullanılarak dorsal kök gangliyonlarındaki duyusal nöron uyarılabilirliğinin incelenmesini ve nöronların artımlı akım enjeksiyonlarına tepkilerini analiz etmeyi göstermektedir.

Sağlam Sıçan Dorsal Kök Gangliyonlarında Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Dilim yama klemp tekniği içsel özelliklerini ve uyarıcı ya da inhibitör sinapslarda plastisite öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için etkili bir yöntemdir.

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Öğrenin, kızılötesi lazer stimülasyonunun işitme nöronları üzerindeki etkilerini tam hücre patch kelepçe yöntemiyle nasıl inceleneceğini. Bu teknik, nörofizyoloji araştırmalarında sinirsel yanıtları detaylı analiz etmeyi sağlar.

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

Daha fazla video keşfet