MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, maltoz bağlayıcı protein veya MBP etiketleme stratejisini kullanarak MGM 1 0 1 gibi büyük oligomerik, DNA bağlayıcı proteinler hazırlamaktır. Bu işlem, önce MGM 1 0 1 açık okuma çerçevesinin, e coli'de ekspresyon için PMLC two E vektöründeki MBP'nin aşağı akımına klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, M-V-P-M-G-M 1 0 1 füzyon proteini, AMLO afinite kromatografisi ile e coli'den saflaştırılır.

Ardından MGM 1 0 1, proteolitik kesim yoluyla MVP'den serbest bırakılır ve katyon değişim kromatografisi ile MVP'den ayrılır. Son olarak, MGM 1 0 1 halkaları boyut dışlama kromatografisi ile homojenliğe kadar saflaştırılır. Nihayetinde, yaklaşık 0.8 miligram çözünür MGM 1 0 1 elde edilir.

Bir litre bakteriyel kültürden elde edilen protein, mitokondrilerde DNA onarımı için önemli olan bu proteinin biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için kullanılabilir. MGM 1 0 1'in malt bağlayıcı protein etiketli versiyonunu kullanmanın temel avantajı, bu versiyonun etiketlenmemiş versiyona göre daha az toksik, daha çözünür ve daha stabil olmasıdır. Sonuç olarak, e coli içerisinde doğal MGM 1 0 1 proteininin yüksek düzeyde ekspresyonunu sağlayabiliyoruz.

Merhaba, benim adım Sarah Vicki. SUNY Upstate Medical University'deki Dr. Jji TEN'in laboratuvarında kıdemli araştırma destek uzmanıyım. Meslektaşım Wan Wong ve ben şimdi MGM 1 0 1'in ekspresyonunu ve saflaştırılmasını göstereceğiz. Olgun MGM 1 0 1 kaplama dizisini amplifiye etmek için PCR kullanarak füzyon proteininin üretimini başlatın.

MGM 1 0 1'in, kesildiği bilinen ilk 22 amino terminal kalıntısını dahil etmeyin. Mitokondriye aktarıldıktan sonra, amplifiye edilmiş MGM 1 0 1, ekspresyon vektörü PM MAL C two E'nin modifiye edilmiş bir versiyonunda maltoz bağlayıcı proteini veya MVP'yi kodlayan MAL E dizisinin aşağısına yerleştirilir. Bu işlem, hassas proteaz için bir kesim bölgesi içeren bir bağlayıcı ile M-V-P-M-G-M 1 0 1 füzyonunu oluşturur. Plazmid, ilk olarak mavi beyaz seçimi yapılmadan e coli transformantlarının seçilmesiyle oluşturulur.

Elde edilen plazmid PLC2E, MGM101, ardından e. coli suşu BL21(DE3)RIL'e aktarılır ve ampicillin ile chloramphenicol içeren LB plaklarında büyütülür. Öncelikle, taze 10 mL takviye edilmiş LB ortamı, e. coli transformantları ile inoküle edilir ve 37 °C'de, 200 RPM çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, iki litre takviye edilmiş LB ortamı, ön kültürden alınan 10 mL ile inoküle edilir.

Hücreleri 37 °C'de çalkalayarak büyütün. OD 600 0,5 değerine ulaştığında, final konsantrasyonu 0,3 Millimolar olacak şekilde IPTG ekleyerek M-B-P-M-G-M 1 0 1 füzyon proteininin ekspresyonunu indükleyin; hücreleri 30 °C'de beş saat boyunca çalkalayarak büyütün. Beş saat geçtikten sonra kültürleri 500 milliliter'lik santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri santrifüjasyon yoluyla toplayın.

Süpernatan atıldıktan sonra, proteaz inhibitörleri içeren 30 mililitre lizis tamponu ekleyin ve hücre peletini pipetle aşağı yukarı çekerek yeniden süspande edin. Ardından, hücre süspansiyonunu buz üzerinde 20 saniye boyunca sonike edin. %50 görev döngüsünde bir ultrasonik işlemci kullanarak, hücrelerin buz üzerinde 30 saniye boyunca soğumasını sağlayın.

Ardından sonikasyon ve soğutma adımlarını iki kez daha tekrarlayın. Süspansiyonu buz üzerinde tutarak, iki mg/mL konsantrasyonda bir mililitre ekleyin.

DNA stokunu hücre lizatıyla birlikte dört derece Celsius'ta iki saat boyunca çalkalayın. İki saat geçtikten sonra, 36 mL lizata dört mL beş molar sodyum klorür ekleyerek nihai tuz konsantrasyonunu 500 milimolar seviyesine ayarlayın.

Ardından hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 4 °C'de 30 dakika boyunca 10,000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Bu aşamada, sonikasyonla lizis verimliliğini izlemek için 20 µL'lik bir alikot kullanılabilir.

Bir SDS-PAGE jelinde. Ardından, hücre lizatı bir amiloz kolonundan geçirilir. MVP MGM 1 0 1 füzyon proteinini saflaştırmak için, 15 mililitrelik konik bir tüpe 50% konsantrasyonundaki AMLO reçinesinden 1,5 mililitre ekleyerek başlayın.

Ardından dengeleme yapmak için 13 mililitre lizis tamponu ekleyin ve 2000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini dört kez daha tekrarlayın, ardından reçineyi 0,75 mililitre lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. Dengelenmiş AMLO süspansiyonunu hücre lizatına ekleyin ve dört °C'de gece boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.

Ertesi gün, lizat amiloz reçine karışımını soğuk odaya kurulmuş bir econo kolon kromatografi kolonuna yükleyin. Bağlanmamış proteinlerin yer çekimi filtrasyonu yoluyla bir toplama tüpüne geçmesini sağlamak için musluğu açın. Ardından, 300 mililitre birinci yıkama tamponu ekleyerek AMLO reçinesini yıkayın.

Sıvı tamamen geçtikten sonra, 150 mililitre yıkama tamponu iki ile yıkama işlemini tekrarlayın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde elüsyon tamponu ekleyip EIT'yi topladıktan sonra, EIT'den bir alikotu SDS-PAGE jeline yükleyerek M-V-P-M-G-M 1 0 1'in verimini ve saflığını belirleyin.

Jel akışı tamamlandıktan sonra Coomassie boyaması yapıldığında, yaklaşık 70 kilodalton ağırlığında belirgin bir tek bant görülmelidir. M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs içerisine 50 ünite precision protease ekleyin ve diyaliz tamponu içeren bir diyaliz tüpüne yerleştirin. Kesilme işleminin dört derece Celsius'ta gece boyunca gerçekleşmesine izin verin.

Daha önce olduğu gibi bir SDS page jeli çalıştırın. Kesim verimliliğini değerlendirmek için, tam bir kesim sırasıyla MVP ve MGM 1 0 1'e karşılık gelen 42 ve 28 kilodaltonluk iki bant oluşturmalıdır. Kesilmiş MVP MGM 1 0 1'i, BioRad biologic DUO flow FPLC sistemine bağlı bir bio scale mini macro prep high S kartuşuna çoklu enjeksiyonlar ile yükleyin.

Sodyum klorürün 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM ve 1000 mM değerlerinden oluşan basamaklı bir tuz gradyanı uygulayarak katyon değişim kromatografisine başlayın. Bu gradyan, tampon A ve tampon B karıştırılarak oluşturulur. Akış hızını 0,5 mL/dakika olarak ayarlayın. Fraksiyon toplayıcıda 2 mL'lik fraksiyonlar toplayın; MGM 1 0 1 tipik olarak 500 mM tuz konsantrasyonunda elüe olur.

MGM 1 0 1 piki için fraksiyonları birleştirin ve proteinin saflığını bir SDS-PAGE jelinde kontrol edin. Katyon değişim kromatografisinden elde edilen protein fraksiyonları birleştirilip GF denge tamponunda dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca diyalize edildikten sonra, MGM 1 0 1 piki yaklaşık 28 kilodaltonluk tek bir bant göstermelidir. Ardından, proteini konsantre etmek için proteini Aveva spin 15 R ultrafiltrasyon spin kolonuna aktarın ve dört derece santigrat sıcaklıkta 3000 ×g hızında santrifüjleyin.

Hacim yaklaşık bir mililitreye indirildiğinde, kromatografi tamponu ile dengelenmiş kalibre edilmiş bir supra six prep grade kolona MGM 1 0 1 yükleyin ve kromatografi tamponu ile dakikada 0,5 mililitre akış hızında boyut dışlama kromatografisini başlatın. Büyük oligomerik proteinler erken fraksiyonlarda, küçük proteinler ise geç fraksiyonlarda elüe olur. MGM 1 0 1 halkaları yaklaşık 400 Kilodalton değerinde elüe olur.

Saflaştırılmış MGM 1 0 1 piklerinin fraksiyonlarını bir fraksiyon toplayıcı kullanarak toplayın; proteinin nihai kalitesini kontrol etmek için fraksiyonlardan alınan alikotları %12'lik SDS-PAGE jeline yükleyin. Ardından, proteini Aveva ile konsantre edin. 4 °C'de 3000 ×g hızında santrifüjle altı kez çevirin.

Ardından, protein alikotlarını iki dakika boyunca sıvı azotta bekleterek mikro santrifüj tüplerinde hızlıca dondurun. Numuneleri eksi 80 °C'de 6 ila 12 ay boyunca saklayın. MGM 1 0 1 numunelerini, tek zincirli DNA bağlanma analizi ve transmisyon elektron mikroskobu ile yapısal görselleştirme için kullanın.

Elektroforetik mobilite kayması analizi sonuçları, saflaştırılmış MGM 1 0 1'in tek zincirli DNA'ya karşı güçlü bir bağlanma aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. Tek zincirli DNA probu, oligomerik MGM 1 0 1 tarafından doğal poliakrilamid jel kuyucuklarında giderek daha fazla tutulmaktadır.

M GM 1 0 1, 400 nanomolar'dan daha yüksek bir konsantrasyonda eklendiğinde. Bu elektron mikrografları, MGM 1 0 1'in yüksek dereceli yapısal organizasyonunu göstermektedir. Yeni hazırlanan M GM 1 0 1, negatif boyama transmisyon mikroskopisi ile ortaya çıkarılabilen, 20 nanometre çapında belirgin halkalar şeklinde bulunur.

Dört °C'de birkaç haftalık saklama süresinin ardından, MGM 1 0 1 supramoleküler helis filamanlar oluşturur. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra bir hafta içinde tamamlanabilir.

İzlediğiniz için teşekkürler.