Non-invaziv Hipertermi Kanser Tedavisi için Altın Nanoparçacıklannm ve Biyolojik Sistemleri ile Radyofrekans Etkileşimleri değerlendirilmesi için Protokoller

Bu prosedürün genel amacı, altın nanopartiküllerin ısıtma özelliklerini 13.56 megahertz radyo frekanslı bir elektrik alanında, in vitro ve in vivo olarak değerlendirmektir. Bu, ilk olarak konsantre altın nanopartiküllerinin ısıtma hızının ve bunların bir kuvars veterinerinde tamponlarının değerlendirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kültürlenmiş kanser hücreleri ile altın nanopartiküllerin in vitro toksisite çalışmalarını gerçekleştirmektir.

Üçüncü adım, ektopik bir fare kanseri modelinde altın nanopartiküllerin in vivo çalışmalarını gerçekleştirmektir. Sonuç olarak, sonuçlar, araştırılan nanopartikülün, nanopartiküllerin süspansiyon, in vitro ve in vivo olarak analizi yoluyla RF aracılı hipertermi ile kullanılmak üzere etkili bir ajan olup olmadığını gösterebilir. Bu yöntem, nanopartikül aracılı non-invaziv radyofrekans hipotermi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin partiküllerin kendilerinden dolayı ısınma olup olmadığı ve terapötik amaçlar için kullanılabilir mi?

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bu tür deneyleri gerçekleştirmek için çok fazla köklü protokol olmadığı için mücadele edeceklerdir. Prosedürü göstermek, bir araştırma görevlisi olan Cisneros, doktora sonrası bir bilim adamı olan Stuart Core ve başka bir doktora sonrası bilim adamı olan Leila Green olarak markalanacak. Örnek olarak, beş nanometre çapında, ticari olarak satılan 500 mililitrelik bir şişe altın nanopartikül ile başlayın.

Stok altın nanopartikül çözeltisinden yaklaşık 125 mililitre alın ve altı adet 50 kilodalton santrifüj filtre tüpü arasında bölün, nano partikülleri 3000 RPM'de iki dakika ve beş saniye santrifüjleyin. Filtrelenmiş tampon olan süpernatanı çıkarın ve her filtreyi yeniden doldurun. Daha fazla stok çözümü ile.

Santrifüjlemeye ve tamponu çıkarmaya ve tüm nanopartikül çözeltisi filtrelenene kadar tüpleri yeniden yüklemeye devam edin. Son eklemeden sonra, filtrelenmiş tamponu benzer hacimde deiyonize su ile değiştirin ve filtrelenmiş tampon numunesini RF makinesine yükledikten sonra işlemi yaklaşık sekiz kez daha tekrarlayın. Kızılötesi kamera yazılımını kullanarak, ısıtma profilini yakalamak için QVE üzerinde kutular oluşturun Sekiz yıkamadan sonra, beş nanometre altın nanopartikül filtratının ısıtma verileri deiyonize suyunkine yaklaşıyor.

UV vis analizi, kirletici emilimini izlemek için de kullanılabilir. Zirve. Burada temiz bir spektrum gösterilmektedir. Tampon kirleticiler tamamen uzaklaştırıldıktan sonra, nanopartikülleri filtreden çıkaran filtre tüplerinde 0.5 mililitre deiyonize su içinde nanopartikülleri süspanse ediyoruz.

Ardından altı süspansiyonu da 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin. Şimdi, stabilite verileri için UV VIS ve zeta potansiyelini kullanarak numuneyi analiz edin. Nanopartikül konsantrasyonunu belirlemek için I-C-P-O-E-S ve/veya ICP kütle spesifikasyonunu kullanın.

SEM ve/veya TEM analizi, bir Kansas RF sistemi veya yük türevleri, 1.3 mililitrelik bir şırınga kuvars vete kullanarak morfolojik veriler elde etmek ve RF elektrik alanını, Q vete'nin bulunacağı havada metre başına yaklaşık 90 kilovolt olacak şekilde ayarlamak için de kullanılabilir. % 0.9 sodyum klorür içeren standart bir tuzlu su numunesi için, elektrik alanı metre başına yaklaşık 1.1 kilovolta düşürülecektir. Bunlar, farklı RF sistemleri arasında karşılaştırma yapılmasına izin vermek için kullanılan yaklaşık koşullardır.

Şimdi, litre başına 1000 miligram konsantrasyonda 1.3 mililitre saflaştırılmış altın nanopartikül süspansiyonu ile temiz bir kuvars vete yükleyin. Numuneyi 120 saniyelik bir süre boyunca veya numune 70 santigrat dereceye ulaşana kadar RF alanına maruz bırakın. Aşırı maruz kalma, elektrik arkına veya hızlı kaynamaya neden olabilir.

Bir IR kamera ve ilgili yazılımı kullanarak termal görüntüleme verilerini ve kontrol alanlarını yakalayın. Bu işlemi aynı numune üzerinde üç kez tekrarlayın. Şimdi altın nanopartikülleri su tamponundan çıkarmak için numuneyi başka bir 50 kilodalton santrifüj filtresinden süzün.

Ardından arabelleği tek başına RF alanına yeniden maruz bırakın. Yine, altın nanopartikül kolloid ile süzüntü arasındaki saat farkının üç katı, altın nanopartiküllerin kendilerinden kaynaklanan HR'yi belirler. Son olarak, daha fazla deney için kalan altın nanopartikülleri filtreden 1.3 mililitre su içinde askıya alıyoruz.

Bu in vitro çalışmalar, 2D tek tabakalar oluşturan her türlü kanser hücresi tipine uygulanabilir. Bu örnekte, insan hepatosellüler karsinomundan türetilen Hep üç B hücresi yaklaşık 50.000 hücreden oluşan bir plaka kullanılacaktır. Bir mililitre büyüme ile 12 oyuklu bir plakanın üç kuyusunda.

Ortam, nanoparçacık çalışmaları için üç plaka dolana ve kontrol olarak üç plaka doldurulana kadar hücreleri yüklemeye devam eder. Plakaları 24 saat boyunca 37,5 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, litre başına 1000 miligramlık bir altın nanopartikül çözeltisinin 0.1 mililitresini, üç nanopartikül plakasının her bir oyuğuna kontrol plakalarına ekleyin.

Her birine 0.1 mililitre su koyun, tüm plakaları 24 saat daha inkübe edin. 24 saat sonra, hücre ortamını aspire edin ve yüzeye bağlı altın nanopartikülleri çıkarmak için hücreleri PBS ile yıkayın. Ardından hücre ortamını değiştirin.

Hücreler artık RF'ye maruz kalmaya hazırdır. Her 12 kuyulu hücre paketini RF alanına yerleştirin ve hücreler 31 santigrat dereceye kadar soğuyana kadar bekleyin. Hafifçe soğuduktan sonra, hücreleri 3,5 dakika rf'ye maruz bırakın.

Hücre ortamının son sıcaklığı yaklaşık 37 santigrat derece olacaktır. Hücreleri bir inkübatöre aktarın ve analiz etmeden önce 24 saat bekleyin. Hücreler hazır olduğunda, ortamı aspire edin ve ortamdaki iki mililitre% 25 MTT reaktifi ile değiştirin.

Sonra hücrelerin dört saat daha kuluçkaya yatmasına izin verin. Ardından, MTT ortamını iki mililitre DMSO ile değiştirin. DMSO'nun MTT reaktiflerini çözündürmesine izin vermek için hücre plakalarını 10 dakika boyunca bir tezgah külbütörüne yerleştirin.

Son olarak, her bir oyuktan 100 mikrolitrelik numuneleri 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin ve plakayı 570 nanometrede optik olarak okuyun. Bu in vivo çalışmalar, ortotopik veya ektopik yansıtma modelinde katı tümörler oluşturan herhangi bir kanser türüne uygulanabilir. Bu örnekte, Hep üç B karaciğer kanseri hücresi BPC çıplak farelerle kullanılmıştır.

Yaklaşık 100.000 hücre ile başlayın, tripsin hücreleri buzlayın ve 25 mikrolitre başına 2 milyon hücrelik bir çözelti üretin. Hücre süspansiyonuna eşit miktarda buz gibi matri jel ekleyin ve bir pipette tekrar tekrar aspire ederek iyice karıştırın. Şimdi karışık süspansiyonu her hayvanın sırtına istenen pozisyonda enjekte edin.

Birkaç hafta sonra, tümörler bu süre zarfında yarım ila bir santimetre yuvarlak olacak, RF tedavisine başlayacak ve fareleri IP enjeksiyonu ile ketamin ve ksilazin çözeltisi ile uyuşturacak ve sıcak tutacaktır. Daha sonra altın nanopartikülleri, 27 veya 30 gauge iğne ile bir cc şırınga kullanarak doğrudan tümörlerin yarısına enjekte edin. Kanı emmek için cerrahi bir bez kullanın ve enjeksiyon bölgesini alkollü bir mendille silin.

Kontrol olarak, tümörlerin diğer yarısına sadece PBS enjekte edin. Şimdi, her gruptaki farelerin yarısını tedavi edin. Fareyi RF jeneratörünün alıcı kafasına monte edin ve gözler, kulaklar ve ayak parmakları dahil olmak üzere işlem görmeyen alanları bakır bantla koruyun.

Bu deneyin en önemli kısmı, farelerinizin uygun şekilde topraklanmasıdır. Uygun topraklama olmadan, hayvanlar üzerinde yük birikmesi termal veya elektrodermal yaralanmalara neden olabilir. Bu kolayca önlenebilir.

Tümörü, istenen tedavi bölgesinin genişliğinden en az bir santimetre daha fazla iletim kafasından uzaklaştırın. Şimdi, IR termal kamerayı tümör ve tedavi alanı görünecek şekilde konumlandırın. RF'yi beş dakika boyunca açın ve ortaya çıkan sıcaklık eğrisini kaydedin.

Cilt yüzey sıcaklığı 42 santigrat derecenin üzerine çıkarsa, RF'ye maruz kaldıktan hemen sonra tedaviyi durdurun. Farelerin bilinçleri yerine gelene kadar ılık bir odada iyileşmelerine izin verin. Tedavileri üç hafta boyunca haftada iki kez tekrarlayın.

Ardından, son RF maruziyetinden 48 saat sonra farelere ötenazi yapın ve tümörleri işleyin. Saflaştırılmış altın nanopartiküllerin RF ısıtması, aralarındaki ve arka plan deiyonize su tampon çözeltisi arasındaki saat farkı ile belirlendi. Sonuçlar hem beş nanometre hem de 10 nanometre nanopartiküller için beklendiği gibiydi.

İnsan hepatosellüler karsinomuna entegre edilen saflaştırılmış altın nanopartikülleri, Hep üç B hücresinden türetilmiştir. Bu tür hücreler bir RF alanına maruz kaldıklarında, genellikle içselleştirilmiş nanopartiküller olmadan RF'ye maruz kalanlardan daha az canlı hale gelirler. Şekil üç, kullanılan altın nanopartiküllerin kendi başlarına sınırlı toksisiteye sahip olduğu idealize edilmiş bir senaryoyu göstermektedir, ancak mükemmel RF tarafından başlatılan sitotoksik özellikler, çeşitli nanomalzeme türleri kullanılarak bugüne kadar in vitro sonuçların kapsamlı bir incelemesi için literatüre danışın.

Hep üç B. Karaciğer kanseri hücresi, babsi çıplak farelerin sırtında tümörler oluşturmak için kullanıldı. Bu tümörlere PBS süspansiyonlu altın nanopartiküller enjekte edildi ve ardından RF'ye maruz bırakıldı. Tedavi sonrası Thomas analizi, tedavinin tümör büyümesini kontrol ettiğini ve tümör kütlesini azalttığını ortaya koydu.

Bu videoyu izledikten sonra, in vitro ve in vivo olarak RF'ye duyarlı özelliklerini ve çözeltilerini belirleyerek RF aracılı hipotermide kullanım için nanopartiküllerin nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Yüksek güçlü RF elektrik alanlarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Aktif bir elektrik alanına asla dokunmayın veya uzanmayın.

Elektrik alanının ölçümlerini alın ve gerekirse Faraday kafesi gibi uygun bir koruma kullanın. Genel olarak, sürekli yüksek mukavemetli elektrik alanlarına maruz kalmanızı her zaman en aza indirin.