Name: Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Öğrenin, adenoviral iletim kullanarak naif CD4 T hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle etme yöntemini. Bu teknik, Treg farklılaşması öncesinde erken moleküler olayları incelemek için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar tespit protokolünün sağlanması için pCAGAdDU vektör ve Oliver Gorka oluşturmak için Lirui Du teşekkür etmek istiyorum.

1. Girdi Vektör içine İlgi Çekici Gen Klonlanması <ol><li> Bir giriş vektörü, ilgi konusu gen klonlama. Bir topoizomeraz çiftli vektör (örneğin pentr / D-TOPO) veya kısıtlama enzim aracılı klonlama bu işlem için kullanılabilir içine kör uç ligasyonu ile takip geninin PCR amplifikasyonu. </li></ol> 2. PCAGAdDu hedef vektörü içine, ilgi konusu gen aktarma <ol><li> LR rekombinasyon (örneğin Ağ Geçidi LR Clonase II enzim Mix) tarafından hedef vektör girmesinden vektör ilgi gen aktarın. Bu adenovirüs ekspresyon vektörü (Şekil 1) oluşturur. </li><li> , Bir Paci restriksiyon sindirimi içinde adenoviral sentezleme vektörü 10 ug linearize DNA hızlandırabilir ve 100 ul başına 3 ug &#39;lik bir konsantrasyonda su içinde süspansiyon haline getirin. Doğrusallaştırma v çoğaltma ve encapsidation için gerekli olan viral ters tekrarlar (Re), açığaVirüs partiküllerinin içine Iral DNA yapısı. </li></ol> 3. Birincil Virüs Lizat üretimi <ol><li> Tohum 1 x 6-plaka de bir 2 ml hücre kültür ortamı içinde 10 5 HEK293A hücreleri (DMEM,% 10 FBS,% 5 PenStrep) ve 6 için hücre inkübe - 37 ° 14 saat, bir% 10 ° C CO 2 inkübatör onlara uymak için izin vermek. Daha sonra hücreler konfluense yaklaşık olarak en az% 50 olmalıdır. </li><li> Lipofeksiyon: Transferi NaCl 50 mcM, vorteks kısaca 94 ul içine jetPEI reaktif 6 ul. Vorteks 100 ul doğrusallaştırılmış adenovirüs vektörüne karışık çözelti eklenir ve 15 için transfeksiyon karışımı inkübe - oda sıcaklığında 30 dak. </li></ol> Adenovirüs enfeksiyonu için uygun biyogüvenlik koşulları altında aşağıdaki adımları uygulayın! <ol start="3"><li> HEK293A hücre içeren iyi üzerinde damla damla çözüm koyun ve 37 hücreleri inkübe ° C ve% 10 CO 2. Flöresanlı bir işaretleyici kullanırken, transfe değerlendirmekgörsel 12&#39;den sonra ction verimliliği - ters bir floresan mikroskop kullanılarak 36 saat. Taze ortam içinde 0.5 ml 3 günde ekleyin. </li><li> Ayırmak başlar genişlemiş ve yuvarlak hücreler ile alanlardır sitopatik etkileri (CPE), bir ışık veya floresan mikroskop ile 3 gün - her 2 kontrol edin. Bu, etkili bir virüs üretimi göstergesidir. CPE daha geniş bölgeleri (Şekil 3) ortaya çıkması üzerine, bu 24 alacak - 72 saat tüm hücreleri enfekte önce. </li><li> Tüm hücreleri CPE belirtileri gösteriyor, ancak hücrelerin genel bir dekolmanı meydana gelmeden önce, süpernatant ile Nazik pipetleme ve transfer hücreleri (SN, 3 - 5 ml) ile hücreleri ayırmak zaman 15 ml polistiren tüp. </li><li> 15 kuru buz üzerinde SN hücreleri Freeze - 20 dakika ve kopma hücrelere ° C daha sonra 37 hızlı bir şekilde çözülme. Bu donma-ve-çözülme döngüsü (F / TC) iki kez daha tekrarlayın. Bir gün içinde kullanım için buz üzerinde birincil virüs lizat tutun veya -80 ° C uzun süreli depolama için dondurma. Her türlü ilave F/ TC 30, virüsün titresi azaltacaktır - 50%. </li></ol> 4. Virüs Amplifikasyon <ol><li> Tohum ve 14 cm doku kültürü çanak% 90 izdiham HEK293A hücreleri büyür. </li><li> Birincil virüs lizatı (1,5-2,5 mL) yarısı ile hücreleri enfekte edebilir ve en az 36 saat boyunca hücrelerin inkübe. Hemen hemen bütün hücrelerin floresans mikroskobu ile tespit edilebilir, daha sonra enfekte edilmelidir. Zaten (daha konsantre yani) amplifiye virüs stokunun yeniden güçlendirme için, 50 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) (6.3) de HEK293A enfekte. </li><li> Hepsi CPE gösterir ama dekolmanı önce zaman Hücreler hasat edilmelidir. Verimli virüs üretimi ile bu durum enfeksiyondan sonra 48 saat içinde ulaşılır. (Bu bir hafta kadar sürerse, 4.2 açıklanan enfeksiyon için kullanılan adenovirüs stok miktarını artırarak amplifikasyon bir tur düşünün.) </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp polistiren için nazik pipetleme ve transfer hücreleri ve SN hücreleri ayırmak. 4 10 dakika ° C için 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin </li><li> SN çıkarın ve orta veya Sn (yaklaşık 1 mi) arasında uygun bir hacimde pelletini. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve bozmaya 3 K / TC gerçekleştirme (Konsantre virüs lizat yani) virüs partikülleri içeren SN çıkarmak ve kısım virüs lizat -80 saklayın ° C </li></ol> 5. Virüs titresi Belirlenmesi <ol><li> Tohum 10 5 A549 hücre başına kuyuya 1 ml orta ve hücreler 6 saat uymak izin bir 12 plaka 5 kuyu. </li><li> Ortam içinde bir seri dilüsyon (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) yapmak ve oyuk başına 10 ul kadar konsantre edildi adenovirüs (buz üzerinde çözündürüldü) 1 ul kullanımı. Akım sitometri olarak yolluk ayarlamak için bir de bulaşmamış bırakın. </li><li> 36 saat sonra, PBS ve ayırmak hücreleri (örneğin trypsinization tarafından) ile yıkayın, SN çıkarmak. Biohazard önlemler için, bu c düzeltmek için tavsiye edilir10 dakika oda sıcaklığında ve bir kez PBS ile yıkama için 100 ul PBS içinde% 4 paraformaldehid arşın. </li><li> Enfeksiyon işaretleyici ifade FACS analizi yapın. Arsa enfekte hücrelerin mutlak sayısı (Şekil 4) karşı &#39;ul viral lizat Seç&#39;. Enfeksiyon doğrusal aralığı belirlemek ve x = 1.000 ul kullanarak lineer aralığında standart eğriden sulandırılmamış virüs ml&#39;si başına titreyi hesaplamak. </li></ol> 6. T Hücre Enfeksiyon <ol><li> Den dinlenme / naif CD4 T hücreleri izole DO11.10 tg; MACS (Naif CD4 + T hücre izolasyonu Seti II) veya FACS sıralama kullanarak CARΔ1 tg fareler (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> Küçük ölçekli deneyler için, bir 96-gözenekli yuvarlak tabanlı bir plaka içine iyi bir MOI 50 elde etmek için viral lizat uygun bir hacmi pipetle. </li><li> T hücre ortamı içinde 50 ul son hacim enfeksiyonu (RPMI1640,% 10 FBS,% 5 PenStrep,% 5 NaPyruvate, 1x NEAA, 1x gerekli MEM içinde 4 x 10 5 T hücre ile toplayınvitamini, 1x L-glutamin, 1:250,000 merkaptoetanol, 10 mM HEPES). Örnek: Bir İçişleri Bakanlığı 50 3 x 10 5 T hücreleri enfekte için kullanılır; viral titresi, 3 x 10 ml 9 -1 Virüs hacmi = İçişleri Bakanlığı x T / hücre sayısı / viral titresi = 50 x (3 x 10 5) (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml </li></ol> Not: gevşek fincan (tüp başına tp 3 ml kadar) bir polistiren tüp içinde 10 6 naif T hücreleri başına 165 ul bir enfeksiyon hacminde bir İçişleri Bakanlığı 50 kullanılarak daha büyük hücre sayıları, ölçek enfeksiyon için. <ol start="4"><li> % 5 CO2 kuluçka makinesinde 37 ° C &#39;de 90 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak. </li></ol> (İsteğe bağlı: hücreleri daha etkin virüs kaldırmak için tekrar yıkanabilir) <ol start="6"><li> Tekrar süspansiyon hücreleri200 ul T hücresi uyarıcı antikor olmayan ve IL-2 veya başka bir sitokin olmadan, orta ve 37 ° C&#39;de 40 saat boyunca dinlenmeye bir% 5 CO2 inkübatöründe ° C aktivasyonundan önce, ilgi konusu gen ekspresyonunu sağlamak için. </li></ol> 7. T Hücre Aktivasyon ve Polarizasyon <ol><li> Bir hacim, anti-CD3-ve küçük bir kap içine reaktif hücre sayısı (örneğin, 4 x 10 5) karşılık gelen bir anti-CD28 çiftli boncuk Pipet, PBS 10 kat hacim ekleyin ve 2 dakika için bir mıknatıs üzerine koyun . Süpernatantı alın ve 200 ul ortam içinde polarize boncuklar (Treg: T hücre ortamı + 1 ng / ml &#39;TGFβ, 100 U / ml IL-2) tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> Not: Hücreler aynı zamanda, anti-CD28 ve anti-CD3 antikorları ile kaplı doku kültür kaplarında kullanılarak aktive edilebilir, ya da ovalbumin 323-339 peptit antijen ile doldurulan ışınlanmış BALB / c splenositleri kullanılarak DO11.10 T hücre reseptör-özgül. <ol start="2"><li> Centrifuge daha önce olduğu gibi hücreleri dinlenmiş, 200 içeren ul polarize orta anti-CD3-ve anti-CD28-antikor birleştiğinde boncuk SN ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. Orta değiştirmeden% 5 CO 2 inkübatör 37 ° C de 72 saat inkübe edin. </li></ol> 8. T Hücre Sabitleme ve Sitometrisi için Boyama <ol><li> Hücreleri yıkayın: Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak. Buna göre tüm aşağıdaki yıkama adımları uygulayın. </li><li> 100 ul tamir edilebilir ölü hücre boyama çözeltisi içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve 4 de 30 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> Hücre yıkayın, 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon, PBS, oda sıcaklığında inkübe edin, 15 dakika içinde 100 ul% 4 paraformaldehid ekleyin. </li><li> Yıkama hücreleri, PBS içinde 200 ul buz gibi soğuk bir% 70 metanol içinde onları tekrar süspansiyon ve buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Hücreler biyolojik tehlike önlem olmadan şu andan itibaren tedavi edilebilir!<ol start="5"><li> 60 ul ana-karışımı 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc bloğu (spesifik olmayan bağlanma bloke etmek için anti-FCR3). Hazırlanması Yıkama hücreleri, PBS + anti-FCR3 40 ul bunları tekrar süspansiyon ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 20 ul ekleyin PBS + anti-FCR3 1 mg PE-birleştiğinde anti-Foxp3 antikoru içeren, ° C gece boyunca 4 de iyice karıştırın ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> PBS içinde iki kez hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde hücreleri analiz. </li></ol>

<ol><li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li>
<li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li>
<li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li>
<li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li>
<li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li>
<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Peripheral+CD4%2BCD25-+Naive+T+Cells+to+CD4%2BCD25%2B+Regulatory+T+Cells+by+TGF-%CE%B2+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li>
<li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314(2012).</li>
<li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+%28TCR%29+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li>
<li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+%28MEA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415(2012).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307(2010).</li>
<li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li>
<li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+expression+of+the+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li>
<li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4(2002).</li>
<li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li>
<li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+structural%2C+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li>
<li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li>
<li>Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li>
<li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+bic%2FmicroRNA-155+for+Normal+Immune+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li>
<li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Dicer+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li>
<li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%CE%B3+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Virüs Üretimi ve Titrasyon En iyi sonuçları elde etmek için transfeksiyon, Doğrusallaştırılmış vektör kalitesi ve miktarı en önemli görünmektedir. Enfeksiyon hızla bir kez verimli virüs üretimi oluşur devam edecek beri kültürün bir başlangıç ​​büyüme primer lizat üretim üzerinde olumsuz etkileri gözlenmedi. Ancak, HEK293A hücreler tarafından virüs üretimi verimliliği azaltmak uzun ekler etkilenebilir. Bazı açık okuma çerçeveleri aslında virüs üretimini engelleyebilir bulunmuştur. Bu viral stokl...

Tregs immün tolerans korumak ve aşılmaz bağışıklık yanıtları kırmak için çok önemlidir. Tregs seyirci T hücre aktivasyonu bastırmak. Sonuç olarak, Tregs ablasyon aktive T hücreleri 1 ile tahrik ölümcül otoimmünite ve kendi kendini yok yol açar. Tregs CD4 tek pozitif öncüleri olumsuz seçimi sırasında timus gelişebilir, ama onlar da optimal ortak stimülasyon 1,2 ile düşük doz antijen stimülasyonu üzerine naif CD4 T hücreleri çevre içinde ayırt edebilirsiniz. Periferik Tregs bağırsak ve akciğer hoşgörü sağlayan suçlanmıştır ise timik Tregs, kendini antijenlere karşı doku otoimmünite bastırmak gibi görünüyor. Bu bağlı Tregs kuvvetli gıda ve hava, ortakçı bakteri ve alerjenleri 3,4 çevresel antijenleri dahil olmak üzere mukozada yabancı antijenleri, tanınması sonra T hücre aktivasyonu engeller. Buna ek olarak, Tregs fetal peptidler için anne toleransı 5 kurmak ve önceden için çok önemlihavalandırma graft-versus-host hastalığı 6. Aynı zamanda, aynı zamanda 7,8 Tregs tümör hücrelerinin immün gözetim alçaltarak istenmeyen etkilere aracılık eder. Tregs damgasını özelliği alt-belirterek transkripsiyon faktörü Foxp3, gerekli ve fonksiyon 9,10 Treg görüşmek için yeterli bir çatal başlı etki alanı içeren transkripsiyon faktörü ifadesidir. Foxp3 ifade neden bazı sinyal yolları bilinmektedir. Bununla birlikte, kontrol, düzenler ya da tetikleyici T hücresi reseptörüne tepki olarak farklılaşma Treg modüle ettiğini moleküler süreçlerin daha iyi anlaşılmıştır. Tregs çok etkili TGFβ ve IL-2, 11 varlığında, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile naif CD4 + T hücrelerinin uyarılması ile in vitro olarak uyarılabilir. Gelişmekte olan Tregs in vivo, Treg farklılaşma teşvik moleküllerin manipülasyon fonksiyonel olduğu gibi gelecekte therapi için büyük bir potansiyel taşımaktadıres, örneğin, astım, Crohn hastalığı, transplantasyon ve 11,12. Tersine, Treg farklılaşma engellemek için moleküllerin tedavi modülasyonu tümör hastaların kombine tedavi gelecekteki yaklaşımlar fayda sağlayabilir. In vitro farklılaşma tayinlerde T hücre alt farklılaşma ile ilişkili moleküler değişikliklerin açıklaması için vesile olmuştur. Şu anda, ara ya da kontrol T hücre farklılaşmasını ektopik gen ifadesinin en yaygın yöntemler naif T-hücrelerinde başarısız olması nedeniyle engellenmektedir bu gen ürünlerinin taranması için deneysel çalışır. Örneğin, elektroporasyon ve retroviral transdüksiyon aktive edilmiş T-hücrelerinde etkilidir. Ilk beklentileri, dinlenme hücreler tipik olarak etkilidir lentiviral transdüksiyon, aksine, sitokinler 13 tarafından naif T hücrelerinin ön aktivasyon gerektirir. Ayrıca, elektroporasyon sırasında cDNA veya mRNA &#39;devrikendisi T hücre aktivasyonunun özellikleri kazandırır ve hatta Ca2 + sinyali harekete geçirebilir plazma zar, depolarizasyon içerir ve NFAT proteinler (yayınlanmamış gözlem ve ref. 14) etkinleştirin. 40 saat - Benzer şekilde, retroviral transdüksiyon için, naif T hücreleri 18 için aktif olmak zorunda. Bu süre boyunca, hücre bölünmesi sırasında nükleer membran arıza meydana ve retroviral vektör 15&#39;in sonraki genomik entegrasyon için izin verir. Bu yöntemler bu nedenle yardımcı T hücre farklılaşmasının belirleyici aşamasıdır antijen ile ilk T hücre karşılaşma erken moleküler düzenleme ele mümkün değildir. Adenoviral transdüksiyon, insan adenovirüs Coxsackie reseptörü (CAR) ifade, insan hücre tipleri arasında bir dizi geçici ektopik gen ekspresyonunu vermek bilinmektedir. Bu hücre aktivasyonu ya da hücre döngüsü ilerlemesi için gerek kalmadan devam eder. C yüzey ekspresyonuAR etkili bir virüs bağlanma ve içselleştirilmesi için gerekli olan ve bir T hücre-spesifik promotör altında kesilmiş versiyonunu CARΔ1 transgenik ekspresyonu adenoviral enfeksiyon 16 ile duyarlı bir fare timositleri ve T hücre oluşturmak bulunmuştur. Önemli olarak, transgen timosit gelişimi değiştirmeyen veya naif CD4 in vitro farklılaşma, farklı alt-grup halinde hücreleri (veriler gösterilmemiştir; ref 17.) T. T hücrelerinin Adenovirüs aracılı transdüksiyon önce yaklaşımlar 19,20 aşırı 17,18 için kullanılan ve knock-down oldu. Transgenik T hücreleri ticari olarak temin DO11.10 TG arıtılabilir; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ref 17).. Önemli olarak, Adeno transdüksiyon aktivasyon belirgin belirtileri neden olmadan naif T-hücrelerinde, bir ilgi geninin yüksek sağlar. T hücreleri naif kalır (CD44 düşük, CD62L yüksek) ve dinlenme (CD25 -, CD69 -) sonra enfeksiyonuve enfekte olmayan hücrelere benzer Treg içine aktif ve ayırt edilebilir. Rekombinant adenovirüsleri üretimi adenoviral plazmidi (Şekil 1) ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra elde edilebilir. Bu plazmid genellikle çoğaltma-beceriksiz rekombinant adenovirüs 21 işlemek için silinir E1 ve E3 genleri ile insan tipi 5 adenovirüs genomu içerir. Onlar makaslanmış adenovirüs 22 istikrarlı entegrasyonu ile ölümsüzleştirdi edilmiş olarak HEK293A hücre çoğaltma eksikliği tamamlıyor. Adenoviral vektörlerin büyük (~ 40 kb) ve dolayısıyla iyi geleneksel kısıtlama enzim aracılı klonlama için uygun olmadığı için, biz Ağ Geçidi sistemi istihdam. İlgi konusu genin başlangıçta kolaylıkla lambda Rekombinasyon reaksiyonu (LR) 23 yoluyla hedef adenoviral vektörü içine transfer edilebilir daha küçük bir giriş vektörü içine klonlanır. Biz pCAGAdDu vektör inşaprokaryotik ccdb seçim işaretleyici 24 yan LR siteleri içeren bir ekspresyon kaseti ile CAG promoteri (tavuk aktin promotörü ve CMV artırıcı) birleştirerek. Bu ifade kaseti, büyükbaş hayvan büyüme hormonu poli (A) sinyal içeren bir diziye kaynaşmış olan ökaryotik enfeksiyon marker gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) arasında ekspresyonuna izin veren bir dahili ribozom giriş bölgesi (IRES) öğesi için eritilerek birleştirilir. Prototipik CMV promoteri yüksek aktivasyon bağımlı ve naif T hücrelerinde gen ekspresyonu için bu nedenle elverişsiz olduğu bulunmuştur beri, CAG cis-düzenleyici sekanslar seçtik. Burada, in vitro Treg farklılaşmasında etkili bir protokol ve etkinleştirme (Şekil 2) olmadan naif CD4 + T hücrelerinin transdüksiyonu için bir yöntem sağlar. Yöntemi ektopik gen ekspresyonu sağlayan ya da naif devlet önceki CD4 T hücre farklılaşması yıkmak. Bir overexpresse etkisini test edilmesine olanak sağlarT hücre alt bağlılık kadar ilk TCR uyarılması üzerine erken sinyal olaylar sırasında ilgi d gen. Bizim doğrulama deneyleri de Th2 gibi Th1 gibi diğer T hücre alt grupları, TH9, Th17, Th22 veya TFH hücrelerin farklılaşması benzer adenovirüs uygulama kurmak için temel sağlar.

<table><tbody><tr><td>pENTR/D-TOPO Klonlama Kiti</td><td>İnvitrojen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim karışımı</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus transfeksiyon</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A Hücre Hattı</td><td>İnvitrojen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>14 cm doku kültürü kabı</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta; 1) 1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Model Nr. 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naif CD4 + T Hücre İzolasyon Kiti II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPiruvat</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel vitamin karışımı (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Genişletme ve Aktivasyon için Dynabeads Fare T-Aktivatör CD3 / CD28</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TGF-beta 1</td><td>R & D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>Fare BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare/Sıçan Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Testi</td><td>Roche Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td></td>4427975</tr><tr><td>LightCycler 480 Probları Master</td><td>Roche Uygulamalı Biyosistemler</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Roche Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

naif cd4 adenoviral İletimi treg farklılaşma eğitim hücreler t

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Düzenleyici T hücreleri (Tregs) kendini hem de bazı yabancı antijenlere karşı bağışıklık dayanıklılık sağlamak için gereklidir. Tregs TGFβ ve IL-2 varlığında TCR-ve ko-stimülasyonu ile in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden elde edilebilir. Bu, gelecekteki tedaviler için büyük bir potansiyel taşıyan, ancak, moleküller ve sinyal yolları kontrol farklılaşma büyük ölçüde bilinmemektedir olduğunu. Primer T hücrelerinde ektopik gen ifadesi yoluyla manipüle, ancak yaygın yöntemler primer antijen tanıma önce, T hücresinin en önemli naif durumuna hedef başarısız olabilir. Burada, Treg farklılaşma oluşturulmadan önce in vitro naif CD4 T hücrelerinde ektopik genleri ifade etmek için bir protokol sağlar. Bu çoğaltma eksikliği adenovirüs ile iletim yapar ve onun üretim ve üretim açıklar. Adenovirüs büyük ekler (en fazla 7 kb) kadar sürebilir ve yüksek ve geçici Hsplm ulaşmak için rehberleri ile donatılmış olabilirT hücrelerinde yansıması. Bir transgenik Coxsackie adenovirüs reseptör (SYR) ifade ise etkili naif fare T hücreleri transduces. Önemlisi, enfeksiyon sonrası T hücreleri naif kalır (CD44 düşük, CD62L yüksek) ve dinlenme (CD25 -, CD69 -) ve Tregs içine enfekte olmayan hücrelere benzer aktif ve ayırt edilebilir. Bu yüzden, bu yöntem, en başından beri CD4 T hücre farklılaşmasının manipülasyon sağlar. Bu ilk TCR stimülasyon erken sinyal olaylar sonunda farklılaşma Treg içine kurşun hücresel değişiklikler neden zaman bu ektopik gen ifadesinin yer zaten olmasını sağlar.

Virüs Üretim Yüksek virüs titreleri üretimi için, birincil virüs üretimi veya virüs amplifikasyon HEK293A hücre hasat zamanlaması çok önemlidir. Virüs üretim görsel işaretleri ile Örnek fluoresan ve faz kontrast görüntüleri Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. CPE 10 gün parçası olmayan bir kontrol pCAGAdDu vektörü ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra gözlenmiştir. CPE enfeksiyon işaretleyici GFP yüksek ifade ayırmak ve sergilemeye başlar genişlemiş ve yuvarlak-up hü...

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz sağlar<em&gt; In vitro</em&gt;.

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Bu protokol, hedef bir genin naif T hücrelerine transduksiyonu için kullanılan, transgenin atopik ekspresyonu sonrası bu hücrelerin düzenleyici T hücrelerine veya treg'lere farklılaşmasını sağlayan enfeksiyöz adenoviral partiküllerin üretimine yönelik bir iş akışı sunmaktadır. İlk olarak hedef gen, adenoviral hedef vektöre klonlanır. Ardından vektör, adenovirus üretici hücre hattı olan HC 2 93 A'ya aktarılır ve enfeksiyöz adenoviral partiküller üretilir.Elde edilen virüsler, enfeksiyondan sonra farelerden alınan naif T hücrelerini bir adenovirüs reseptör transgeni ile enfekte etmek için kullanılır. Ardından, ilgili genin ekspresyonunu sağlamak için hücreler dinlendirilir. Naif T hücrelerinde, treg diferansiyasyonunu indüklemek için T hücreleri polarize edici koşullarda aktive edilir.Ardından hücreler, akış sitometrik analiz için fikse edilir ve boyanır. Nihayetinde, aşırı ifade edilen ilgili genin etkileyebileceği treg farklılaşma belirteci Fox P three ve enfeksiyon belirteci GFP'nin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, retroviral gen transduksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, naif T hücrelerinde ilgili bir genin aşırı ifadesine olanak tanımasıdır.Bu durum, T-hücre aktivasyonu anında yüksek düzeyde aşırı ekspresyon oluşmasını sağlar. Bu yöntem, düzenleyici T-hücresi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, T-Rex hücresi kimliğinin oluşumunun temelini oluşturan transkripsiyon sonrası gen düzenlemesi hakkında sorulara yanıt verebilir.Bu protokole, ilgili geni bir giriş vektörüne klonlayarak başlayın. PCR ile amplifiye edilen ilgili gen küt uçludur ve topoizomeraz bağlı P enter D topo vektörüne ligase edilir. Ardından ilgili gen, LR Rekombinasyonu yoluyla P kakadu hedef vektörüne aktarılır.Enfeksiyon belirteçli bir adenoviral ekspresyon vektörü oluşturmak için adenoviral genleri ve ardından bir internal ribozomal giriş alanı veya iris ile GFP'nin açık okuma çerçevesini içerir. Ardından, adenoviral ekspresyon vektörünün 10 µg'ı lineerize edilir. Bir PAC tek kısıtlama enzim sindiriminde, DNA çöktürülür ve 100 µL'de üç µg konsantrasyonda suyla yeniden süspande edilir.Lineerleştirme, viral DNA'nın replikasyonu ve virüs partikülleri içine enkapsülasyonu için gerekli olan viral ters tekrarları veya ITR'yi serbest bırakır. Aşağıdaki tüm adımlar, adenovirüs enfeksiyonu için uygun biyogüvenlik koşulları altında gerçekleştirilmelidir. Kotranfeksiyon için lineerleştirilmiş vektör hazırlamak üzere, altı µL jet PEI reaktifini 94 µL 50 µM sodyum klorür içine aktarın ve vorteksleyin.Kısaca, vorteksleme yaparken karışımlı çözeltiyi 100 µL lineerize adenovirüs vektörüne ekleyin. Bu transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin. Ardından, altı kuyucuklu plaklarda %50 konfluense ulaşmış HEC 2 9 3 A hücrelerini inkübatörden çıkarın.Çözeltiyi, HEC 2 9 3 A hücreleri içeren kuyucuklara damla damla ekleyin ve 37 °C'de, %10 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. GFP ekspresyonunu bir enfeksiyon belirteci olarak kullanarak her üç günde bir 0,5 mL taze besiyeri ekleyin. Transfeksiyon verimliliğini iki ila üç günde bir ters floresan mikroskobu ile görsel olarak değerlendirin ve genişlemiş ve yuvarlaklaşmış hücrelerin ayrılmaya başladığı bölgelerle kendini gösteren sitopatik etkileri kontrol edin.Bu durum, verimli virüs üretiminin bir göstergesidir. Daha geniş sitopatik etki bölgeleri ortaya çıktığında, tüm hücreler 24 ila 72 saat içinde enfekte olacaktır. Tüm hücreler sitopatik etki belirtileri gösterdiğinde, ancak hücrelerin genel bir ayrılması gerçekleşmeden önce, hücreleri nazikçe pipetleyerek toplayın ve süpernatant ile birlikte 15 mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın.Hücreleri parçalamak için süspansiyonları kuru buz üzerinde 15 ila 20 dakika boyunca dondurun, ardından 37 °C'de hızlıca çözdürün. Bu dondurma ve çözdürme döngüsünü iki kez daha tekrarlayın. Parçalanmış hücre süspansiyonu artık primer virüs lizatı olarak adlandırılır.Tüm virüs lizatlarını buz üzerinde tutun. Uzun süreli saklama için bir gün içinde kullanılmayacaklarsa, -80 °C'de dondurun. Her ek dondurma-çözme döngüsünün virüs titresini %30 ila %50 oranında azaltacağını unutmayın. Birincil virüs lizatını çoğaltmak için, 15 doku kültürü kabında %90 konfluense ulaşmış HC 2 93 A hücrelerini birincil virüs lizatının yarısı ile enfekte edin ve en az 36 saat inkübe edin.36 saat sonra floresan mikroskobu ile enfeksiyonu kontrol edin, hücrelerin neredeyse tamamı enfekte olmuş olmalıdır. Tüm hücreler sitopatik etkiler gösterdiğinde ancak henüz kopmamışken, etkin virüs üretimi için hücreleri nazikçe pipetleyerek hasat edin. Bu duruma enfeksiyondan sonraki 48 saat içinde ulaşılır; hücreleri ve süpernatantı 50 milliliter'lik bir polistiren tüpe aktarın.Hücreleri 4 °C'de, 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve peleti uygun hacimdeki besiyerinde yeniden süspande edin. Bir mililitrede, mililitre başına 10¹⁰ aralığında bir titre elde edilmelidir.Hücreleri parçalamak için daha önce olduğu gibi üç kez dondur-çöz döngüsü uygulayın. Ardından, 4 °C'de 20 dakika boyunca 900 G'de santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra, artık konsantre virüs lizatı olarak adlandırılan süpernatanı dikkatlice bir kriyotüpe aktarın.Birden fazla enfeksiyon için alikotlar hazırlayın ve bunları -80 °C'de saklayın. Son olarak, 5 4 9 hücrelerinde enfeksiyon markörü ekspresyonunun faks analizi ile virüs titresi tayinini gerçekleştirin. Ekteki belgede yer alan talimatlara göre, protokolün bu kısmı, küçük ölçekli deneyler için D 1110 transgenik car delta 1 transgenik farelerden izole edilen naif rusting CD4 T hücreleri kullanılarak yürütülür.96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın bir kuyucuğuna, 50 MOI değerine ulaşmak için uygun hacimde viral lizat pipetleyin. Final enfeksiyon hacmi 50 µL olacak şekilde, kuyucuğa 4 x 10⁵'e kadar T hücresi ekleyin.Orta ölçekli ortam. Bu düzenek paralel deneysel yaklaşımlara olanak tanır. Hücreleri %5 karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hücreleri oda sıcaklığında 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj sonrası hücreleri 200 µL PBS içinde süspanse edin, tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. Hücreleri, stimüle edici antikorlar, IL-2 veya diğer sitokinler içermeyen 200 µL T hücresi besiyeri içinde yeniden süspanse edin. Ardından, aktivasyon öncesinde ilgili genin ekspresyonuna izin vermek için hücreleri %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de 40 saat boyunca dinlendirin. T hücrelerini aktive etmek ve polarize etmek için, anti-CD3 ve anti-CD28 kaplı boncukları küçük bir reaktif kabına pipetleyin. Boncuk sayısı hücre sayısına eşit olmalıdır; ardından on katı hacimde PBS ekleyin ve iki dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin.Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve resüspansiyon yapın. Boncukları 200 µL polarizasyon ortamında süspande edin; dinlendirilmiş hücreleri oda sıcaklığında 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri, antikor bağlı boncuklar içeren 200 µL polarizasyon ortamında resüspande edin. Ortam değişikliği yapmadan, %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin. Boyama ve fiksasyon protokolü burada kısaca açıklanmıştır.İlk olarak hücreler PBS ile yıkanır ve fikse edilebilir ölü hücre boyama çözeltisi ile inkübe edilir. Bir başka yıkama adımının ardından hücreler paraformaldehit ile fikse edilir; fiksasyondan sonra hücrelere adenovirüs biyogüvenlik önlemleri alınmadan işlem yapılabilir. Hücreler tekrar yıkanır ve metanol ile permeabilize edilir. Bir başka yıkama adımının ardından hücreler, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için anti-FcR III ile inkübe edilir.Son olarak, hücreler anti FCR three ve PE konjugatlı anti fox P three antikorları ile inkübe edilir. Çok sayıda yıkama adımı nedeniyle fiksasyon ve boyama prosedürü sırasında çok sayıda hücre kaybı riski vardır; kaybı önlemek için santrifüjden hemen sonra, pipet ucuyla pellettenten etkilemeden süpernatantı aldığınızdan emin olun. Hücreler boyandıktan sonra, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve bir akış sitometresinde analiz edin.Akış sitometresindeki bir 96 kuyucuklu okuyucu; T hücresi enfeksiyonu, diferansiyasyonu, fiksasyonu ve boyamanın aynı 96 kuyucuklu plakada gerçekleştirilmesine olanak tanıyarak çok sayıda koşulun paralel analizleri için verimli bir iş akışı sağlar; ancak adenovirüs enfeksiyonunun T hücresi canlılığı ve treg diferansiyasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için analizler standart faks tüplerinde de gerçekleştirilebilir. DO 1110 transgenik car delta one transgenik farelerden saflaştırılan naive T hücreleri, farklı MOI değerlerinde kontrol adenovirüsü ile enfekte edilmiş ve treg polarizasyon koşullarında aktive edilmiştir. Fikse edilen ve boyanan hücreler, enfeksiyon belirtecinin ekspresyonu için akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.Ölü hücre boyası ve farklılaşma belirteci olarak GFP inklüzyonu. Burada gösterildiği gibi FOX P three. MOI'nin 1'den 50'ye çıkarılması, enfekte hücre yüzdesinin artmasıyla sonuçlanır.Adenovirüs enfeksiyonunun T hücrelerinin aktivasyon durumunu etkileyip etkilemediğini belirlemek için, ne canlılık ne de treg farklılaşması etkilenmişken; enfekte ve enfekte edilmemiş hücreler, burada görüldüğü üzere aktivasyon ve dinlenme belirteçlerinin ekspresyonu açısından analiz edilmiştir. Hücreler daha sonra treg polarizasyon koşullarında aktive edildiğinde, bu belirteçlerin ekspresyonu enfekte ve enfekte edilmemiş hücrelerde ayırt edilemez düzeydeydi.Aktivasyon markerlarının yukarı düzenlenmesi (upregulation) ve naive T-hücresi markerlarının aşağı düzenlenmesi (downregulation), enfekte ve enfekte edilmemiş hücrelerin toplamında birbirine çok benzerdi. Bu veriler, naive durumdaki T hücrelerinin enfekte edilmesinin, sonraki T-hücresi aktivasyonuna müdahale etmediğini göstermektedir; tanımlanan adenoviral transdüksiyon protokolü ile ulaşılan aşırı ekspresyon seviyesini test etmek için, naive T hücreleri microRNA 1 55 kodlayan veya kontrol adenoviral vektörleri ile 50 MOI değerinde enfekte edildi; hücreler ya 40 saat boyunca dinlendirildi, ya 40 saat boyunca aktive edildi ya da önce 40 saat dinlendirilip ardından 40 saat aktive edildi. cDNA sentezlendi ve micro RNA 1 55 ekspresyonu snRNA 202'ye oranla belirlendi.Kantitatif PCR ile, 40 saat dinlendirilmiş naif T hücrelerindeki microRNA 1 55 aşırı ifade düzeylerinin, endojen microRNA 1 55 ekspresyon düzeyleriyle eşleştiği görülmüştür. T hücresi aktivasyonundan 40 saat sonra, bu hücrelerin aktivasyonu hâlâ aktivasyona bağımlı microRNA 1 55 yukarı düzenlemesini tetiklemektedir.Bu, adenovirüs aracılığıyla saf T hücrelerinde, endojen aktivasyonla tetiklenen mikro RNA ekspresyonuna ek olarak gerçekleşen yüksek düzeydeki aşırı ekspresyonu göstermektedir. Klonlama prosedüründe uzmanlaşıldığında, virüs üretimi ve T hücresi enfeksiyonu dört hafta içinde tamamlanabilir. Üretilen virüs, uzun süre saklanabilir veya üç gün içinde yeniden amplifiye edilebilir.Bu prosedür uygulanırken, tüm deneylerin boş bir vektörle dikkatlice kontrol edilmesi ve öncelikle adenoviral enfeksiyonun kendi etkisinin incelenen süreç üzerindeki etkisinin belirlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Lütfen adenoviral enfeksiyonun ve aşırı ifadenin geçici olduğunu ve yalnızca yaklaşık beş ila yedi gün sürdüğünü göz önünde bulundurun.

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Burada, naif ve kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T (Treg) hücrelerinin fenotipini analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, Treg hücrelerinin baskılayıcı aktivitesini değerlendirmek için bir süreç sunuyoruz.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Bir çok deney sistemleri, bir immün yanıt olarak T hücresi gelişimini ve fonksiyonunu düzenlemek mekanizmaları anlamak için kullanılmıştır. İşte retroviral transdüksiyon kullanarak genetik yaklaşım düzenleyici yolları belirlenmesinde, ekonomik zaman verimli ve en önemlisi, son derece bilgilendirici olan tarif edilmektedir.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Bu protokol, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir üretimi ve insan kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin (iTregs) fenotipleme tarif eder. FoxP3 indüksiyonu için farklı protokoller ilgili protokolleri ile elde edilen spesifik iTreg fenotipleri çalışması için izin verir.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Bu protokol, naif CD4+ T hücrelerinin in vitro olarak patojenik Th17 hücrelerine farklılaşmasını tanımlar. Spesifik olarak, çok parametreli akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, bu farklılaşma yöntemi kullanılarak saf CD4+ T hücrelerinden %90 saflıkta patojenik Th4 hücreleri elde edilebilir.

Farede Naif CD4+ T Hücrelerinin Patojenik Th17 Hücrelerine İn Vitro Farklılaşması

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Öğrenin, adenoviral iletim kullanarak naif CD4 T hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle etme yöntemini. Bu teknik, Treg farklılaşması öncesinde erken moleküler olayları incelemek için değerli bir araç sunar.

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Daha fazla video keşfet