Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu In vitro

Burada in vitro glikojen titrasyonu için bir doğru, tekrarlanabilir ve uygun biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik Abcam Glikojen deney kiti kullanır ve floresan ile titrasyon glikoz ve glikoz glikojen ardışık hidrolizi dayanmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, hücre örneklerinde in vitro olarak glikojeni titre etmektir. Bu, önce hücrelerin mekanik bozulma ile parçalanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, glikozu elde etmek için glikojeni alfa amilaz ile hidrolize etmektir.

Daha sonra, glikoz bir floresan türü üreterek oksitlenir. Son adım, floresansı ölçmektir. Sonuç olarak, hücrelerdeki glikojen içeriğindeki değişiklikleri göstermek için glikojenin biyokimyasal titrasyonu kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, rekabetçi, hassas, doğru ve çok spesifik olmasıdır. Bu işleme başlamak için, 100 milimetre çapındaki çanak başına 0,5 ila 2 milyon konsantrasyonda tohum hücreleri. Hücreleri% 1 oksijen,% 94 nitrojen ve% 5 karbondioksit olarak ayarlanmış anaerobik bir iş istasyonunda hipoksi içinde 24, 48 veya 72 saat inkübe edin.

Paralel olarak, her oksijen koşulu için normoxia'da başka bir hücre setini inkübe edin. Tedaviden sonra deney sırasında glikoz konsantrasyonundaki değişiklikleri en aza indirmek için her 24 saatte bir 25 milimolar glikoz içeren ortamı değiştirin. Kültür ortamından glikoz izlerini çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

Daha sonra hücreleri soğuk PBS santrifüjünde, PBS çözeltisi 1000 RPM'de beş dakika boyunca kazıyın. Süpernatanı atın ve peleti PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, peleti 100 mikrolitre damıtılmış su içinde yeniden süspanse edin ve bir glikojen tahlil kitinden elde edilen 100 mikrolitre glikojen hidroliz tamponu ekleyin.

Enzimleri etkisiz hale getirmek için lizatı 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Lizat oda sıcaklığına soğutulduktan sonra girdap ve santrifüj. 13.000 kez lizat.

Çözünmeyen ürünleri çıkarmak için 10 dakika boyunca yerçekimi. Ardından, numuneler arasındaki protein içeriğine glikojen seviyelerini normalleştirmek için süpernatanı bir kenara koyun. Bsik asit tahlilini kullanarak proteinleri 25 ila 35 mikrolitre süpernatan ile ölçün.

Bu karışımı takiben, önceki adımlardan 50 mikrolitre süpernatant, bir mikrolitre hidroliz enzimi karışımı ile karıştırılır. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve kalibrasyon eğrisi standardını hazırlamak için bir kenara koyun, standart kit glikojenini mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için hidroliz tamponu ile seyreltin. Ardından, mililitre başına 10 mikrogramın 0, 4, 8, 12, 16 ve 20 mikrolitresini ekleyin.

Standart ila altı ayrı tüp, her standardı 50 mikrolitrelik bir nihai hacim ve mililitre başına sırasıyla 0.04, 0.08, 0.12, 0.16 ve 0.2 mikrogramlık bir glikojen konsantrasyonu vermek için hidroliz tamponu ile seyreltir. Standartlara bir mikrolitre hidroliz enzim karışımı ekleyin ve her oksijen koşulu için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Birinci tüpü serbest glikoz konsantrasyonu ve ikinci ve üçüncü tüpleri toplam glikoz konsantrasyonu olarak etiketleyin.

Daha sonra, birinci tüpe 15 mikrolitre ekstrakte edilen süpernatanı ve ardından 35 mikrolitre hidroliz tamponu ekleyerek 50 mikrolitrelik bir nihai hacim elde edin. Serbest glikoz konsantrasyonuna karşılık gelen floresan daha sonra ölçülecektir. İkinci tüpe dört mikrolitre hidrolize glikojen ekleyin ve hidroliz tamponu ile 50 mikrolitrelik son hacme ayarlayın.

Floresan değerlerini kalibrasyon eğrisinin konsantrasyonları içinde tutmak için, üçüncü tüpe iki mikrolitre hidrolize glikojen ekleyin ve hidroliz tamponu ile 50 mikrolitrelik nihai hacme ayarlayın. Ardından, 48.7 mikrolitre geliştirme tamponu, bir mikrolitre geliştirme enzimi karışımı ve 0.3 mikrolitre Oxy Redd Probunu karıştırarak tüm numuneler ve standartlar için bir geliştirme solüsyonu hazırlayın. Her numune standardı için, her tüpe bu karışımdan 50 mikrolitre ekleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin.

Floresan ölçümü için oda sıcaklığında, uyarma ve emisyon için yarığı üç nanometreye ayarlayın ve ardından floresansı ölçün. Glikojen depolanması ve hipoksinin düzenlenmesi, glikojen, memeli hücrelerinde glikozun ana enerjik polimeri olduğu için incelenmiştir. Hücre satlarındaki glikojen konsantrasyonunun hesaplanması ve standardizasyonu, floresanın ham verileri üzerinde gerçekleştirildi.

Burada floresan ölçümlerinden gösterildiği gibi, toplam serbest glikoz konsantrasyonu hesaplandı. Bu sonuçlar kullanılarak glikojenden türetilen glikoz miktarı belirlendi. Glikojen için biyokimyasal tahlil, ccl 39 hücrelerinin elektron mikrograflarında gözlenen elektron yoğun agregatların glikojen partikülleri olduğunu doğruladı.

Glikojen ve hipoksi birikimi transkripsiyon faktörüne bağlıdır. Farklı kanser ve kanser dışı hücre dizilerinde glikojen depolanmış hipoksiye hücresel adaptasyonda rol oynayan ana transkripsiyon faktörü olan hipoksi ile indüklenebilir faktör bir, hücre tarafından altı saatten daha kısa sürede hızla metabolize edilebilir. Ek olarak, glikojen kullanımı, bu prosedürü takiben glikoz açlığı koşulları altında hücre ölümüne karşı korur.

Ayrıca, hücrelerdeki glikojen dağılımı gibi ek soruları yanıtlamak için elektron mikroskobu ve periyodik asit kayması boyama gibi yöntemler de uygulanabilir.