Name: Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'tan prostaglandin ve eikosanoid ekstraksiyonu için LC-MS/MS yöntemini. Bu hassas ve spesifik analiz, lipid metabolitlerinin kapsamlı tanımlanmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz UAB Cilt Hastalıkları Araştırma Merkezi (C. Elmets için P30 AR050948), UAB-UCSD O&#39;Brien Akut Böbrek Hasarı Merkezi (P30 DK079337 A. Agarwal için kısmen desteklenmiştir UAB Hedefli Metabolomik ve Proteomik Laboratuvarı, teşekkür ederim ) ve UAB Akciğer Sağlığı Merkezi (R01 HL114439, R01 HL110950 JE Blalock için). Kütle spektrometresi desteği bir NCRR Paylaşılan Araçları hibe (S. Barnes için S10 RR19261) oldu. Ayrıca teknik destek için Ray Moore teşekkür ederim. C. elegans suşları NIH tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlandı. Bu çalışma NIH (bir arra idari ek dahil olmak üzere R01GM085105 için MAM,) tarafından desteklenmiştir.

Solucanı kültürü, prostaglandin ekstraksiyon ve prostaglandin analizi: Aşağıda tarif edilen protokole üç bölüme ayrılmıştır. Belirtildiği gibi örnekleri geçici olarak -80 ° C veya -20 ° C&#39;de saklanabilir zaman, birden fazla nokta vardır 1. Worm Kültür Biz kapsamlı LC-MS/MS karışık aşamada solucanlar yaklaşık 6 gr tavsiye ederiz. Bu saptama, en az altı ayrı enjeksiyon için yeterli malzeme sağlamalıdır. Tek bir enjeksiyon ya da iki MRM tarafından bilinen PG ölçümü için, 1-2 gram yeterli olacaktır. Belli bir aşamada oluşan senkronize kültürleri özler analizi, aynı zamanda mümkündür. Kadar 4 farklı suşları aynı anda yetiştirilebilir. Örneğin, bir vahşi tipli kontrol ve üç farklı mutant. <ol><li> Tamamlayıcı beslenme için 65 (16 cm) X-büyük NGM plakalar ve konsantre bakteri hazırlayın. Tohumlama için NA22 bakteri kullanın. Tamamlayıcı beslenme, Gro için konsantre bakteri yapmak için16-24 saat boyunca LB ortamı içerisinde NA22 w en az dört litre. Aşağı doğru döndürün, M9 tampon 100 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon bakterileri yok. Bu konsantre bakteri çözeltisi 200-400 ml her biri sonsuz bir suş için gerekli olabilir. 4 ° C&#39;de saklayın </li><li> 5 X-büyük plakaları üzerinde solucan kültür başlayın. Plakaları gebe yetişkinlerin tam kadar yaklaşık 3 ila 4 kuşaktır solucanlar büyütün. Konsantre bakteri açlık önlemek için plakaları eklenir, gerektiğinde (~ 1 ml / plakası ve kapak takmadan önce cihazın tamamen kurumasını bekleyin). Olmalıdır </li><li> M9 tamponu ile plakalar gebe çift cinsiyetli yıkayın ve bir 50 ml konik polipropilen tüp solucanları toplamak. </li><li> Gebe çift cinsiyetli alt (genellikle 3-5 dk) yerleşmek için izin verin. Bakteriler, yumurta ve larva aşamasında solucanlar dahil olmak üzere, süpernatantı. 15 ml M9 tampon tekrar süspansiyon ve hafifçe karıştırın. </li><li> 60 tohumlu NGM plakalar her birine solucan süspansiyonu 200 ul aktarın. Plakalar arasındaki solucanlar dağıtılır. Solucan çözüm karışık tutunde tüm plakaları kadar onlar solucanlar kabaca eşit sayıda aldığınızdan emin olmak için numaralı seribaşı edilmiştir. </li><li> Açlık önlemek için gerekli (~ 1 ml/plate/12 için 24 saat süre) olarak konsantre bakteri ile Ek. Tabak kapakları değiştirmeden önce kurumaya bırakın. Plakaları gebe yetişkin dolu numaralı seribaşı solucanlar orijinal sayısına bağlı olarak, 2-4 nesiller için solucanlar büyümek, ya da kadar. </li><li> Hasat solucan plakaları her seferinde bir suşu. M9 tamponu ile plakalar solucanlar yıkayın ve 50 ml polipropilen tüpleri (örneğin 6 tüpler) toplamak. Bir tabak yıkamak için M9 tampon kullanın, sonra bir sonraki plakasına solucan dolu tampon aktarın. Plaka bir dizi (örneğin,. 10.) yıkandıktan sonra, 50 ml tüp solucan dolu tampon aktarın. M9 tampon ile üst tüpün doldurun. Plakaların geri kalanı için yıkama tekrarlayın. </li><li> Gravid yetişkin 5-6 dakika içinde dibe olarak, sıvı (~ 35 mi) kaldırmak ve bir ya da iki tüp içine birleştirmek. Fr ile 50 ml tüplere doldurunESH M9 tampon, 3-5 dakika bekletin, ve süpernatant bırakarak gebe yetişkin kaldırın. 3 kez tekrarlayın veya süpernatant saydam oluncaya kadar. </li><li> Büyük bir delik Pasteur pipeti, iki 15 ml polipropilen konik tüpler için mümkün olduğunca çok sayıda solucan gibi havalesi ile. Bir klinik santrifüj 5 dakika boyunca 1000 RCF (CentraSL2 içinde ~ 3500 rpm) aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve solucanlar aynı tüpte aktarılır ve pelet kadar tekrarlayın. -80 Mümkün ve mağaza solucanlar kadar süpernatant olarak kaldırmak ° C Tüm suşlar için tekrarlayın. </li></ol> 2. Prostaglandin Ekstraksiyon Çıkarılması için gerekli ayıraçlar aşağıda gösterilmiştir. Bu yöntem Golovko Murphy 17 değiştirilmiş bir ve LC-MS/MS hassasiyeti artırır sıvı-sıvı temizleme, ardından aseton ekstraksiyonu içerir. Benzer sonuçlar, bir Dounce homojenizatör ile elde edilebilir, ancak bir mermi blender 5 homojenleştirici prosedür kullanılır. Bütillenmiş hydroxytolueNE (BHT) ve azot altında buharlaştırma (N2) gaz, oksidasyon önlemek için kullanılır. Tüm cam lipid bağlayıcı azaltmak için (Sigmacote) silikonlu olmalıdır. Organik çözücü ile özünün çıkarılması kimyasal bir kaput yapılmalıdır. <ol><li> , 50 ml polipropilen konik tüpe tartılır. 6.5 ml işareti yakın sıcak bir jilet ile tüp aracılığıyla keserek -80 ° C&#39;de saklanan 15 ml konik tüp dondurulmuş solucanlar yaklaşık 6.0 g aktarın. Bir metanol-temizlenmiş spatula tüpün altındaki dondurulmuş pelet solucanı kaldırmak için kullanılabilir. Pelet üst alt kısmının, daha az yoğun larva solucanlar ve kalan bakteriler almak için pelet keserek geride bırakılır. </li><li> Önceden tartılmış 50 ml konik tüp, donmuş solucanlar aktarın. Birden fazla numune işleme edilmektedir, karşılaştırmalı çalışmalar için doku aynı miktarda (6.0 g) kullanın. Bir hamur içine solucanlar çözülme gibi, istenen kitle elde etmek için spatula ile solucanlar eklemek veya kaldırmak. İsteğe bağlı: Reklamekstraksiyon verimlilik için bir iç kontrol olarak PGF 2α-d4 standart d 1.00 ng. </li><li> Solucan süspansiyon 0.005% BHT ile buz gibi soğuk 02:01 aseton / serum fizyolojik 12 ml ekleyin ve karıştırın iyice karıştırın. Mermi blender içinde kullanım için oniki 5 mi kendine ayakta plastik tüplerin her solucan bulamacın 1.5 ml dağıtın. </li><li> 0.5 mm 0,7-0,8 ml çapında Ceria her 5 ml tüp zirkonyum oksit boncuk stabilize. Sıkıca kapakları kapatın ve Bullet Blender 5 homojenizatör içine 12 tüpler yükleyin. Hızlı 8-9 az 3 dakika için blender çalıştırın ve Tüpler buz üzerine yerleştirin. Çok sıkı kapakları kapatmak için ya da içeriği dökülebilir emin olun. Bir Stereoskop kullanarak bir slayt üzerinde bir tüpten homojenatında 10 ul kontrol edin. Kalan çok az sağlam solucan olmalıdır. Gerekirse, bir dakika için aynı hızda tekrarlayın. </li><li> Eşit bir 9 &quot;Pasteur pipeti kullanarak dört adet 10 ml konik cam tüpler için homojenatlarında aktarmak. Transfer boncuk kaçının. Üç tüp seque gelen boncuk yıkayınntially 01:02 aseton / tuzlu su içeren BHT 1 ml. Tüm boncuk yıkanır kadar diğer tüpler için tekrarlayın. 10 ml cam tüplere kalan çözelti (~ 4 mL) aktarın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> 4, 10 ml cam tüpler Santrifüj ° C de 10 dakika boyunca ~ 1000 xg&#39;de bir klinik santrifüj. Her bir tüp, temiz bir 10 ml&#39;lik bir cam konik tüp süpernatant aktarın. </li><li> Kimyasal bir başlık olarak, her bir 10 ml bir cam tüpe heksan eşit hacimde ekleyin. Örneğin, 3.5 ml aseton / tuzlu su çözeltisi için 3.5 mL heksan ilave edin. 30 saniye için maksimum hızda Vortex. </li><li> 4, 10 ml cam tüpler Santrifüj ° C de 10 dakika boyunca ~ 1000 xg&#39;de bir klinik santrifüj. Hekzan içeren üst faz ve nötr ücret lipidler atın. </li><li> 2 M formik asit (- 150 ul, yaklaşık 100) kullanılarak pH 3.5 &#39;e asitlendirilir alt faz. PH şeritleri kullanarak test pH. </li><li> Her tüpe kloroform eşit hacimde ekleyin. 30 saniye için maksimum hızda Vortex ve 4 tüpler santrifüj ° C i10 dakika boyunca ~ 1000 xg&#39;de na klinik santrifüj. </li><li> Çıkarın ve üst sulu faz atın. Interfaz kaçınarak, alt kloroform fazına kalan sütlü interfaz ile bir pipet takın. Temiz bir 15 ml konik cam tüpe 4 tüplerin her biri ikinci alt aşama toplayın. En az 24 saat boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. Bu noktada, özü iki haftaya kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Dondurucu özü çıkarın ve varsa, kalan sütlü sulu üst tabaka atın. Yeni bir Pasteur pipet kullanarak Teflon kaplı etiketli ½-Dram cam şişe için kloroform faz aktarın. Kimyasal bir kaput, N2 gazı hafif bir akımı altında kuruyana kadar kloroform çözünebilir fraksiyon buharlaşır. Kuru ekstresi, 2 haftaya kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. PG çıkarma ve analiz için kullanılan genel bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. </li></ol> 3. Prostaglandin Analizi <ol><li> Stok hazırlayınçalışan bir çözelti elde etmek için su (8:2 h / h): bu 2α PGF ya da PGF 2 metanol içinde α-D4 (1 ug / ml) olarak ve metanol ile seyreltilir özel referans prostaglandinlerin çözümler. Bir standart eğri oluşturmak için bir seri seyreltilmesi (100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng / ml) hazırlayın. </li><li> Kurutuldu C. su (8:2 h / h): 200 ul metanol ekleme elegans lipid özü (ler) ve iyice karıştırın. Su solüsyonu: sonsuz doku az 6 g ekstre edildi durumunda, kuru ekstresi metanol daha az bir hacimde yeniden asıldı edilmelidir. </li><li> Su içinde% 0.1 formik asit içeren, mobil faz hazırlanır [A] ve% 0.1 formik asit ihtiva eden asetonitril [A]. </li><li> 4 ° C de otomatik örnekleyici kurmak ve bir 70-sayısı 1.5 ml şişe rafa örnek şişeleri yerleştirin. </li><li> Yaklaşık 5 dakika boyunca, 0.2 ml / dk &#39;lık bir akış oranında% 0.1 formik asit ile Sinerji hidro RP-C18 kolon dengelenmesi. </li><li> Sütuna örnek (20-50 ul) enjekte edilir. Gradyan elüsyon başlangıç ​​yapmaking% 10 B ve 0-11 dakika, 11-14 dk% 80-100 B, 80% B kadar gidiyor ve 16 dk% 10 B geri dönen. Toplam çalışma süresi 20 dk. 13 özgün standartları tutma süreleri referansı 3 için Tablo 1 &#39;de gösterilmektedir. </li><li> Negatif iyon modunda ise, bir ESI arabirim işletim kullanarak, kütle spektrometresi içine atık sütun tanıtılması. Azot nebulizer ve perde gazı (KKO = 10) olarak kullanılır. Çarpışma gaz, çarpışma enerji ve sıcaklık sırasıyla 10, -35 eV ve 600 ° C de ayarlanır. Declustering potansiyeli (DP), çarpışma enerjisi (CE), ve hücre çıkış potansiyeli (CXP) sırasıyla -90, -35 ve -10 ayarlanır. </li><li> Anket taramaları (Q1 taramaları) için, en PG (Şekil 2) için m / z 315-360 kütlesi aralığında negatif iyon modunu kullanın. Aralık ilgi bileşik (ler) kütlesine bağlı olarak değiştirilebilir. LC-MS iyon kromatogramların toplam iyon akımı (TIC) den iyonları ve belirleyen extrac olsunted iyonları ya da deprotone yaklaşımlı iyonları uygun ya da fragmanı iyonları. </li><li> MRM deneyler için, geçiş kütle m / z 355/311 F1 sınıfı tespit etmek için kullanılan, m / z 353/193, F2 sınıf için kullanılır ve m / z 351/193 ya da 351/191 F3 sınıfı için kullanılan (Şekil 3). MRM ayrıca, iç standart (örneğin, m / z 357/197 PGF 2α-D4) tespit etmek için ve standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. PG kitle geçişler 18 hakkında daha fazla bilgi için Murphy ve ark. Bakın. </li><li> MS / MS deneyler için, F1 sınıfı, m / z 353for F2 sınıfı, ve m / z 351for F3 sınıfı PG için m / z 355 kullanın. C. F-serisi PG için elegans, MS / MS verileri, Şekil 4 ve Tablo 2, 3,16 mevcuttur. Memeli eikozanoidler için MS / MS veri mevcuttur <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> . </li><li> Analys kullanarak analitik veri işlemet yazılım (Sürüm 1.4.2, Applied Biosystems). </li></ol>

<ol><li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li>
<li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li>
<li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li>
<li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li>
<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li>
<li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li>
<li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li>
<li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandins+and+leukotrienes%3A+advances+in+eicosanoid+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li>
<li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li>
<li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+prostanoids%3A+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li>
<li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors%3A+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li>
<li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors%3A+studies+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprostanes%3A+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li>
<li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271(2013).</li>
<li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+LC-MS%2FMS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li>
<li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li>
<li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li>
<li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biodivers%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li>
<li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması var.

Biz F-serisi PG odaklanarak, eicosanoid çıkarma ve analiz için bir prosedür açıklanmaktadır. Sorunlu olabilir prosedürün çeşitli yerlerinde bulunmaktadır. Birincisi, açlık PG metabolizmasını değiştirebilir gibi solucan kültür, açlıktan yok önemlidir. NA22 yüksek yoğunluklu ulaştığı için, tamamlayıcı besleme için, NA22 bakteri yerine daha yaygın olarak kullanılan OP50 bakteri tavsiye edilir. Ancak, NA22 gerginlik antibiyotik direnci yoksun ve kirlenmeye daha hassastır. İkinci olarak, solucanlar memeli dokularında göre düşük bolca bireysel PG izomerleri sentez. Bunun nedeni, kısmen çok sayıda izomerler arasında fazlalık bağlı olabilir. Biz kapsamlı bir analiz ve güçlü sinyaller için doku yaklaşık 6 gr tavsiye ederiz. Kuru ekstresi az metanol içinde süspansiyon haline getirildi, daha az doku (1-2 g) kullanılabilir: su çözeltisi PG konsantrasyonunu artırmak için. Bununla birlikte, sadece 1-2 enjeksiyon yapılabilir. Bizim LC-MS/MS sisteminin saptama limiti 10 pg hakkındaPGF 2α / ml arasındadır. Yoğun dolu karışık aşamada solucanlar biri ml (yaklaşık 1 gr) CePGF2 yaklaşık 25-50 pg verir. Daha hassas kütle spektrometresi sistem analizi için gerekli solucan doku miktarını azaltabilirsiniz. Üçüncü olarak, örnekleri arasında PG ekstraksiyon verimi farklılıklar değişken sonuçlara neden olabilir. Bu ekstraksiyon verimi dokularda paralel ekstre zaman çok benzer olduğunu bulduk. Etkinliğini belirlemek için, bir iç kontrol olarak, homojenleştirme adımı da PGF 2α-D 4, 1.0 ng ekleyin. MRM m / z 357/197, 1 ng / ml standart çözeltiye göre PGF 2α-d4 konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan kütle geçişi kullanılarak. Çıkarma sırasında kaybolan PGF 2α-d 4 miktarı daha sonra hesaplanır. Biz dahil kromatografi parametreleri ve kitle geçişler diğer PG ve eikozanoidler tespit etmek için değiştirilebilir. Önemli çaba rağmen, D-serisi veya e-ser tespit etmek mümkün olmamıştırler ekstreler 17 syf. Ayrıca, 8-iso PGF 2α ve PG stereoizomerler 19 seçici olmayan bir karışım oluşturur serbest radikal tarafından başlatılan peroksidasyonu, karakteristik 8-iso PGE 2 tespit değil. Solucanlar diğer PG tür sentez olmadığı bilinmemektedir. Endokannabinoidlerin ve araşidonik ve eikosapentaenoik asit çeşitli epoksi ve hidroksi metabolitleri C bulunmuştur elegans 5,7,20,21 ayıklar. Biz sırasıyla, ölçme ve tanımlama için otantik standartlarına göre MRM ve MS / MS hem de kullanmanızı tavsiye ederiz. Yeni eikosanoidlerin için, bu analizler, mümkünse, enzimler 22, hem de bir işlevsel analiz sentez PUFA eksik olan yağ mutantlar, karşılaştırmalı bir çalışma ile kombine edilmelidir. Yağ mutantlar analiz için bir uyarı solucanlar bulunan PUFA bir dakika miktarda PG sentezi için yeterli olmasıdır. Örneğin, yağ-2 (wa17) mutantlarD12 desatüraz aktivitesinin küçük bir miktarda (~ 5 vahşi tip 22%), ve bu mutantların hala PG 6 üretir. yağ-3 (wa22) ve yağ-4 (WA14) mutantlar arakidonik asit, eikosapentaenoik 16 türetilmiş PG sentezi için başarısız olması . Ayrıca yağ mutantlar kalan sınıflardan düzenleyen PG sentezini PUFA&#39;nın sınıfların kaybını telafi bulduk. Örneğin, yağ-3 (wa22) mutantlar 20-karbon ÇDYA elde edilen en PG sentez için başarısız. Bunun yerine, 18-karbon PUFA 16 türetilmiş yeni PG up-regüle görünmektedir. Bugüne kadar, bir C belirlenememiştir PG sentezini tamamen eksik olan elegans suşu. Bu PG büyüme ve gelişme için gerekli olan mümkündür.

Prostaglandinler (PG) yoğun bir şekilde araştırılmıştır ve organizmaların 12-14 geniş bir dizi üreme, bağışıklık ve gelişim düzenlenmesinde suçlanmıştır lipid hormonların önemli bir sınıfıdır. Bunlar, ortak bir ön-madde (ler) den elde edilen lipidlerin bir dizi oluşturan nedeniyle PG ideal kapsamlı sistem biyoloji analizler için uygundur. Nematod ° C. elegans genetik ve sistem biyolojisi temel soruları için en yaygın olarak kullanılan model organizmalar biridir. Bu çalışma sonucunda C. elegans F-serisi PG sentezler bu oosit 3,6,16 için hareketli sperm kılavuzu. Sırasıyla, üç, dört ve beş çift bağ, F1 ihtiva eden, F2, F3 sınıflar, 20-karbon PUFA elde edilen F-serisi PG 3,16 tespit edilmiştir. Bu PG siklooksijenaz enzimler bağımsız olarak sentezlenmiş ama PGF 1α ve PGF, 2α stereoizomerler de ge vardırnerated. C. kalitatif ve kantitatif analizleri için elegans PG, LC-MS/MS güçlü ve duyarlı bir analitik tekniktir. Bu analiz yapmadan önce, bu analitik sürecin performansı ağır özü kalitesine bağlıdır çünkü optimize edilmiş bir ekstraksiyon yöntemi geliştirmek önemlidir. Sıvı kromatografi ve kütle spektrometresi yalnızca oranı (m / z) şarj etmek için beklenen kitle, hem de PG ana iyonu arasında arzu edilen bir tepe şekli ve saklama süresi sağlayabilir. C. PG metabolik profil elegans çeşitli MS satın alma stratejileri gerektiren zor bir iştir. LC-MS tam tarama veya anket tarama (Q1 tarama) çoğu iyonize PG bir kitle spektrometrik yanıt üretecektir sağlanması avantajına sahiptir. Araştırma tarama yabani tip ve mutant C ile ilgili PG toplam profil hakkında bilgi sağlar iken elegans, küçük PG algılama düşük hassasiyeti nedeniyle tehlikeye düşer. Buna rağmendaha az, LC-MS anket tarama PG küresel bir görünüm vermek ve büyük bir PG nüfusun metabolizmasını etkileyen tahmin mutantlar analiz için yararlıdır olabilir. Metabolizma tanımlama olarak, kimyasal olarak sentezlenmiş bir PG standartların LC-MS/MS analizine göre, referans bileşikleri gibi, ürün iyon spektrumları elde etmek için gerçekleştirilir. Bu spektrum, bilinmeyen bir metaboliti spektrumuna karşılaştırılabilir. Çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM) modu daha iyi bir hassasiyet ve özgüllük için kullanılır. MRM bir deney, bir bileşiğin, ana iyonu / ürün iyon kütle geçişi belirleyerek gerçekleştirilir. Hedef analitlerin kütle ve yapısı bilerek, çok bilinmeyen metabolitleri için teorik MRM geçişleri tahmin etmek mümkündür. C. izomerik PG profil için optimize edilmiş bir LC-MS/MS yöntemi elegans bildirilmemiştir. Burada, LC-MS ve oluşan bir ekstraksiyon ve entegre bir kütle spektrometresi yaklaşım tarif LC-, Tespit miktarının, ve C araştırmak için MS / MS yöntemleri elegans PG metabolitleri. Bu yaklaşım, başka bir eikosanoidlerin uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>X-large (16 cm) plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli suşu NA22</td><td>Kaenorhabdit Genetik Merkezi (CGC)</td><td>NA22</td><td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td></tr><tr><td>Aseton, 399.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>Bütillenmiş Hidroksitoluen</td><td>MP Biyomedikal</td><td>101162</td><td></td></tr><tr><td>Heksan, HPLC sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-1</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit, 3%99</td> <td>Acros</td><td>AC27048-0010</td><td>Fisher Scientific Chloroform aracılığıyla temin edilebilir</td></tr><tr><td>, HPLC sınıfı</td><td>Acros</td><td>AC26832-0010</td><td>Fisher aracılığıyla temin edilebilir Bilimsel</td></tr><tr><td>PGF2<alt>&alfa; -d4</td><td>Cayman Chemicals</td><td>316010</td><td>Cayman, satın alınabilecek çok çeşitli standartlara sahiptir</td></tr><tr><td>Steril vidalı kapak, bağımsız 5 ml tüp</td><td>, Fisher Scientific</td><td>14-222-651</td>, <td>Bullet Blender</td></tr><tr><td>0,5 mm zirkonyum oksit boncuklar</td> ile kullanım <td>içinSonraki > > > Advance</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>10 ml cam konik ağır hizmet dereceli santrifüj tüpleri</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>15 ml cam konik tüpler</td> aracılığıyla temin edilebilir <td>Corning Pyrex</td><td>8082-15</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sigmacote (Silikonlaştırıcı reaktif)</td> aracılığıyla temin edilebilir <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Teflon kaplı kapaklı 1/2 Dram cam şişe</td><td>Fisher Scientific</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</strong</td></tr><tr><td>>CentraSL2 Klinik Santrifüj</td><td>Thomas Scientific</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 5 mavi homojenizatör</td><td>Sonraki > > > Advance</td><td>BBY5MB</td><td>40 ml Dounce homojenizatör, alternatif bir</td></tr><tr><td>Synergi 4 & mu olarak kullanılabilir; m Hidro-RP 80 ve #197; LC Sütun 250 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>HPLC Sütun</td></tr><tr><td>SecurityGuard Kartuşları AQ C18 4 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>SecurityGuard Koruma Kartuşları Kiti</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence HPLC, soğutmalı otomatik örnekleyici ile</td><td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td><td></td><td>Üçlü dört kutuplu kütle spektrometresine bağlı herhangi bir standart HPLC sistemi yeterli olmalıdır</td></tr><tr><td>API 4000 üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi</td><td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">M9 tampon tarifi (4 litre)</td> </tr> <tr> <td>12 g</td> <td> KH<alt>2PO4</td> </tr> <tr> <td>24 g</td> <td>Na2HPO4</td> </tr> <tr> <td>20 g</td> <td>NaCl</td> </tr> <tr> <td>4 litreye kadar</td> <td>Deiyonize su</td> </tr> <tr> <td colspan="2">Sekiz adet 1 litrelik şişeye kadar. Otoklav ve serin.</td> </tr> <tr> <td>0.5 ml/şişe</td> <td>1 M MgSO4</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

prostaglandin ekstraksiyon ve analiz<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans lipidler 1-9 biyolojisi okumak için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Prostaglandinler, çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) 10-14 türetilmiş lipit sinyallerdir eikosanoidlerin önemli bir sınıfı vardır. Bu sinyal molekülleri nedeniyle düşük bolluk ve reaktif doğanın çalışma zordur. Prostaglandin karakteristik özelliği, yağlı asit omurga içinde yer alan, bir siklopentan halka yapısıdır. Memelilerde, prostaglandinler siklooksigenaz-bağımlı ve bağımsız yol 10,15 yoluyla oluşturulabilir. ° C. elegans siklooksijenazların 6,16,17 bağımsız prostaglandin geniş bir dizi sentezler. F-serisi prostaglandinlerin büyük bir sınıfı tespit, ama eikozanoidler çalışma yeni keşifler için bol bol yer ile erken bir aşamada değil. Burada prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Ücretli lipids, bir sıvı-sıvı ekstraksiyon tekniği ile kütle solucan kültürlerden gelen ekstre edilmiş ve bir elektrosprey iyonlaştırmalı tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) birleştirilmiş sıvı kromatografisi ile analiz edilir. Gibi α-D 4 PGF 2 gibi prostaglandinlerin döteryumlu analogları dahil edilmesi, dahili bir standart kantitatif analiz için tavsiye edilir gibi. Çoklu reaksiyon takip işlemi veya MRM yabani tip ve mutant hayvanlar arasındaki spesifik prostaglandin tipi ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Çarpışma bağlı ayrışma veya MS / MS önemli yapısal özellikler hakkında bilgi elde etmek için kullanılabilir. Sıvı kromatografi kütle spektrometrisi (LC-MS), m / z 315-360 olarak seçilen bir kütle aralığı diğer taramalar prostaglandin seviyeleri küresel değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Hepimiz üç analizlerin örnekler sağlar. Bu yöntemler yeni eikozanoidler keşfetmek ve metabolik yollar sınırlarını belirleyen bir araç ile araştırmacılar sağlayacaktır.

Numune hazırlama Golovko Murphy 17 uyarlanmış sıvı-sıvı ekstraksiyon gerçekleştirilmiştir. Bu, dahili bir standart (PGF 2α-d4) arasında mükemmel bir iyileşme sağlanmaktadır. C. PG çıkarılması için genel şeması elegans, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Kromatografik koşullar&gt; 30 eicosanoid standartları (Tablo 1 13 standartları gösterir) bir temel ayrımı sağlamak için optimize edilmiştir. % 0.1 formik asit ihtiva eden su ve asetonitril ile bir hidro-RP kolon (250 x 2.0 mm İD), en iyi ayırma ve hassasiyeti sağlanır. Yabani tip ve yağ-3 mutant özler diğer taramalar 315-360 atomik kütle birimi kütle aralığı içindeki iyonların Şekil 2, belge küresel düzeyde gösterilmiştir. Yağ-3 (wa22) mutantlar çok 20 karbon PUFA yoksundur. Bir F3 sınıf PG vurgulanır. Şekil 3&#39;te, bir vahşi-tip özü MRM analiz F1 birden fazla PG izomerleri (Şekil 3A göster </stro<html> ng&gt;), F2 (Şekil 3B) ve F3 (Şekil 3C ve 3D) sınıfları. F3 sınıfı iki kitle geçişler biri ile tespit edilebilir, m / z 351/193 veya m / z 351/191. CePGF2 ağırlıklı PGF 2α enantiomerin oluşur. CePGF1 PGF 1α veya enantiyomeri olması muhtemeldir. Şekil 4 CePGF2 en çarpışma kaynaklı ayrışma (RT = 11.8) PGF2 α standardına göre (RT = 11.8) gösterir. Ürün iyonları küçük farklar büyük olasılıkla özü düşük CePGF2 bolluğu ve ortak salınımlı bileşikleri ile kaynaklanmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Şekil 1. C. şematik diyagramı elegans PG çıkarma ve LC-MS analizleri. Her iki yağ oksidasyonunu en aza indirgemek için% 0.005 &#39;lik BHT sahip aseton / tuzlu su ve kloroform unutmayın. Daha fazla bilgi için metne bakın.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Şekil 2. Yabani tip ve yağ-3 (wa22) mutant özler m / z 315-360. Sıvı kromatografi tutma süresi (RT) arasında diğer taramalar paneli [A] &#39;de gösterilmektedir. Oda sıcaklığında Çıkarılan iyonları = 11.3 yabani tip [B] ve yağ-3 (wa22) [C] özleri için gösterilmiştir. Kütle m / z 351 ile F3 sınıf PG vurgulanır. Cps, sayım / sn; amu, atomik kütle birimi. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> Incirure 3. Vahşi tip özler MRM analizleri. F1 sınıfı PG kütle geçiş m / z 355/311 [A] ile tespit edilir. PG olması olası birkaç hidrofobik bileşikler (RT&gt; 14 dk), bu geçiş ile tespit dikkat edin. F2 sınıfı PG kitle geçiş ile tespit edilir m / z 353/193 [B]. F3 sınıf PG ya kitle geçiş ile tespit edilir m / z 351/193 [C] veya m / z 351/191 [D]. Özler her sınıfın birden çok PG izomerleri içeren dikkat edin. Sayılar Tablo 2&#39;de gösterilmiştir PG karşılık gelmektedir. CePGF2 konsantrasyonu 1.8 ng / ml &#39;dir. RT, tutma süresi; cps, sayım / saniye. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> Şekil 4. Kimyasal synth çarpışma kaynaklı ayrışmaPGF 2α ve CePGF2 esized. panelindeki Oklar [A] PGF 2α ve CePGF2 (RT = 11.8) arasında paylaşılan ürün veya parçalanma iyonları gösterir. M / z 309 ve m / z 193&#39;de ürün iyonları gösterilen yapılara karşılık belirtilen yarılma bölgeleri (a ve b gösterilmiştir) tarafından üretilen, ve F-serisi PG karakteristik [A]. Edilir Cps, sayım / sn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Standart </td><td> RT (dk) </td><td> [MH] - m / z </td><td> MS / MS anahtar ürün iyonları </td></tr><tr><td> 20-hidroksi PGE2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> B 2 tromboksan </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319.311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoksin B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191.189, 165, 155, 115, 107, 71, 59. </td></tr><tr><td> PGT 2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - A 4 Lipoksin </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59. </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Lökotrien B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HpETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Saklama süreleri ve LC-MS/MS yöntemi 3 13 eicosanoid standartlarının önemli ürün iyonları. 30 standartları LC-MS/MS programı geliştirmek için kullanılmıştır. Kromatografik tutma kez (RTS) bile çok benzer PG arasında, farklılık. Bir istisna PGF 1α ve PGF 2α olduğunu. Bununla birlikte, bu PG d vardır(- m / z [MH]) ve çarpışma kaynaklı ayrışma spektrumları (MS / MS), üst iyon kitleler tarafından istinguished. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Prostaglandin sınıf </td><td> Şekil 3, No </td><td> [MH] - m / z </td><td> MS / MS anahtar ürün iyonları </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Tablo 2&#39;de. Birçok önemli C. için Çarpışma kaynaklı ayrışma ürünü iyonları elegans F1, F2, F3 ve PG, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Diğer daha az oranda izomerler MS / MS gösterilmemiştir. Bu veriler birden analizler ve tüm ürün iyonları belirli bir vadede görülebilir. Özleri karmaşıklığı göz önüne alındığında, biraz daha az bol ürün iyonları müdahalesinden benzer tutma süresi ya da sonuç ile başka bir ana iyon köken alabilir. Pik 2 olasılıkla CePGF1 bir stereoizomer ve pik 4 olasılıkla CePGF2 bir stereoizomer. Ek veri 3 Edmonds, ve ark. (2010) bakın.

Bu yazıda, prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz için optimize edilmiş bir prosedür tarif<em&gt; C. elegans</em&gt; LC-MS/MS kullanarak.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Bu prosedür, deniz zarafeti ekstratlarındaki prostaglandinleri ve diğer eikozanoidleri tanımlamayı ve ölçmeyi amaçlamaktadır. Öncelikle, solucanları büyük ölçekli kültürlerde yetiştirin. Ardından, bir sıvı-sıvı ekstraksiyon tekniği kullanarak hidrofilik lipidleri solucan dokusundan ekstrakte edin ve lipid ekstratlarını kütle spektrometresine bağlı bir HPLC kolonuna enjekte edin.Ardından, sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi verilerini analiz edin. Nihayetinde, saflaştırılmış sıcak ekstraktlara uygulanan bu lc MSMS yaklaşımı, yeni metabolitleri tanımlayabilir ve aynı zamanda S serisi prostaglandinler gibi bilinen metabolitleri ölçebilir. Dolayısıyla, bu tekniğin enzim immünolojik testler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek hassasiyete ve özgüllüğe sahip olmasının yanı sıra aynı zamanda kapsamlı ve esnek olmasıdır; bu tekniği laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Hugh Hong gösterecektir. Solucanların ek beslemesi için pellet ve NA 22 kullanın.Bakteri kültürünü santrifüjle çevirin, süpernatantı atın ve bakteri peletini 100 mililitre M dokuz tamponunda yeniden süspande edin. Konsantre bakteri çözeltisini dört derece Celsius'ta saklayın. Solucan kültürlerini beş adet ekstra büyük NGM plakasında başlatın.Plakalar tamamen dolana kadar solucanları üç ila dört nesil boyunca üretmeye devam edin. Açlığı önlemek için, yetişkinlere ihtiyaç duyulduğunda solucan plakalarına yaklaşık bir mililitre konsantre bakteri ekleyin. Kapağı kapatmadan önce tamamen hava ile kurutun.Ardından, seçilen hermafroditleri M nine tamponu ile plakalardan yıkayın. Solucanları 50 mililitrelik konik polipropilen bir tüpe toplayın. Daha sonra solucanların dibe çökmesine izin verin.Bakteri yumurtalarını ve larval evredeki solucanları içeren süpernatanı atın. Şimdi, kalan solucanları 15 milliliters M9 tamponu içerisinde süspanse edin ve nazikçe karıştırın. Solucan süspansiyonunun 200 microliters kısmını, önceden ekim yapılmış 60 adet NGM plağının her birine dağıtın.Tüm plaklara yaklaşık olarak eşit sayıda solucan gelmesini sağlamak için, ekim işlemi tamamlanana kadar solucan solüsyonunu iyice karıştırılmış halde tutun. Solucanları plaklara dağıtın. Solucanları, her 12 ila 24 saatlik süre boyunca plak başına bir mililitre konsantre bakteri ekleyerek iki ila dört nesil boyunca büyütün.Plakalar GR yetişkinlerle dolduğunda, solucanları her seferinde bir suş olacak şekilde toplayın. Solucanları M nine tamponu ile plakalardan yıkayarak altı adet 50 mililitre polipropilen tüpe aktarın. Solucanları yıkamak için tüpleri M nine tamponu ile doldurun.Yetişkin solucanlar dibe çöktüğünde, süpernatantın yaklaşık 35 mililitresini uzaklaştırın. Ardından solucanları bir veya iki tüpe çekin. Geniş ağızlı bir pastör pipeti kullanarak, süpernatant şeffaf hale gelene kadar veya üç kez M9 yıkama işlemini tekrarlayın.Mümkün olduğunca çok solucanı 15 mililitrelik polipropilen konik tüpe aktarın. 1000 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Diğer suşlar için toplama, yıkama ve birleştirme adımlarını tekrarlayın.Hasat edilen solucan suşlarının stoklarını -80 °C'de saklayın. Kırmızı kor halindeki bir jilet kullanarak polipropilen konik tüpün ağırlığını işaretleyin. Hasat edilen solucanları içeren dondurulmuş bir polipropilen tüpü 6 mL işaretinin yakınından kesin.Steril koşullar altında. Yaklaşık altı gram dondurulmuş solucan peleti tartım örneğine aktarın. Bir nanogram iç standart ve 12 mililitre buz gibi soğuk asetonlu salin çözeltisi ekleyin.BHT karışımı ile, 1,5 mililitre solucan süspansiyonunu 12 adet beş mililitrelik dik durabilen plastik tüpe eşit şekilde dağıtın. 0,7 mililitre stabilize zirkonyum oksit boncuk ekleyin. Gerekiyorsa solucan süspansiyonunu homojen hale getirin.Dokuz inçlik bir pastör pipeti kullanarak, sağlam solucanların oranı %10'un altına düşene kadar işlemi bir dakika daha tekrarlayın. Homojenatı, boncukları dahil etmeden dikkatlice dört adet 10 mililitrelik konik cam tüpe aktarın. Üç tüpteki boncukları birleştirin ve BHT içeren bir mililitre asetonlu salin çözeltisi ile yıkayın.Bu yıkama işlemini boncuk içeren diğer tüpler için tekrarlayın. Yıkama solüsyonunu buz üzerindeki cam tüplere aktarın. Ardından, homogenatı 1000 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Dört °C'de, her tüpteki süpernatanı temiz bir 10 mL'lik cam konik tüpe aktarın. Ardından, kimyasal çeker ocak altında, her tüpe eşit hacimde heksan ekleyip maksimum hızda 30 saniye boyunca vorteksleyin. Sonrasında dört °C'de, 1000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.Alt sulu fazı asitlendirmek için iki milimolar formik asit kullanarak heksan ve nötr yüklü lipidleri içeren üst fazı atın. pH şeritleri ile pH değerinin 3,5 olduğunu test edin. Şimdi, her tüpe eşit hacimlerde kloroform ekleyin ve 30 saniye boyunca maksimum hızda vorteksleyin.Numuneleri 4 °C'de yaklaşık 1000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüj edin. Cam pipet ucunu alt kloroform fazına yerleştirin ve tüpü eğerek katı ara yüzeyden kaçınmaya çalışın. Dört tüpteki ekstraktları tek bir 15 mL'lik konik cam tüpe aktarın.Cam tüpteki havayı azot gazı ile tahliye edin ve -20 °C'de 24 saatten iki haftaya kadar inkübe edin. Ekstraktı çözdürdükten sonra, mevcutsa kalan sütlü sulu üst tabakayı atın. Yeni bir past pipet kullanarak.Kloroformu, kimyasal çeker ocak içerisinde etiketlenmiş, Teflon kaplı yarım DRM cam şişeye aktarın. Organik çözücüyü hafif bir nitrojen gazı akışı altında buharlaştırın ve örnekleri -20 °C'de iki haftaya kadar saklayın. Öncelikle, metanol içerisinde tekil referans prostaglandin stok çözeltilerini hazırlayın.%80 metanol içerisinde seri dilüsyon yaparak bir standart eğri oluşturun. Ardından, kurutulmuş deniz zambağı lipid ekstraktlarını analiz için 200 µL %80 metanol içerisinde çözün. Numunenin 20 ila 50 µL'sini ters faz kolona enjekte edin ve negatif iyon modu ESI ara yüzü kullanarak metin protokolünde detaylandırıldığı şekilde gradyan analizini gerçekleştirin.Kolon çıkışını kütle spektrometresine aktarın. Çarpışma gazını 10 elektron volt olarak ayarlayın. Çarpışma enerjisini ise eksi 35 elektron volt olarak belirleyin.Sıcaklık 600 °C. -90'daki temizleme potansiyeli ve -11'deki hücre çıkış potansiyeli, analiz yazılımı kullanılarak ekstre edilen örneklerde bulunan farklı prostaglandin sınıflarını analiz etmek için bir standart eğri oluşturur. Solucan ekstrelerinde bulunan prostaglandinleri belirlemek için verileri işleyin.Yabani tip ve fat three mutant solucan ekstraktlarının tarama analizleri, 315 ile 360 atomik kütle birimi kütle aralığındaki iyonların genel seviyelerini göstermektedir. Yabani tip solucanlarla karşılaştırıldığında, fat three mutantları, bir F üç sınıfı prostaglandin örneğinde olduğu gibi, 20 karbonlu pfa'ların çoğundan yoksundur. Gri ile vurgulanan 3 51 kütle şarj oranı ile MRM analizleri, farklı prostaglandin sınıflarını tanımlayabilmektedir.Örneğin, F1 sınıfı prostaglandinler vahşi tip ekstratlarında mevcuttur; ayrıca daha uzun alıkonma sürelerine sahip diğer çeşitli hidrofobik bileşikler de bulunmaktadır. Kütle geçişinin değiştirilmesi, F2 ve F3 sınıfı prostaglandinlerin daha detaylı analiz edilmesine olanak tanıyarak solucan ekstratlarının her sınıftan birden fazla prostaglandin izomeri içerdiğini göstermektedir. C. elegans prostaglandininin çarpışma ile indüklenen bozunmasının standart prostaglandin ile karşılaştırılması, beklenen kopma bölgelerinin ürün iyonlarının haritalandırılmasında kullanılabilir. Lipid oksidasyonunu önlemek amacıyla.Uygun önlemleri almayı unutmayın. Örneğin, belirtilen çözeltiye antioksidan VHT ekleyin ve ekstrakttaki havayı azot gazı ile tahliye edin.

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Belirli çevresel stres faktörlerine maruz kaldıktan sonra, nematod Caenorhabditis elegans, strese dirençli bir 'dauer' gençlik aşamasına girmek için geniş fenotipik plastisiteye uğrar.  Dauer sırasında nöroplastisitenin kontrollü indüksiyonu ve görüntülenmesi için yöntemler sunuyoruz.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

Biz disseke C. aktif ERK mekansal ve zamansal lokalizasyonu için immünofloresan görüntüleme bazlı yöntem mevcut elegans gonad. Burada açıklanan protokol C herhangi bir sinyal görüntülenmesi veya yapısal protein için uyarlanabilir elegans yumurtalık, uygun bir antikor reaktifi kullanılabilir sağladı.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

Biz üç boyutlu Caenorhabditis elegans germline. inşası için otomatik yöntemi mevcut Bizim yöntem sayısını ve her çekirdek germline ve analizleri germline protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı içindeki konumunu belirler.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Sperm, bir ooksit döllemek için ovidukt üzerinden başarılı bir şekilde gezinmelidir. Burada, C. elegans hermafrodit uterusun içinde sperm göçünü ölçmek için bir tahlil açıklanmaktadır. Bu tahlil çiftleşme sonra rahim içinde sperm dağılımı nicel veri sağlayabilir, yanı sıra hız, yönlü hız, ve ters frekans.

Ölçme sperm rehberlik ve motilite içinde Caenorhabditis elegans hermafrodit üreme yolu

Bu makalede, caenorhabditis elegans hücre dışı veziküller üretmek, arındırmak ve ölçmek için yöntemler sunar.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Bu protokol, C. elegans'ta RNAi kaynaklı susturma ve ilişkili kromatin modifikasyonlarının epigenetik kalıtımını incelemek için bir RNA girişimini ve ChIP testini açıklar.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Bu protokol, C. elegans'taki uçucu seks feromonuna verilen yanıtların çıkarılması ve ölçülmesi için yöntemler oluşturur ve kimyasal iletişim ve navigasyon yörüngesini incelemek için araçlar sağlar.

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'tan prostaglandin ve eikosanoid ekstraksiyonu için LC-MS/MS yöntemini. Bu hassas ve spesifik analiz, lipid metabolitlerinin kapsamlı tanımlanmasını sağlar.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz

Daha fazla video keşfet