Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (

Bu video protokolü, yetişkin bal arılarında aynı anda iki genin susturulması için kullanılan yeni teknikleri ve ardından çift gen susturmanın bal arısının tat algısı üzerindeki etkisini ölçmek için probosis uzatma yanıtı veya PER testi gerçekleştirilmesini göstermektedir. Bu işlem; vitellin, genin, ultras, spherical ve yeşil floresan proteinleri için üç protein genini hedefleyen çift sarmallı RNA'ların öncelikle sentezlenmesiyle gerçekleştirilir.

GFP'yi kodlayan gen bal arısı genomunda bulunmadığı için, GFP çift sarmallı RNA negatif kontrol olarak kullanılır. İkinci adım, dört farklı işlem stratejisi kullanarak bal arılarına çift sarmallı RNA enjekte etmektir: yalnızca GFP çift sarmallı RNA enjeksiyonu, tek bir enjeksiyonda VG ve USP çift sarmallı RNA karışımı enjeksiyonu, ilk gün vg çift sarmallı RNA ve ardından ikinci gün USP çift sarmallı RNA enjeksiyonu ve ilk gün USP çift sarmallı RNA ve ardından ikinci gün VG çift sarmallı RNA enjeksiyonu; enjeksiyonlar sonrası arılar, işlemlere karşılık gelen renk kodlu boya noktalarıyla işaretlenmiş ve kovanlarına geri bırakılmıştır.

Altı gün sonra, işlem görmüş arılarda VG ve USP gen susturması gerçek zamanlı PCR ile doğrulanmış ve çift VG ve USP susturmasının tat algısı üzerindeki etkisi PER testi ile belirlenmiştir. Sonuç olarak, çift susturma uygulanan arıların VG ve USP gen ekspresyonlarında anlamlı azalmalar ve sakharoza karşı tat algılarında anlamlı artışlar olduğu gösterilmiştir. Uyguladığımız girişim, gen fonksiyonlarını ortaya çıkarmak için kullanabileceğimiz güçlü bir araçtır.

Genellikle tek bir geni hedeflemek için kullanılır. Ancak genler, karmaşık düzenleyici ağların bir parçasıdır. Herhangi bir biyolojik süreci daha iyi anlamanın yollarından biri, genlerin gen ağıyla nasıl etkileşime girdiğini öğrenmektir.

Bunu yapmak için, aynı anda birden fazla geni manipüle etmemiz gerekir. Şimdiye kadar böceklerde tek seferde yalnızca bir geni baskılayabiliyorduk; burada ilk kez, bal arılarında bir yerine iki geni nasıl susturacağınızı göstermek istiyoruz. Proboscis extension reflex veya PER, bal arısı sosyal davranışının davranışsal bir öngörücüsü olan tat alma algısını ölçmek için oldukça yararlı bir tekniktir.

Örneğin, yüksek gustatuar algıya sahip yuva arıları, davranışsal olarak hızlı olgunlaşır, yaşamlarının erken dönemlerinde dışarıya çıkarak besin ararlar ve polen toplamayı tercih ederler. Bu prosedüre başlamak için, ücretsiz primerThree yazılımını kullanarak susturulacak genleri hedefleyen çift zincirli RNA primerleri tasarlayın. Bu deneyde, susturulması hedeflenen iki gen vitelligenin (VG) ve ultraspherical (USP) proteinleridir.

VG ve USP tasarımlarının yanı sıra, bal arısı genomunda bulunmayan ve yeşil floresan protein (GFP) kodlayan bir kontrol genini hedefleyen çift sarmallı RNA primerleri hazırlanmıştır. Ardından VG, USP ve GFP için çift sarmallı RNA sentezi, Promega'nın rib max T seven RNA üretim sistemi kullanılarak in vitro transkripsiyon yoluyla gerçekleştirilmiştir.

Çift sarmallı RNA'lar standart prosedürler kullanılarak saflaştırıldıktan sonra, gen baskılamasının etkinliğini sağlamak amacıyla her bir çift sarmallı RNA peleti nükleaz içermeyen su ile çözün; çift sarmallı RNA konsantrasyonu mikrolitre başına yaklaşık 9 ila 10 µg olmalıdır. Arıları enjeksiyona hazırlamak için yeni çıkan arıları 4 °C'lik bir buzdolabında bir ila iki dakika boyunca soğutun. Arılar hareketsizleştiğinde, üç ila dört arıyı, abdomenleri ile toraksları arasından böcek iğneleri geçirilmiş şekilde, katı balmumu dolu Petri kaplarına paralel olarak sabitleyin.

Arıları dört derece Celsius'lik bir buzdolabında yaklaşık bir ila iki dakika boyunca tekrar soğutun. Arıların tamamen hareketsiz olduğundan emin olun. Arılar kıvrılmış veya bükülmüş değil, gevşek görünmelidir.

Herhangi bir hareket yaranın boyutunu ve mortaliteyi artırabileceği için tam immobilizasyon önemlidir. Kıvrılmış veya bükülmüş arılar çok uzun süre soğutulmuştur ve yüksek mortalite nedeniyle kullanılmamalıdır. Bir Hamilton mikro şırıngaya tek kullanımlık 30 gauge iğne takın.

Şırıngayı üç µL çift sarmallı RNA ile doldurun ve şırıngada hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Eğer tek seferlik enjeksiyon stratejisi uygulanıyorsa, şırınga iki genin çift sarmallı RNA karışımıyla doldurulur. Eğer iki günlük enjeksiyon stratejisi uygulanıyorsa, şırınga iki çift sarmallı RNA'dan biriyle doldurulur.

İğneyi abdomenin yan tarafına yerleştirin. İç organlara zarar vermemek için, çift zincirli RNA'nın emilmesini sağlamak amacıyla şırınga pistonunu yavaşça itin. Çift zincirli RNA çok viskoz olduğundan, şırıngadan tamamen boşaltılması iki ila üç saniye sürer.

Pistonu tamamen aşağı ittikten sonra, iğneyi dört ila beş saniye boyunca yarada bırakın. Enjeksiyonlardan sonra arıları üç ila beş saniye boyunca gözlemleyin. Eğer yaradan hemolenf damlası sızarsa arıyı ayırın; arıların torakslarını farklı işlemlere karşılık gelen farklı renklerle işaretleyin.

Bu noktada, tek enjeksiyon stratejisi kullanılıyorsa, arıları ballı bir kap içerisinde bir saat boyunca gözlemleyin ve ardından kolonilerine geri yerleştirin. Ancak, iki günlük enjeksiyon stratejisi kullanılıyorsa ve yalnızca ilk çift zincirli RNA enjekte edilmişse, arıları yan tarafında bal bulunan silindirik gözenekli bir kafese yerleştirin. Arıları, ertesi güne kadar bir gece boyunca 34 °C ve %80 nemdeki bir inkübatörde tutun.

İlk çift zincirli RNA için uygulanan prosedürün aynısını kullanarak, aynı arılara ikinci çift zincirli RNA'yı enjekte edin. Arıların, bal tedarik edilmiş bir kap içerisinde oda sıcaklığında bir saat boyunca dinlenmelerine izin verin ve ardından onları bir koloniye yerleştirin. Enjeksiyonlardan altı gün sonra, kovanı açmak için tütünsüz bir şekilde koloniden işlem görmüş arıları toplayın.

Bu prosedürde test edilecek olan arıların tat alma algısını etkileyebileceği için duman kullanılmaz. PER testi için, her kafese arıları yerleştirmek amacıyla yumuşak pensler kullanarak metal tel örgü silindir kafeslere kafes başına en fazla üç arı gelecek şekilde arıları toplayın.

Arıları, tamamen hareketsiz kalana kadar dört derece Celsius'ta soğutun. Her bir arıyı, PER için özel olarak tasarlanmış plastik bir tüpe dikey olarak yerleştirin. Karın kısmını tüpün içinde tutmak ve baş kısmının tüpten dışarıda kalmasını sağlamak için bant kullanın.

Tüpleri, küçük plastik sütunlardan oluşan iki sıralı bir rafa yerleştirin. Montajı yapılmış arılara bir kimlik numarası atanabilmesi için sıralardan biri numaralandırılmıştır. Arılar inkübe olurken, işlem görmüş arıların bulunduğu rafları iki saat boyunca 34 °C sıcaklıkta ve %80 nemde bir inkübatöre yerleştirin.

Bir dizi sakkaroz su çözeltisi hazırlayın. PER analizi için çözeltileri 15 ila 20 gauge iğneli şırıngalara doldurun.

Arılar gruplar halinde test edilir. İlk olarak her arının antenine %0'lık çözelti (su) damlası ile dokunun, ardından sırasıyla %0,1, %0,3, %1, %3, %10 ve %30'luk sakkaroz çözeltileriyle test edin. Her bir çözelti arasındaki aralık için en az iki dakika süre tanıyın.

Tek bir sükroz konsantrasyonu kullanarak 20 arıyı test etmek genellikle yaklaşık iki dakika sürer. Bu nedenle, her grupta her zaman 20'den fazla arı bulunmalıdır. Bir arı probosisini tamamen uzattığında, bu pozitif bir yanıt olarak sayılır.Gerçek zamanlı.

PCR analizi, hem tek seferlik enjeksiyon hem de iki günlük enjeksiyon stratejilerinin bal arılarında Fiji ve USP transkript seviyelerini önemli ölçimde azalttığını doğrulamıştır. Çift zincirli RNA enjekte edildikten altı gün sonraki bu grafiklerde, RQ hedef gen transkriptlerinin bağıl kantifikasyon seviyesini belirtmekte ve çubukların üzerindeki farklı harfler işlem grupları arasındaki anlamlı farkları göstermektedir. Post-hoc analiz, çift zincirli RNA karışımıyla yapılan tek seferlik enjeksiyon ve önce VG sonra USP şeklinde yapılan iki günlük enjeksiyon ile sağlanan USP transkript baskılamasının, önce USP sonra VG şeklinde yapılan iki günlük enjeksiyona göre anlamlı derecede daha düşük olduğunu ortaya koymuştur.

Bu durum, VG'nin VG ve juvenil hormon düzenleyici döngüde birincil bir regülatör olabileceğini göstermektedir. İşlem gören arılar için GUA yanıt puanları veya GRS, burada gösterildiği gibi probosis uzatma yanıtı veya PER deneyi sonuçlarından hesaplanmıştır. VG ve USP çift zincirli RNA karışımı enjekte edilen arılardaki GRS, GFP kontrol arılarındaki GRS'den anlamlı derecede yüksek çıkmıştır; bu da çift nakavt uygulanan arıların sukrozla daha hassas olduğunu göstermektedir.

Sütunların üzerindeki farklı harfler, tedavi grupları arasındaki anlamlı farkları belirtmektedir. Burada, VG ve USP genlerinin eş zamanlı olarak baskılanmasıyla ortaya çıkarılan vitellogenin ultras, sferik ve juvenil hormon arasındaki olası bir düzenleyici ağ gösterilmiştir. Tek başına USP nakavt işlemi juvenil hormonda herhangi bir değişikliğe yol açmazken, VG ve USP'nin çift nakavtı, tek başına VG nakavtına kıyasla juvenil hormonda daha büyük bir artışa neden olur.

Bu durum, vitelli'nin sadece juvenil hormon üretimini engellemekle kalmayıp, aynı zamanda USP nakavtuna karşı verilen juvenil hormon geri bildirim yanıtını da inhibe ettiğini göstermektedir. Çifte nakavtlarda, juvenil hormon üretimindeki dramatik artış, VG nakavtunun neden olduğu VI genin inhibisyonundaki azalmadan ve USP nakavtunun neden olduğu azalmış juvenil hormon iletimine karşı gelişen kompansatuar yanıttan kaynaklanmaktadır. Bu düzenleyici ağın daha ayrıntılı bir tartışması, beraberindeki protokol metninde yer almaktadır.

Çift gen susturma yaklaşımını kullanarak; vital genic, ultras, spherical ve juvenil hormon arasındaki, yalnızca tek bir geni baskılayarak keşfedemeyeceğimiz detaylı bir ilişkiyi ortaya çıkardık. Artık araştırmacılar, bu tekniği kullanarak düzenleyici ağlar içindeki genlerin birbirleriyle olan ilişkilerini inceleyebilirler. PR, bal arılarında tat alma algısını ölçmek için kullanılan standart bir yöntemdır; ancak bu yöntem tutmaya ve uygulamaya karşı çok hassas olduğundan, hayvanların ortamı ve kullanımı arasındaki tutarlılığı sağlarken çok dikkatli olunmalıdır.

Ayrıca, deney birkaç gün boyunca gerçekleştirilecekse, kısa bir zaman çizelgesi tutmak ve hava koşulları ile ortam şartlarının değişmediğinden emin olmak için bunları takip etmek faydalı olacaktır.