Name: Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Öğrenin, hücre örneklerinde glikojenin biyokimyasal titrasyonunu floresan ölçümüyle gerçekleştirmeyi. Bu hassas yöntem, metabolik süreçlerde enerji depolama dinamiklerini araştıran bilim insanları için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bize florasan spektrometre kullanmak için izin verdiği için ve onun yardım için Dr Thierry Pourcher minnettarız. Laboratuvar Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée) tarafından finanse edilen, Dernek la Recherche contre le Kanser, Institut National du Yengeç (Inca) dökmek, Agence Nationale la Recherche, METOXIA (AB programı FP7), Centre dökmek A. Lacassagne, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale ve Nice Üniversitesi ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). Biz eleştirel okuma ve editoryal düzeltme için Dr M Christiane Brahimi-Horn teşekkür ederim.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu 1.. Cell Lysis <ol><li> 100 mm çaplı tabak başına 0.5-2 x 10 6 konsantrasyonunda tohum hücreleri. </li><li> Tedavi: hücreleri inkübe 24,% 1 veya% 0.1 O 2,% 94 ya da ayarlanmış bir Bug-Box anaerobik çalışma istasyonu (Ruskinn Teknoloji Biotrace International Plc, Bridgend, UK) düşük oksijen konsantrasyonu (hipoksi) 48 ya da 72 saat % 94.9 N 2 ve% 5 CO 2. Buna paralel olarak, (% 21 O 2,% 5 CO2) normoksiyada hücreleri inkübe edin. Deney zamanında glikoz konsantrasyonundaki değişimleri en aza indirmek için, her 24 saat (25 mM glikoz-içeren ortam) ortam değiştirin. </li><li> Tedaviden sonra hücreler, yıkama kültür ortamından glukoz izlerini çıkarmak için PBS ile 2 kat. Soğuk PBS hücreleri kazıyın. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de santrifüje çözeltisi, süpernatantı atmak ve bir kez PBS ile pelet yıkayın. Pelet fazla ilerlemeden önce -20 ° C&#39;de dondurulmuş olabilir.</li><li> Damıtılmış su, 100 ul pelet tekrar. Glikojen Assay Kit (Abcam) ile sağlanan glikojen Hidroliz Tampon 100 ul ekleyin. Enzimleri inaktive etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de lizat kaynatın. </li><li> Çözünmeyen ürünleri çıkarmak için 10 dakika boyunca 13,000 rpm&#39;de Vorteks ve santrifüj lizat. Süpernatant tutun. </li><li> Örnekler arasındaki protein içeriğine glikojen seviyeleri normalleştirmek için, proteinlerin ölçümü bisinkoninik asit yöntemi (BCA-Interchim) kullanılarak 25-35 ul süpernatan ile yapılabilir. </li></ol> Lizat bazı hücrelerin içinde serbest glükoz konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir. 2. Glikojen hidrolizi <ol><li> Hidroliz Enzim Karışımı 1 ul süpernatan (aşama 1) 50 ul karıştırın. Bu karışım glukoamilazı içerir. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Standart glikojen seyrelterek, kalibrasyon eğrisinin hazırlanması (2 mg / ml) shidroliz tamponu içinde 10 ug / ml &#39;lik bir solüsyonuna kiti ile upplied. Daha sonra, altı ayrı 0 ile tüpler, 4, 8, 12, 16, ve 10 ug / ml bir standart 20 ul hazırlamak ve 0 glikojen bir konsantrasyon vermek üzere hidroliz tampon maddesi ile 50 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar her bir tüp ayarlamak 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16 ve 0.2 ug / ml. Standartlarda hidrolizi Enzim Karışımı 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol> Serbest glukoz konsantrasyonu için değer ile verilen hücre çizgisinin arka glikoz konsantrasyonu, hücre glikojen seviyesini belirlemek için toplam glikoz konsantrasyonu (glikojen hidroliz + serbest-glikozdan, glikoz) için değerden çıkartılır gerekir. 3. Kalkınma ve Floresans Okuma <ol><li> Her bir durumda, serbest glükoz konsantrasyonu ve iki boruyu ölçmek için (boru 1) bir tüp hazırlanması (boru 2 ve 3), toplam glikoz konsantrasyonunu (her boru wit ölçmekhidrolize glikojen ha farklı ses). </li><li> Borunun 1 içinde 1 aşamasının sonunda ekstre süpernatan 15 ul ekle. 50 ul bir son hacme tamamlamak için hidroliz tamponu 35 ul ekle. Elde edilen floresan, serbest glükoz konsantrasyonunu verir. </li><li> Tüp 2 (adım 2&#39;de elde edilmiştir) hidroliz glikojen X ul ekleyin. 50 ul bir son hacme kadar ayarlayın. Numune hacmi (X ul) kalibrasyon eğrisinin konsantrasyonları dışında değildir floresans değerler elde etmek amacıyla hücre yoğunluğu ve / veya hücre tipine göre ayarlanmalıdır. </li><li> Borunun 3 içinde hidrolize glikojen 2 X ul ekleyin. 50 ul bir son hacme kadar ayarlayın. </li><li> Her tüp için Kalkınma Tampon 48.7 ul, Kalkınma Enzim Mix 1 ul ve (Glikojen Assay Kit verilen) OxiRed Probe 0.3 ul karıştırılarak numuneler ve standartlar için bir geliştirme çözüm hazırlayın. Örneğin, 2 koşullar için, 12 borusu için bir karışımını hazırlamaks (standartları 6, serbest glükoz 2 ve toplam glikoz floresan 4). </li><li> Her tüpe bu karışımı 50 ul eklenir ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Tavsiye edildiği gibi 535 nm, 587 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunda bir uyarma dalga boyunda floresan ve bir eksitasyon ve emisyon için 3 nm&#39;lik bir yarık ölçün. </li></ol>

<ol><li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li>
<li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li>
<li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li>
<li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+liver+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li>
<li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li>
<li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li>
<li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Fluorescent+glycogen%22+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li>
<li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DCH+%22Theory+and+practice+of+histotechnology%22">Theory and practice of histotechnology</a>. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).</li>
<li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Kokubyo+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

In vitro olarak glikojen biyokimyasal titrasyon hücreleri glikojen içerik doğru bir ölçümü sağlar. Diğer bazı teknikler (bir glikojen antikor ile PAS, immunofloresans, vb.) Ile karşılaştırıldığında, bu titrasyon çok özel, hassas ve tekrarlanabilir. Bu radyoaktivite, ancak florasan spektrometre gerektirdiğinden Ayrıca, yöntem uygundur. Ancak, bu teknik, nicel ve hücre içinde glikojen dağılımı hakkında bilgi sağlamaz. Bu yazıda tarif edilen teknik, hücre ekstreleri üzerinde e...

Glikojen pek çok hücre sitoplazması içinde mevcut olan glikoz kalıntısının bir multibranched polimerdir. Bu hücrelerde enerji depolama ana biçimlerinden biridir ve glikoz metabolizmasında önemli bir rol oynar. Çoğu memeli hücreleri hızla metabolik stres sırasında glikoliz ve ATP üretimini teşvik etmek için glikoz içine bozulmuş olabilir ve mağaza glikojen, üretebiliriz. Hepatositler böylece vücuda glikoz sürekli tedarik sağlayan kan şekeri seviyesini düzenlemek için glikojen büyük miktarda üretir. Bunun aksine, diğer hücreler (kas, kırmızı kan hücreleri, vs) glikojen konsantrasyonu, nispeten düşüktür. Bununla birlikte, lokal olarak, bu miktarlar hücreler birden besin yoksun bir ortama maruz kaldıklarında kısa vadede enerji sağlamak için yeterlidir. Glikojen sentezi ve glikojen dökümü tüm dokularda aynı adımlar (Şekil 1) takip eder. İlk olarak, glikozglikoz taşıyıcılannın (gluts) ile hücrelere girer ve hızla fosfoglukomutaz glikoz-1-fosfat (G1P) glukoz-6-fosfat (G6P) dönüştürülür. G1P sonra UDP-glikoza modifiye edilir ve UDP-glikoz karbon C1 glycogenin, glikojen ankraj protein tirosin artığı bağlanmıştır. Bu molekül, bir glikojen primer olarak, glikojen sentaz üzerinden bir α (1 → 4) bağı ile terminal glikoz için UDP-glikoz eki ile uzatılır. 11 den fazla glikoz kalıntısının doğrusal bir zincir meydana getirildiği zaman, son olarak, dallanma enzimi, bir at α (1 → 6) bağı vasıtasıyla bir zincirin glikoz 6 glikoz kalıntısı, en az oluşan bir terminal oligosakkarit aktarır. Bu işlemin tekrarlanması tur başına 6.5 glükoz ile bir sarmal oluşturmak dalları ihtiva eden büyük bir fraktal bir yapı verir. Glikojen uyumlu eylem glukoza ters hidrolize olabilirBir dalın glikoz son artık ile glikojen molekülü arasındaki sınır glikosidik α (1 → 4) hidrolize α (1 → 6) bağlı ve glikojen fosforilaz hidrolize eden enzimler dallara ayrılmayı giderme bölgesinin. Glikojenolizin olarak bilinen bu reaksiyon, (ATP tüketimine yansıtan) AMP seviyelerinin arttırılması ile aktive ve glikoz ve ATP 2,3 ile inhibe edilir. Elektron mikroskobu ile, glikojen molekülü bir çok hücre tipinde çapı 15-30 nm olarak β serbest parçacıklar (ya da glikojen monopartıcles) &#39;de tarif edilmiştir. Hepatositler gibi özel hücre tiplerinde, β parçacıklar 80 nm ila 200 nm, 4, maksimum çapı da değişebilir α partiküller olarak bilinen rozetler, oluşturulması için bir kompleksi içine monte edilebilir </sup&gt;. Bu parçacıklar β α parçacıkların büyük kümeler oluşturmak için bağlı oldukları şekilde hala tam olarak aydınlatılamamıştır. Bazı kanıtlar β parçacıklar kovalent bağlama 5, hidrojen bağlanması, ya da protein-protein etkileşimleri yoluyla 6 ile bağlanmış olabilir kanıtlamak eğilimindedir. Hücrelerinde depolanmış olan glikojen miktarı, bir çok parametreye bağlıdır: (I) glikojen sentezini başlatır hücrede glycogenin miktarı, protein fosforilasyon / defosforilasyon düzenlenir glikojen sentaz ve fosforilazın (II) aktivitesi, (III) konsantrasyonu örneğin damar sistemi glukoz kaynağı ve hücreleri tarafından glikoz alımının gibi çeşitli parametrelere bağlıdır hücrelerin, glikoz. Glikojen depoları sıkı enerji metabolizmasını düzenleyen hormonlar tarafından, ara metabolitleri yoluyla biyosentetik hormonların allosterik yönetmelikle düzenlenir ve besin algılama sinyal yollarının 7 tarafından edilir. Bu olmak önemlidirdaha tüm vücut ve hücresel düzeyde glikojen metabolizmasının önemini anlamak için biyolojik numunelerde glikojen ölçmek mümkün. Biz burada glikojen için in vitro deneyinde bir hassas, yeniden üretilebilir ve uygun biyokimyasal açıklar. Bu teknik, glikojen özel hidroliz öncesi ve sonrası glikoz miktar floresan dayanmaktadır. Diğer yöntemler hücrelerde glikojen seviyesini tahmin etmek vardır, ama bunların çoğu kantitatif değildir. Hücrelerde glikojen ölçümü için tarif edilen birinci tekniklerden biri glikojen 8,9 halinde [14C]-glükoz dahil ölçümüne dayanıyordu. Radyoaktivite kullanılması işlemek için bu işlem daha zor hale getirir ama glikojen içine ve dış dallarına ve molekülün çekirdek glikoz kalıntısının dağılımı arasında ayırt glikoz dahil oranını temin etme avantajına sahiptir (aynı zamanda bir gerektirir Ek β-amylolysis ve kromatografik adım). Başka bir teknik, daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve 2-NBDG eklenmesi dayanır (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oksa-1 ,3-diazol-4-il] amino}-2-deoksiglukoz), bir glikojen 10 içine 2-deoksiglukoz floresan türevi. Ölçülen floresans yoğunluğu üretilen glikojen miktarını yansıtır ve bir floresan okuyucu ile ölçülebilir. Hücredeki floresan dağılımı da konfokal mikroskopi ile değerlendirilebilir. Diğer nonquantitative teknikler arasında, Periyodik asit-Schiff boyama (PAS) belki de en yaygın olanıdır. Bu, sabit hücrelerde, parafin içinde doku bölümleri ya da dondurulmuş olarak glikojen tespiti için de kullanılabilir. Mor Bu histolojik teknik renkler olmayan özel polisakkaritler, glikolipitler, glikoproteinler, selüloz ve nötr müsinler. Bu testin özgüllüğü özel olarak glikojen digests diastaz, sabit hücre veya doku kesitlerinin tedavisi ile arttırılabilir. Daha sonra,glikojen nitel düzeyi (karbonhidrat dışında glikojen makro molekülleri modifiye edilmiş) hidrolize örnekler hidrolize olmamış örnekleri (her karbonhidrat değiştirilmiş makro moleküller) karşılaştırılması ile tahmin edilebilir. Glikojen biyokimyasal deneylerde farklı PAS boyanması ve mikroskopik analizleri, dağınık ya da hücrenin belirli bir kısmı içinde konsantre edilebilir hücrede glikojen dağılımı hakkında bilgi sağlar. Hatta farklı koşullar arasında glikojen birikiminin PAS boyama tahminler farklar da, ancak, bu 11 kantitatif değildir. Bir monoklonal fare antikoru başlangıçta in vitro antijen 12 hücrelerinde glikojen ve saflaştırılmış glikojen ile tepkimeye gösterildiği gibi çene kondiler kıkırdak kullanılarak yapılır. Bu antikor özel olarak glikojen ilgili şeker zincirleri kabul ettiği gibi, bu PAS boyanması daha özel bir şekilde immünohistokimya ile glikojen tespiti için yararlı bir araçtır. </p&gt; Elektron mikroskopisi hücreleri ve glikojen depolama derecesinin değerlendirilmesinde glikojen tanelerinin görüntülenmesini sağlayan bir başka tekniktir. Aslında, glikojen β parçacıkların elektron yoğun granüller 1 gibi bir elektron mikroskobu ile kolayca tanınabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen Test Kiti</td><td>Abcam</td><td>ab65620</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Floresan Spektrometresi</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

glikojenin biyokimyasal titrasyonu<em&gt; in vitro</em

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glikojen omurgalı hayvanlarda glikoz ana enerjik polimerdir ve önemli bir tüm vücut metabolizmasında rol hem de hücresel metabolizmada oynar. Glikojen tespit etmek için birçok yöntem zaten var ama sadece birkaç nicel vardır. Burada glikoamilaz glukoza glikojen özel bozulması dayanır Abcam Glikojen deney takımı kullanılarak bir metodu tarif etmektedir. Glukoz sonra özellikle floresan üretmek için OxiRed prob ile reaksiyona giren bir ürün için oksitlenir. Titrasyon doğru, hassas ve hücre ekstreleri veya doku bölümleri üzerinde elde edilebilir. Bununla birlikte, diğer tekniklerin aksine, bu hücrede glikojen dağılımı hakkında bilgi vermemektedir. Bu tekniğin bir örneği olarak, normoksiyada kuluçkaya iki hücre hatları, Çin hamsteri akciğer fibroblast CCL39 ve insan kolon karsinoma LS174, hipoksi karşı (% 21 O 2) (1% 2 O) burada glikojen titrasyonu açıklar. Biz hipoksi bir sig olduğunu varsaydıknal o hücreleri 1, hayatta kalmak için sentez ve mağaza glikojen hazırlar.

Tümör hücrelerine karşı tümörler sinyaller oksijen (hipoksi) hayatta kalmak üzere, daha sonra besin tüketimi işlemek için enerji depolamak için ihtiyaç bir düşük düzeyde. Glikojen memeli hücrelerinde glikoz ana enerji polimer olduğu için, hipoksi glikojen depolama düzenleme incelenmiştir. Tablolar 1, 2 ve 3 &#39;de gösterildiği gibi, hücre lizatları içinde glikojen konsantrasyonunun hesaplanması ve standardizasyon floresans ham veriler üzerinde gerçekleştirilmelidir. Glikojen için biyok...

Burada in vitro glikojen titrasyonu için bir doğru, tekrarlanabilir ve uygun biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik Abcam Glikojen deney kiti kullanır ve floresan ile titrasyon glikoz ve glikoz glikojen ardışık hidrolizi dayanmaktadır.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre örneklerinde in vitro olarak glikojeni titre etmektir. Bu, önce hücrelerin mekanik bozulma ile parçalanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, glikozu elde etmek için glikojeni alfa amilaz ile hidrolize etmektir.Daha sonra, glikoz bir floresan türü üreterek oksitlenir. Son adım, floresansı ölçmektir. Sonuç olarak, hücrelerdeki glikojen içeriğindeki değişiklikleri göstermek için glikojenin biyokimyasal titrasyonu kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, rekabetçi, hassas, doğru ve çok spesifik olmasıdır. Bu işleme başlamak için, 100 milimetre çapındaki çanak başına 0,5 ila 2 milyon konsantrasyonda tohum hücreleri. Hücreleri% 1 oksijen,% 94 nitrojen ve% 5 karbondioksit olarak ayarlanmış anaerobik bir iş istasyonunda hipoksi içinde 24, 48 veya 72 saat inkübe edin.Paralel olarak, her oksijen koşulu için normoxia'da başka bir hücre setini inkübe edin. Tedaviden sonra deney sırasında glikoz konsantrasyonundaki değişiklikleri en aza indirmek için her 24 saatte bir 25 milimolar glikoz içeren ortamı değiştirin. Kültür ortamından glikoz izlerini çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.Daha sonra hücreleri soğuk PBS santrifüjünde, PBS çözeltisi 1000 RPM'de beş dakika boyunca kazıyın. Süpernatanı atın ve peleti PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, peleti 100 mikrolitre damıtılmış su içinde yeniden süspanse edin ve bir glikojen tahlil kitinden elde edilen 100 mikrolitre glikojen hidroliz tamponu ekleyin.Enzimleri etkisiz hale getirmek için lizatı 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Lizat oda sıcaklığına soğutulduktan sonra girdap ve santrifüj. 13.000 kez lizat.Çözünmeyen ürünleri çıkarmak için 10 dakika boyunca yerçekimi. Ardından, numuneler arasındaki protein içeriğine glikojen seviyelerini normalleştirmek için süpernatanı bir kenara koyun. Bsik asit tahlilini kullanarak proteinleri 25 ila 35 mikrolitre süpernatan ile ölçün.Bu karışımı takiben, önceki adımlardan 50 mikrolitre süpernatant, bir mikrolitre hidroliz enzimi karışımı ile karıştırılır. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve kalibrasyon eğrisi standardını hazırlamak için bir kenara koyun, standart kit glikojenini mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için hidroliz tamponu ile seyreltin. Ardından, mililitre başına 10 mikrogramın 0, 4, 8, 12, 16 ve 20 mikrolitresini ekleyin.Standart ila altı ayrı tüp, her standardı 50 mikrolitrelik bir nihai hacim ve mililitre başına sırasıyla 0.04, 0.08, 0.12, 0.16 ve 0.2 mikrogramlık bir glikojen konsantrasyonu vermek için hidroliz tamponu ile seyreltir. Standartlara bir mikrolitre hidroliz enzim karışımı ekleyin ve her oksijen koşulu için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Birinci tüpü serbest glikoz konsantrasyonu ve ikinci ve üçüncü tüpleri toplam glikoz konsantrasyonu olarak etiketleyin.Daha sonra, birinci tüpe 15 mikrolitre ekstrakte edilen süpernatanı ve ardından 35 mikrolitre hidroliz tamponu ekleyerek 50 mikrolitrelik bir nihai hacim elde edin. Serbest glikoz konsantrasyonuna karşılık gelen floresan daha sonra ölçülecektir. İkinci tüpe dört mikrolitre hidrolize glikojen ekleyin ve hidroliz tamponu ile 50 mikrolitrelik son hacme ayarlayın.Floresan değerlerini kalibrasyon eğrisinin konsantrasyonları içinde tutmak için, üçüncü tüpe iki mikrolitre hidrolize glikojen ekleyin ve hidroliz tamponu ile 50 mikrolitrelik nihai hacme ayarlayın. Ardından, 48.7 mikrolitre geliştirme tamponu, bir mikrolitre geliştirme enzimi karışımı ve 0.3 mikrolitre Oxy Redd Probunu karıştırarak tüm numuneler ve standartlar için bir geliştirme solüsyonu hazırlayın. Her numune standardı için, her tüpe bu karışımdan 50 mikrolitre ekleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin.Floresan ölçümü için oda sıcaklığında, uyarma ve emisyon için yarığı üç nanometreye ayarlayın ve ardından floresansı ölçün. Glikojen depolanması ve hipoksinin düzenlenmesi, glikojen, memeli hücrelerinde glikozun ana enerjik polimeri olduğu için incelenmiştir. Hücre satlarındaki glikojen konsantrasyonunun hesaplanması ve standardizasyonu, floresanın ham verileri üzerinde gerçekleştirildi.Burada floresan ölçümlerinden gösterildiği gibi, toplam serbest glikoz konsantrasyonu hesaplandı. Bu sonuçlar kullanılarak glikojenden türetilen glikoz miktarı belirlendi. Glikojen için biyokimyasal tahlil, ccl 39 hücrelerinin elektron mikrograflarında gözlenen elektron yoğun agregatların glikojen partikülleri olduğunu doğruladı.Glikojen ve hipoksi birikimi transkripsiyon faktörüne bağlıdır. Farklı kanser ve kanser dışı hücre dizilerinde glikojen depolanmış hipoksiye hücresel adaptasyonda rol oynayan ana transkripsiyon faktörü olan hipoksi ile indüklenebilir faktör bir, hücre tarafından altı saatten daha kısa sürede hızla metabolize edilebilir. Ek olarak, glikojen kullanımı, bu prosedürü takiben glikoz açlığı koşulları altında hücre ölümüne karşı korur.Ayrıca, hücrelerdeki glikojen dağılımı gibi ek soruları yanıtlamak için elektron mikroskobu ve periyodik asit kayması boyama gibi yöntemler de uygulanabilir.

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, glikojen sentaz aktivitesinin tahmini için bir spektrofotometrik test açıklanmaktadır. Yöntem, zamanla NADH absorbansındaki azalmaya dayanır ve glikojen sentaz aktivitesini gösterir.

Glikojen sentaz aktivitesini belirlemek için spektrofotometrik test

Bu videoda, karakterize edilmemiş bir yapıya sahip bir glikojen numunesindeki dallanma derecesini belirlemek için kalitatif bir spektrofotometrik testi açıklıyoruz. Karakterize edilmemiş numunenin absorbans maksimumlarının bilinen dallı yapılara sahip polisakkaritlerinkiyle karşılaştırılması, karakterize edilmemiş numunede dallanmanın varlığını gösterir.

Glikojen dallanma derecesini ölçmek için glikojen dallanma deneyi

Periyodik asit Schiff boyama, dokuların polisakkarit içeriğini görselleştiren bir tekniktir. Bu makale, insan venöz kanından saflaştırılmış periferik kan mononükleer hücrelerinde kullanılmak üzere uyarlanmış periyodik asit Schiff boyama protokolünü göstermektedir. Bu tür örnekler, lenfositler ve bağışıklık sisteminin diğer beyaz kan hücreleri için zenginleştirilmiştir.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Burada, siyanobakteriyel hücrelerdeki glikojen içeriğini ölçmek için güvenilir ve kolay bir test sunuyoruz. İşlem, çökeltme, seçilebilir depolimerizasyon ve glikoz artıklarının belirlenmesini gerektirir. Bu yöntem hem vahşi hem de genetik mühendisliği yapılmış suşlar için uygundur ve siyanobakterilerin metabolik mühendisliğini kolaylaştırabilir.

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitesini ölçmek için teknikler, görünür aralıkta çalışan basit bir spektrofotometre kullanılarak sunulmaktadır.

Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Sükroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak karaciğer glikojeninin ekstraksiyonu için optimal bir sükroz konsantrasyonu belirlendi. Glikojen parçalayıcı enzimleri inhibe etmek için 10 dakikalık bir kaynatma adımının eklenmesinin faydalı olduğu kanıtlandı.

Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Hayvan dokusu tahlili, radyo etiketli glikozun glikojene dahil edilmesini ölçerek glikojen sentazın enzimatik aktivitesini belirlemek için nükleer sintilasyon tespitini kullanır.

Hayvan Dokusunda Glikojen Sentaz Enzim Aktivitesinin Radyokimyasal Değerlendirilmesi

Bu video, immunoperoksidaz tahlil olarak bilinen bir enzimatik antijen algılama tekniği kullanılarak virüslerin tespit edilmesi ve titering için alternatif bir yöntem gösteriyor. Burada, biz, nasıl virüs örnekleri toplamak için size göstermek için test hücreleri hazırlamak ve viral titresi belirlemek için seri dilüsyonları kullanarak nihayet immunoperoksidaz tahlil olacak.

Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon

Nöral tüp oluşumu sonra neuroepithelium daraltır ve tüp embriyonik beyin ventriküller oluşturmak için embriyonik beyin omurilik sıvısı (eCSF) ile doldurur katlanabilir. Biz daha iyi, canlı embriyo nöroepitelyal şekli aksine sıvı dolu boşluk görselleştirmek için bu ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi.

Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Öğrenin, hücre örneklerinde glikojenin biyokimyasal titrasyonunu floresan ölçümüyle gerçekleştirmeyi. Bu hassas yöntem, metabolik süreçlerde enerji depolama dinamiklerini araştıran bilim insanları için güvenilir bir araç sunar.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu

Daha fazla video keşfet