Geleneksel ve Holografik Optik Yakalama Yetenekleri ile bir Yüksek Çözünürlüklü Mikroskop İnşaatı
22 Nisan 2013
Burada açıklanan sistemi birden fazla tuzakları oluşturma ve manipüle yeteneğine sahip geleneksel optik tuzak yanı sıra bağımsız bir holografik optik yakalama çizgi, istihdam. Ayrıca biyolojik enzimlerin aktivitesini aynı anda yüksek hızlı, yüksek çözünürlüklü ölçümler izin ise bu kırma parçacıkların karmaşık geometrik düzenlemelerin oluşturulmasını sağlar.
Bu prosedürde, geleneksel ve holografik bir optik yakalama hattı monte edilir ve hizalanır Bunu gerçekleştirmek için önce optik bileşenlerin konumlarını ölçün, ardından bileşenleri uygun konumlarına güvenli bir şekilde monte edin. Ardından, yakalamaya izin vermek için optikleri hizalayın. Son adım, holografik aynadan gelen TED ışınını engellemektir.
Nihayetinde, bitmiş sistem aynı anda holografik ve sıradan yakalamaya izin verir. Bu tekniğin tek başına sıradan yakalama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, birden fazla kırılma nesnesinin üç boyutta aynı anda konumlandırılmasına ve hızlı nesne manipülasyon ölçümlerine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü tasarım, düzen ve hizalama zor olabilir.
Bu videonun başlangıç noktası, 980 nanometrede bir optik tuzak oluşturmak için mikroskobun yerinde olduğu bir optik tezgahtır. Bu dalga boyunun kolayca bulunabilen lazer diyotlarından biriyle başlayın. Bilinen mod alan çapına sahip tek modlu fiberi koruyarak polarizasyonlu bir domuz eğim lazeri kullanın.
Fiber, bir mod filtresi görevi görecek kadar uzun olmalı ve bir FCPC veya bir FCAC konektörüne sahip bir fiber kanal konektörü ile sonlandırılmalıdır. Tek modlu fiber optik dikkatli kullanılmalı, bükülmelerden kaçınılmalıdır. Güç ve sıcaklık kontrolüne izin veren lazer diyotu ve montajı sabitleyin.
Pasif ısı emiciyi en üst düzeye çıkarmak için montaj doğrudan optik tezgaha takılmalıdır. Ardından, fiber konektörü ışın harmanlama optiğine monte edin. Seçilen fiber bağlantı noktasının diyotun mod alanı çapıyla eşleştiğinden emin olun.
Pigtail fiber, ışın yönlendirme, genişleme ve diğer bileşenlerin yerleştirilmesine izin vermek için harmanlama adaptörünü mikroskoptan yeterli bir mesafede optik masaya takın. Çubuk renkleri, sağlam, tekrarlanabilir konumlandırma için lens aralığını sabitlemek için kullanılabilir. Mikroskoba giden genel ışın yolu ile karşılaştırılabilir mesafelerde tutarlı ışın atığı sağlamak için fiber bağlantı noktasını ayarlayın.
DDE lazer ışınının yolunda beş ayna vardır. Lazer dde'den başlayarak, çıktısını mikroskop muhafazasına yönlendirmek için iki ayna vardır. Işın ayrıca, lazer diyot ışınının 45 derecelik bir açıyla olay açısına kadar azalmadan iletilmesine izin veren dikroik bir aynadan geçmelidir.
Son olarak, görünür ışığı ileten, ancak yakın kızılötesi ve üzerini yansıtan iki ek kısa geçişli diic ayna. Işını mikroskobun içine ve dışına yönlendirin. Sonsuzluk alanı, aynaları ayarlamak, mikroskop objektifini çıkarmak için mikroskop muhafazasının içindedir.
Objektif montaj aşamasında ışını açıklıktan geçirmek için aynaları ve kızılötesi görüntüleme kartını kullanın. Işın merkezden uzaksa, ışın merkezde olacak şekilde hizalamayı sabitlemek için aynaları ayarlayın. Lensleri monte ederken, bir kafes sistemi sağlam bir montaja neden olabilir.
Kaliperler, kurulumdan önce kafes çubukları boyunca lensler arasındaki mesafeleri önceden ölçmek için kullanılabilir. Işını mikroskobun optik ekseni boyunca olacak şekilde objektifin yerine özel bir adaptöre sahip kırmızı bir lazer işaretçiyi geçici olarak monte edin. 980 nanometre ışın genişleticiyi yerleştirmek ve kabaca hizalamak için görünür lazer işaretçi ışınını kullanın.
Bu kurulum, ışın belini yaklaşık iki katına çıkarmak için keary düzenlemesinde 60 milimetre ve 125 milimetre odak uzaklığına sahip lensler kullanır. Ardından, işaretçi ışınını burada kılavuz olarak kullanarak 980 nanometre direksiyon lenslerini takın. Her lensin 60 milimetre odak uzaklığı yuvası vardır, ışın yönlendirmesine izin vermek için en az yarım inç hareket aralığına sahip hassas bir X, Y, Z aşamasında ışın yolundaki ilk lens.
İkinci lens artık ilk lensle bire bir keary düzenlemesi oluşturacak şekilde konumlandırılabilir. Bu lens, objektifin arka odak düzlemine optik olarak konjuge olacak şekilde konumlandırılmalıdır. Holografik tuzağı hazırlamak için, 1064 nanometre lazeri kabaca 980 nanometre ışının yüksekliğinde yükseltilmiş bir platforma monte edin.
Lazer çıkışından hemen sonra bir yarım dalga plakası ve polarizör yerleştirin. Lazer gücünün manuel olarak ayarlanmasına izin vermek için. Bu lazer için ışın genişleticiyi takın, böylece ışın atığı holografik aynanın diyagonal boyutuna uyacak şekilde genişletilir.
Alanla kısıtlıysa, burada 16 milimetre ve 175 milimetre gibi küçük odak uzaklığına sahip lensler kullanın. Şimdi, kullanılan ticari holografik paketin bir parçası olan uzamsal ışık modülatörünü veya SLM'yi konumlandırmak için lazer işaretçi ışınını kullanın. Bu deneyde, uzamsal ışık modülatörü, objektifin arka odak düzlemine optik olarak konjuge edilecek şekilde konumlandırılmalıdır.
Lazer işaretçi ışını mümkün olan en az olay açısına sahip olacak, ancak yansıması optik tabla üzerindeki tüm donanımı güvenli bir şekilde temizleyecek şekilde yerleştirin. Işığını uzamsal ışık modülatörüne yönlendirmek için 1064 nanometre lazer ışını genişleticinin önüne başka bir ayna yerleştirin. Lazer işaretçi ışığının ışın genişletici açıklığının ortasına çarptığından emin olun.
Son olarak, uzamsal ışık modülatörü ile dikroik ayna arasına bir teleskop merceği yerleştirin. Bu lenslerin odak uzaklıkları 125 milimetre ve 200 milimetredir. Lazer işaretçiyi çıkarın, özel adaptör montajını rota hizalama açıklığı olarak hizmet etmesi için bırakın.
Yalnızca 980 nanometre ışını kullanarak hizalamayı kontrol etmeye başlayın. 980 nanometre ışını, özel adaptördeki diyafram açıklığının merkez ekseni boyunca ilerleyecek şekilde hizalamak için bir kızılötesi kart görüntüleyici kullanın. Ardından, 1064 nanometre ışının, paylaşılan ışın yolu boyunca 980 nanometre ışınıyla aynı noktalara çarptığından emin olmak için kızılötesi kartı kullanın.
Bu yapıldıktan sonra, özel lazer işaretçi montaj adaptörünü yüksek sayısal açıklıklı bir yağ veya su objektifi ile değiştirin. Ardından, holografik ayna kapalıyken kamerada radyal olarak simetrik bir girişim deseni görülene kadar lazer ışınını yürüterek 980 nanometre tuzağını hizalayın. Uzamsal ışık modülatörünü ve UN DEFRACTED 1064 nanometre ışınını yürüten ilk dikroik aynayı kullanarak 1064 nanometre tuzağını hizalayın.
Bu örnekte, her iki bindirme için hizalanmış görüntü, verimli bindirme için iyi bir hizalamayı gösterir, ancak daha da iyileştirilebilir. Ayrıca, yuvarlak 1064 ışınla ilişkili, kare bir SLM aynasına çarpan ve lens hizalamasının rafine edilmesiyle kolayca ortadan kaldırılamayan küçük sapmalar da vardır. Uzamsal ışık modülatöründen etkisiz hale getirilen ışın tarafından üretilen tuzağı engellemek için, bu sistem için örnek düzleme eşlenik bir konumda, etkisiz ışığın yoluna küçük bir opak nesne yerleştirin.
Metal olan 100 ila 300 mikron çapında opak bir mikro küre, kızılötesi şeffaf yuvarlak bir cam kapak kızağına veya pencereye yapıştırılır. Blok, numune düzlemine optik olarak konjuge edilen lenslerin ortak odak noktasına yerleştirilir. Optik yakalama ışınları mikroskobun sonsuz uzayına enjekte edilirse, ışın engelleyici yarışsız ışığı engelleyecek şekilde konumlandırılabilir veya tüm ışığın geçmesine izin verecek şekilde hareket ettirilebilir.
Birleştirilmiş kurulum, operatörün birden fazla kırılma nesnesini gerçek zamanlı olarak yakalamasına ve bunları görüş alanındaki üç boyutta da konumlandırmasına olanak tanır. Burada, enstrümanın holografik yetenekleri, deiyonize suda asılı duran mikro kürelerin yakalanmasıyla gösterilir, kırmızı ve yeşil daireler tuzak konumlarını gösterir ve yeşil, bu klipte yeniden konumlandırma için seçilen bir tuzağı gösterir, bir nesne yakalandıktan sonra oynatma hızlandırılır. Tuzağı manuel olarak yeniden konumlandırılır.
Son düzenlemede, bu deneyin yapıldığı Utah Üniversitesi'nin logosunu gösteren 11 boncuk var. Sistem aynı zamanda hem holografik hem de konvansiyonel tuzakların bir arada kullanılmasına olanak sağlar. Burada iki sıra holografik tuzak tanımlanır ve operatör tarafından kontrol edilir.
İki sıra arasında ek bir geleneksel tuzak tanımlanır. Deiyonize suda asılı kalan mikroküre tuzaklar tarafından bağlanır. Merkez boncuk, maksimum 4.1 mikrometrelik bir uzamsal yer değiştirmeye hareket ettirilir ve daha sonra aynı koşullar altında orijinal konumuna geri çekilir.
Ancak merkez boncuk saniyede 82 mikrometre hızla hareket ederken, bu çerçeve dizisi üretilir. İkinci ve üçüncü görüntülerdeki hareket bulanıklığına dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, aynı kurulumda bağımsız holografik ve normal tuzak ile çift optik tuzak sistemini nasıl düzenleyeceğinizi ve hizalayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Yüksek güçlü lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve uygun koruyucu gözlük takmak gibi önlemler alın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, geleneksel ve holografik optik tuzaklama tekniklerini entegre eden ve birden fazla tuzağın manipülasyonunu sağlayan bir sistemi açıklar. Bu yenilikçi yaklaşım, kırıcı parçacıkların karmaşık geometrik düzenlemelerinin oluşturulmasını sağlarken, biyolojik enzim aktivitesinin yüksek hızda, yüksek çözünürlüklü ölçümlerini mümkün kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Optik tuzaklama
- Biyofizik
- Enzim aktivitesi ölçümü
Arka Plan
- Geleneksel optik tuzaklama yöntemleri, eş zamanlı olarak birden fazla nesneyi manipüle etme kabiliyetlerinde sınırlıdır.
- Holografik optik tuzaklama, parçacıkların konumlandırılması ve manipülasyonunda daha fazla esneklik sunar.
- Bu tekniklerin birleştirilmesi, ölçüm doğruluğunu ve hızını artırabilir.
- Yeni kullanıcılar, optik bileşenlerin tasarımı ve hizalaması konusunda zorluklarla karşılaşabilir.
Çalışmanın Amacı
- Eş zamanlı geleneksel ve holografik optik tuzaklama sağlayan bir sistem geliştirmek.
- Üç boyutta birden fazla kırıcı nesnenin manipülasyonunu sağlamak.
- Biyolojik enzim aktivitesinin hızlı ölçümlerini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Optik tuzaklama bileşenlerinin montajı ve hizalanması.
- Optik bileşenlerin yerlerinin ölçülmesi.
- Bileşenlerin belirli konumlara güvenli bir şekilde montajı.
- Etkili tuzaklama sağlamak için optiğin hizalanması.
Ana Sonuçlar
- Sistem, geleneksel ve holografik tuzaklama tekniklerini başarıyla entegre eder.
- Birden fazla kırıcı nesnenin eş zamanlı konumlandırılmasını sağlar.
- Enzim aktivitesinin yüksek hızda ölçümleri gerçekleştirildi.
- Kullanıcılar, başlangıç kurulumunda zorluklarla karşılaştı ancak sistemin avantajlarını fark ettiler.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş sistem, optik tuzaklama tekniklerinin yeteneklerini artırır.
- Biyolojik süreçleri inceleyen araştırmacılar için önemli avantajlar sağlar.
- Yeni kullanıcıların kurulumu ustalaştırmak için daha fazla eğitim gerekebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Optical trapping systems enable precise manipulation of refractive objects for high-resolution force and motion measurements at nanometer and piconewton scales. Integrating conventional and holographic trapping allows simultaneous multi-object positioning and real-time 3D control, supporting mechanistic studies of molecular interactions and cellular mechanics. This capability enhances predictive confidence in target validation by enabling quantitative assessment of binding forces and conformational changes under physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of molecular binding forces and complex formation dynamics.
- Operational Value: Provides functional target validation by measuring piconewton-scale forces generated by molecular motors or enzyme activity in real time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative force-displacement data that correlates with target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling controlled manipulation of dielectric beads or cellular organelles as force sensors.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through precise positioning and simultaneous readout of trap position relative to object motion.
- Scalability: Supports screening readiness via holographic pattern generation for parallel trapping of multiple objects in the field of view.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by enabling measurement of nanoscale mechanical properties in primary cells or tissue-derived models under near-physiological conditions.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery observations to preclinical validation through force-production readouts that inform target modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying how perturbations affect mechanical output in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative biophysical readouts that inform target prioritization and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct measurement of intermolecular forces and conformational changes in protein complexes.
- Screening: Delivers assay readiness through high-speed, high-resolution position tracking of trapped objects, facilitating reliable compound evaluation via force-based readouts.
- Analytics: Generates nanometer-scale displacement and piconewton-force measurements that allow teams to compare conditions and assess target modulation efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling mechanical phenotyping in disease-relevant cellular systems, supporting biomarker alignment for mechanotransduction pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multi-parametric analysis across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team standardization of force measurement protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct, label-free measurement of mechanical outputs that reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability via holographic trapping patterns and simultaneous multi-object control, improving throughput in force measurement campaigns.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets through quantitative force data, reducing late-stage failure due to unanticipated mechanical liabilities.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering objective, quantitative data on target engagement strength and conformational dynamics across candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and beam path optimization for dual-wavelength trapping systems.
- Depends on stable optical bench infrastructure, precision translation stages, and infrared-compatible components for 980 nm and 1064 nm laser integration.
- Necessitates cross-team standardization of trapping protocols, calibration procedures, and data analysis pipelines for force and displacement readouts.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-based assays to primary cells or tissue explants due to varying refractive indices and sample viability constraints.
- Limited by alignment complexity and potential aberrations from mismatched beam profiles, particularly when holographic patterns interact with spatial light modulator geometry.
