Name: MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Öğrenin MBP etiketleme stratejisiyle maya mitokondriyal rekombinasyon proteini Mgm101'in hazırlanmasını. Bu yöntem, büyük oligomerik halkalar oluşturan bu proteini çözünür hale getirmek için kromatografi tekniklerini kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz transmisyon elektron mikroskobu için yardım Stephan Wilkens teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık Hibe R01AG023731 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Önceki çalışmalar Mgm101 ilk amino terminal kalıntıları 22 mitokondri 19 içine aldıktan sonra yarıldığı gösterilmiştir. Escherichia coli içinde ekspresyonu için, ilk 22 kodonları eksik MGM101 açık okuma çerçevesi PCR ile amplifiye edilir ve ekspresyon vektörü üretilmesinde ise pMAL-C2E değiştirilmiş bir versiyonu maltoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir erkek sekansının aşağı yerleştirilir. Bu PreScission proteaz (Şekil 3), bir ayrılma yeri içeren bir bağlayıcı ile MBP-füzyon Mgm101 oluşturur. Plazmid ilk olarak E. seçerek inşa IPTG ve Xgal beyaz / mavi seçim olmadan coli transformantlar. Elde edilen plazmid üretilmesinde ise pMAL-C2E-MGM101 sonra E. sokulur coli ampisilin ve kloramfenikol dirençli koloniler seçerek BL21-CodonPlus (DE3)-RIL süzün. 1. İfade, İndüksiyon, Hücre Lizis ve DNaz I Tedavi <ol><li> Inocglikoz (% 0.2), ampisilin (100 ug / ml) ve kloramfenikol (50 ug / ml) ile desteklenmiş LB vasatı içinde 10 ml (% 1 Bacto Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 1 NaCl) taze transformantlar ulate. 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° CO / K &#39;de inkübe edilir. </li><li> Yukarıdaki gibi desteklenmiş LB vasatı içinde 2 litre içine 10 ml ön-kültür inoküle. OD 600 0.5 ulaşıncaya kadar sallayarak ile 37 ° C hücreleri büyütün. </li><li> 0.3 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenerek MBP-Mgm101 füzyon proteininin ekspresyonunu. 5 saat 30 ° C&#39;de sallayarak hücreleri büyütün. </li><li> Bir Beckman JA-10 rotoru (5500 x g, 4 ° C, 10 dakika) kullanılarak santrifüj hücreleri toplamak. Atıldıktan sonra, süpernatan, proteaz inhibitörleri (25 uM löpeptin, 1 uM pepstatin A ve 1 mM PMSF) ihtiva eden liziz tamponu, 30 ml (20 mM Tris-HCI, pH 7.4 ve 1 mM EDTA, pH 7.4) içinde hücre pelletini. </li><li> 20 boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonu sonikasyonsn ultrasonik işlemci (Isı Sistemleri; Model W-385) kullanarak 50% görev döngüsü, 30 saniye boyunca buz üzerinde serin ve 2x tekrar sağlar. </li><li> 2 mg / ml &#39;de 1 DNAz stoklar 1 ml ilave edilir. 2 saat boyunca 4 ° C &#39;de hücre lizatı sallayın. </li><li> 500 mM&#39;lik bir son konsantrasyona NaCl ayarlayın. </li><li> 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de santrifüj ile hücre artıkları çıkarın. </li></ol> 2. Amiloz Affinity Kromatografi ile Arıtma <ol><li> Lizis tamponu içinde amiloz reçinesi (% 50 çamurlu) 1.5 ml dengelenmesi. Hücre lizatı ile dengelenmiş amiloz reçine ekleyin. 4 ° CO / N. de hafifçe sallayın </li><li> Soğuk bir odaya monte bir Econo-Kolon kromatografisi kolonuna lizat-reçine karışımı yükleyin. Ilişkisiz proteinler yerçekimi ile sütun geçmesine izin. </li><li> Yıkama tamponu I (, 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF, 20 mM Tris-HCI, pH 7.4) 300 mL &#39;si ile yıkayınız amiloz reçine. </li><li> II yıkama tamponu (20 mM T 150 mL &#39;si ile yıkama tekrarlayınRIS-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF). </li><li> Sütun, 4 &#39;de inkübe edilir 10 dakika boyunca ° C toplamak elüsyon tamponu, 5 ml (, 200 mM NaCI;, 1 mM EDTA, pH 7.4 ve 0.2 mM PMSF, 10 mM Maltoz, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile ekleme daha fazla kez eluat ve tekrar. </li><li> Eluatlar birleştirin, Coomassie boyama (Şekil 4) tarafından izlenen bir SDS-PAGE jeli üzerinde eluatın bir kısım yükleyerek MBP-Mgm101 verimini ve saflığını belirlemek. </li></ol> 3. PreScission proteaz bölünme ve Katyon Değişim Kromatografisi <ol><li> MBP-Mgm101 elüatına PreScission proteaz 50 adet ekleyin. 4 de bölünme ° CO / N yapın ve (20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 100 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF) bu diyaliz tampon maddesine karşı diyaliz süresince devam etmesine izin </li><li> Bir SDS-PAGE jel (Şekil 5A) üzerinde bölünme verimini kontrol edin. </li><li> Birden enjekte tarafından bölünmüş MBP-Mgm101 YükBio-Ölçek Mini Makro-Hazırlık Yüksek S kartuşu iyonları bir Bio-Rad Biyolojik Çift Geçişli FPLC sistemine bağlı. </li><li> Bir adım tuzu 5 mM gradyan, 300 mM, 500 mM, 750 mM ve karıştırma tampon A (5 mM NaCI ile oluşturulur NaCl 1.000 mm uygulayarak, katyon değişim kromatografisi başlangıç;, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF) ve Tampon B (1 M NaCI, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF). 0.5 ml / dak akış hızı. Mgm101 fraksiyonu toplamak ve bir SDS-PAGE jel (Şekil 5B), proteinin saflığı gösterir. </li></ol> 4. Boyut Dışlama Kromatografisi <ol><li> Katyon değişim kromatografisinden protein fraksiyonları bir araya getirin. (150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) GF dengeleme tamponu içinde protein Dialyze. </li><li> 4 ° C&#39;de 3000 xg&#39;de iplik ~ 1 ml hacmini azaltmak için Vivaspin 15R Ultrafiltrasyon spin kolon ile protein konsantre </li><li> Mgm101 o Yükna kromatografi tamponu (150 mM NaCI, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7.4, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) ile dengelenmiş bir Superpose 6 prep kolon dereceli olarak kalibre edilmiştir. </li><li> 0.5 ml / dak &#39;lık bir akış hızında çalışırlar kromatografi tamponu ile boyut dışlama başlatın. </li><li> Saflaştırılmış Mgm101 tepe fraksiyonlar toplayın. Protein nihai kalitesini kontrol etmek için, bir% 12 SDS-PAGE üzerinde fraksiyonların alikotları yerleştirin. </li><li> Vivaspin 6 ile protein konsantre, sonra hızlı bir şekilde -80 sıvı N2 ve mağaza örnekleri dondurmak ° C </li><li> SsDNA bağlayıcı analizi (Şekil 8) ve transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 9) ile yapısal görselleştirme için 6-12 ay içinde Mgm101 örnekleri kullanın. </li></ol>

<ol><li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMC1%3A+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination%2C+synaptonemal+complex+formation%2C+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li>
<li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li>
<li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li>
<li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li>
<li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li>
<li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Rad51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li>
<li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li>
<li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li>
<li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li>
<li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52%2C+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li>
<li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li>
<li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li>
<li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li>
<li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MGM101%2C+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li>
<li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li>
<li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li>
<li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mgm101.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li>
<li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li>
<li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

E. bir istikrarlı, yerli rekombinant Mgm101 proteini üretmek için bir meydan okuma olmuştur bakteri hücrelerinin kendi çözünürlükten muhtemelen nedeniyle coli. Bu raporda, MBP-füzyon stratejisi protein oldukça yüksek bir seviyede ifade edilmesini sağlar olduğunu göstermektedir. Negatif boyama transmisyon elektron mikroskopisi ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak, daha önce MBP-füzyon proteininin in vitro 18 üniform oligomerleri oluşturur göstermiştir. Bu Mgm101 bir ...

Homolog rekombinasyon çift iplikli sonları tamiri (DSBs) ve zincirler arası çapraz bağlar, ve çökmüş çoğaltma çatal 1 DNA replikasyon reinitiation için önemlidir. Geleneksel homolog rekombinasyon, merkez reaksiyon Prokaryotlarda RecA ve RAD51 ve 1-3 ökaryotlarda Dmc1 da dahil olmak üzere, ATP-bağımlı rekombinaz tarafından katalize edilir. Bu rekombinaz dubleks DNA şablonları (Şekil 1, sol panel) 4-7 içinde homoloji arama ve iplikçik işgali başlatmak için gerekli olan ssDNA, üzerinde nükleoprotein filamentler oluştururlar. Geleneksel programına ilave olarak, aynı zamanda, bir homolog rekombinasyon RecA/Rad51-independent şekilde (Şekil 1, sağ panel) içerisinde yer alabilir. Örneğin, maya Rad52 ve Rad59 proteinler doğrudan dsDNA tatili geriden kestirmeye tarafından sunulan tamamlayıcı ssDNA ipliklerini tavlama katalize edebilir. Şarkı olarak bilinen bu rekombinasyon işlemi,le iplikçik tavlama, genellikle homolog dsDNA şablonları ile eşleştirme anlamına gelmez. Tavlama işleminden sonra, heterolog kuyrukları exonucleases ile çıkarılır ve çentikler genom süreklilik 8-10 geri ligate edilir. Tek tel çekme mekanizması ile tamir genellikle doğrudan tekrar bölgeleri arasında genom dizilerinin silinmesi eşlik eder. Rad52 bakteriyofajlar 11 arasında yaygın olan rekombinasyon proteinlerin çeşitli bir grup aittir. Bu proteinler aynı zamanda, homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik etmedeki aktiviteleri göre, tek tel çekme Proteinleri (SSAPs) olarak bilinir. En iyi karakterize bakteriyofaj SSAPs Redβ ve laktokokkal faj ul36 gelen profajının rac ve Sak protein bakteriyofajlar λ ve P22, rect gelen Erf vardır. Benzerlik neredeyse undetect rağmen SSAPs yapısal olarak, tipik bir β-β-β-α kat ile karakterize edilirbirincil dizileri mümkün. 10 Onlar tüm form büyük homo-oligomerik halkaları - in vitro 12-14 14 kat simetri. Bu özelliği yüksek mertebeden yapısal organizasyonun fonksiyonel etkileri iyi anlaşılmış değildir. Biz mitokondriyal genom homolog rekombinasyon mekanizması anlamada ilgilendi. Daha önce, Saccharomyces cerevisiae 15 mtDNA bakımı için gerekli olan MGM101 gen tanımlanmıştır. MGM101 sonradan mitokondriyal nukleoidler ile ilişkili olduğu bulunmuştur ve DNA&#39;ya zarar veren ajanlara mtDNA tolerans 16 için gereklidir. Ancak, Mgm101 çalışma rekombinant Mgm101 üretmek için zorluk tarafından son on yılda geri gerçekleştirildi. Biz son zamanlarda E. büyük miktarlarda çözünür Mgm101 üretiminde başardı MBP-füzyon strateji kullanarak coli. Bu bize Mgm101 hisse göstermek sağladıprotein 17,18 en Rad52 aile ile biyokimyasal ve yapısal benzerlikler. Bu raporda, üç aşamalı bir saflaştırma prosedürü homojen Mgm101for biyokimyasal ve yapısal analizleri (Şekil 2) üretir, tarif edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>İfade vektörü pMAL-c2E</td><td>New England Biolabs</td><td>#N8066S</td><td></td></tr><tr><td>PreScission Proteaz</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td> <td># 27-0843-01</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3) -RIL hücreleri</td><td>Strategene</td> <td># 230245</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td> <td># 11034626001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td> <td># 11359053001</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td><td>Roche Uygulamalı Bilim</td><td>#10837091001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>#DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil &#946;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td> <td>#11411446001</td><td></td></tr><tr><td>Amiloz reçinesi</td><td>New England Biolabs</td><td>#E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Ekono-Sütun kromatografi sütunu</td><td>BIO-RAD</td><td>#7372512</td> Biyo-Ölçekli Mini Makro Hazırlık Yüksek S kartuş (1 ml)BIO-RAD#732-4130 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 15R Ultrafiltrasyon spin sütunu (10.000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td><td>#VS15RH02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 hazırlık sınıfı sütunu</td><td>Amersham Bioscirnces</td><td>#17-0489-01</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 6 Ultrafiltrasyon spin sütunu (5.000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td><td></td><td></td>#VS0611</tr></tbody></table>

mbp tabanlı etiketleme stratejisi mgm101 rekombinasyon protein hazırlanması

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

MGM101 gen mitokondriyal DNA bakım rolü için 20 yıl önce tespit edilmiştir. Çeşitli gruplardan çalışmalar Mgm101 protein mitokondriyal DNA recombinational onarım dahil olduğunu ileri sürmüşlerdir. Son araştırmalar Mgm101 Rad52 tipi rekombinasyon protein aile ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu proteinler, büyük oligomerik halkaları oluşturmak ve homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik eder. Bununla birlikte, Mgm101 karakterizasyonu, rekombinant proteinin üretiminde sekteye edilmiştir. Burada, rekombinant Mgm101 hazırlanması için bir güvenilir bir yöntem tarif edilmektedir. Maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketli Mgm101 olanlar, Escherichia coli içinde ifade edilir. Füzyon proteini, başlangıçta amiloz afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Proteolitik bölünme ile serbest bırakıldıktan sonra, Mgm101 katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrılır. Monodispers Mgm101 daha sonra elde edilirboyut dışlama kromatografisi ile. Bakteri kültürü litre başına Mgm101 bir ~ 0.87 mg verim rutin elde olabilir. Rekombinant DNA Mgm101 asgari kirlenme vardır. Hazırlanan numunelerin başarıyla Mgm101 biyokimyasal, yapısal ve tek bir parçacık resim analizleri için kullanılır. Bu protokol, aynı zamanda yanlış katlanmış ve bakteri hücreleri için toksik olabilir diğer büyük oligomerik DNA bağlayıcı proteinlerin hazırlanması için kullanılabilir.

Mgm101 mitokondri bir Rad52 ilgili rekombinasyon proteindir. Rad52 yoğun mitokondriyal DNA rekombinasyon (Şekil 1) rolü için incelenmiştir. Rekombinant Mgm101 üç aşamalı bir prosedür (Şekil 2) ile hazırlanabilir. Bu Mgm101 çözünür bir biçimde ifade edilir ve daha sonra (Şekil 3) proteolitik bölünme ile etiketinden açığa çıkmasına izin veren MBP-etiketleme stratejisinin kullanımı ile kolaylaştırılır. Tipik bir preparat olarak, MBP-füzyon Mgm1...

Maya mitokondriyal nükleoit proteini Mgm101, büyük oligomerik halkalar oluşturan bir Rad52 tipi rekombinasyon proteindir. Bir protokol, maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketleme katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte stratejisi kullanılarak çözülebilir rekombinant Mgm101 hazırlamak için tarif edilmektedir.

MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Bu prosedürün genel amacı, maltoz bağlayıcı protein veya MBP etiketleme stratejisini kullanarak MGM 1 0 1 gibi büyük oligomerik, DNA bağlayıcı proteinler hazırlamaktır. Bu işlem, önce MGM 1 0 1 açık okuma çerçevesinin, e coli'de ekspresyon için PMLC two E vektöründeki MBP'nin aşağı akımına klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, M-V-P-M-G-M 1 0 1 füzyon proteini, AMLO afinite kromatografisi ile e coli'den saflaştırılır.Ardından MGM 1 0 1, proteolitik kesim yoluyla MVP'den serbest bırakılır ve katyon değişim kromatografisi ile MVP'den ayrılır. Son olarak, MGM 1 0 1 halkaları boyut dışlama kromatografisi ile homojenliğe kadar saflaştırılır. Nihayetinde, yaklaşık 0.8 miligram çözünür MGM 1 0 1 elde edilir.Bir litre bakteriyel kültürden elde edilen protein, mitokondrilerde DNA onarımı için önemli olan bu proteinin biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için kullanılabilir. MGM 1 0 1'in malt bağlayıcı protein etiketli versiyonunu kullanmanın temel avantajı, bu versiyonun etiketlenmemiş versiyona göre daha az toksik, daha çözünür ve daha stabil olmasıdır. Sonuç olarak, e coli içerisinde doğal MGM 1 0 1 proteininin yüksek düzeyde ekspresyonunu sağlayabiliyoruz.Merhaba, benim adım Sar

preparation-mgm101-recombination-protein-mbp-based-tagging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem...

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir.  Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Bu rapor, özellikle memeli hücrelerinde hedef genlerin eklenmesini düzenleyen yeni Yapay Ekleme faktörler (ASFS) tasarım ve yapı için biyoteknolojik yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem ayrıca, RNA metabolizması diğer yönlerini işlemek için çeşitli yapay faktörleri mühendisi genişletilebilir.

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Bu makale, nöroblastom zebra balığı modelinde, özellikle kendiliğinden metastaz geliştiren MYCN ve LMO1'in aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı hattında tümör metastazını gerçek zamanlı olarak geliştirme, karakterize etme ve izleme yöntemini tanıtır.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Charles Taylor ve John Marshall nüfus değiştirme stratejisinin etkinliğini değerlendirmek için matematiksel modelleme yardımcı açıklar. Insight hesaplama modelleri hakkında bilgi sivrisinek nüfus dinamikleri ve A. gambiae alttür ile transposable elementlerin yayılmasını sağlayabilir nasıl içine verilir. Vahşi genetiği değiştirilmiş sivrisinekler serbest etik hususlar ele alınmıştır.

Matematiksel Modelleme Nüfus Yedek Strateji Etkinliği tahmin

Öğrenin MBP etiketleme stratejisiyle maya mitokondriyal rekombinasyon proteini Mgm101'in hazırlanmasını. Bu yöntem, büyük oligomerik halkalar oluşturan bu proteini çözünür hale getirmek için kromatografi tekniklerini kullanır.

MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

Daha fazla video keşfet