Name: Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Öğrenin fare M. cremaster mikrosirkülasyonunda intravital mikroskopi ile kök hücre-endotelyal hücre etkileşimlerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik rejeneratif tıpta hücre göçünü canlı organizmada incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hücre izolasyonu sonra tüm protokol, yaklaşık olarak 2 saat sürer. 1.. Mikrocerrahi Hazırlık <ol><li> 9,12 hücreler, hayvan işlem gerçekleştirilir süre boyunca dinlenmeye bırakın standart protokollere göre vericinin kemik iliği ve izole edilmiş alt populasyonun floresan etiketleme kök hücre izolasyon yapın. Floresan etiketleme için biz CFDA (Carboxyfluorescein diasetate succinimidyl ester) öneririz. </li><li> Ketamin (75 mg / kg) ve ksilazin (2.5 mg / kg) ile, 20-25 g ağırlığında, erkek fare anestezisi. (Genellikle her 30-60 dk) gerektiği gibi cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi takviyeleri (ilk enjeksiyon% 10, ip) muhafaza edilmelidir. </li><li> Yavaşça sağ skrotum ön yönü yanı sıra sağ uyluk ve kasık tıraş. Tüm nemlendirilmiş pamuklu çubukla saç kaybetmek toplayın. Pleksiglas görüntüleme sahnede fare ventral yüzü yukarı yerleştirin ve ücretini saptamakelastik örtü kullanarak t. Sahne bacak ve skrotum hem yüksekliği için taban plakasının kaudal kenarında bir taban plakası ve bir ikinci levha içeren, özel yapılır. 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin sahne Sahnede tespit sonra, operasyon mikroskobu altında hayvan koyun ve 10 kullanılarak aşağıdaki işlem adımları gerçekleştirin - 16 kat büyütme. </li><li> Kasık kadar sağ uyluk, diz femoral damarların sadece anterior cilt makas kullanarak ilk kesi olun. </li><li> Femoral arter tespit ve yumuşak doku çevreleyen arter seferber, proksimale izleyin. Belirlemek ve thermocautery kullanarak sol testis büyük bir dalı kesti. Bundan sonra sol testiste yüzeysel bir konaklama dikiş yerleştirin. Nazik çekiş femoral arter daha yakın seferber kolaylaştıracaktır. </li><li> Proksimal harekete tamamlanmasından sonra, tespit etmek ve büyük bir dal çalışan kesme MEDIALLthermocautery tarafından uyluk y. Bundan sonra sağ uyluk distal kısmında femoral arteri bağlayın. Bağı nazik traksiyon daha hazırlanmasına yardımcı olacaktır. </li><li> Yine proksimal femoral arter şimdi dikkat ters çevirin ve proksimale mümkün arter çevresinde bir dikiş yerleştirin. Bir düğüm hazırlayın ancak henüz aşağı kravat yok. Sütür hafifçe çekin ve bir arteriyel dolaştırmaktan oluşturun. </li><li> Dolaştırmaktan kurduktan sonra, arter dikkatli bir microscissor kullanıyor deşmek. Femoral ven zarar vermemek için özel dikkat gösterin. </li><li> Insizyon ile hazırlanmış bir mikrokateter (iç çapı 0.28 mm) takın. Kateter (% 0.9 sodyum klorür, NaCl) deaired ve 1 ml&#39;lik bir şırınga, sokulmadan önce bağlanmalıdır. </li><li> Kateterin başarılı yerleştirilmesinden sonra, dikkatli bir şekilde, kateterin geçişini kolaylaştırmak için bir dolaşması gevşetin. Arteryal kan akımı, kateter içinde hemen görünür olmalıdır. Kateter yavaşça birkaç milimetre ilerlemekönceki dolanma ötemde. Bundan sonra, kateter tespiti için hazırlanan ligatürün aşağı kravat. </li><li> Yavaşça doğru konumunu onaylamak için kateter (% 0.9 NaCl) ve aspire yıkayın. Bundan başka, işlem aşamasına kateteri sağlamak için bir parça bant kullanın. </li><li> Yeterli Tespit edildikten sonra, Cremaster&#39;ın kas aşağıdaki adımları hazırlanması için bir kenara kateter koydu. Pıhtı oluşumunu önlemek için normal yıkama ve kateter, her 5-10 dk aspirasyonunun uygulanır. </li><li> Sağ testis şimdi dikkat açın ve sağ skrotum ventral yukarıda cilt ve fasya kesim tarafından bir kesi yapmak. Herhangi aletleri ile altta yatan doku dokunmamaya özen gösterin. </li><li> Kadar inguinal kat ve kaudal skrotum uzak ucuna kesi uzatın. </li><li> Dokunmadan Cremaster&#39;ın çuvalın üzerinde dikkatle ayrı yatan yumuşak ve bağ dokusu. Cremaster&#39;ın uzak ucunu belirlemek ve sl burada bir konaklama sütür koyunightly kas uzanır. Yavaşça kaudal ve öne kas çekerek kas çuval altında artık kalan yumuşak doku rezeke. </li><li> Bağ dokusundan tam ayrılmasından sonra, makas kullanılarak kraniyal kenarında bir noktada Cremaster&#39;ın çuval açın. Kas uzak ucuna bu açıklıktan aşağı kesi uzatın. </li><li> Sonra makas kullanarak kas ve testis arasında kalan bağlantıları kesilmiş, thermocautery kullanarak testisi ve Cremaster&#39;ın bağlayan küçük bir gemi Seal. </li><li> Mikroskop alanının dışında, testis kenara koymak. </li><li> Açıldı Cremaster&#39;ın artık sahnede düz bırakır. Cremaster&#39;ın kas dokusu yaymak amacıyla doku kenarlarında dört 6-0 Prolene kalmak sütür koyun ve elastik örtü ile onları düzeltmek. Şu andan itibaren sürekli bir 1 ml şırınga (Şekil 1) kullanılarak, fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doku ıslatın. </li><li> Artık, 15 dakika boyunca geri kalanı için hazırlık izin verin. Bundan sonra enjekteMikro damarların kontrast için sol femoral arter yoluyla,% 1 Rodamin-dekstran 0.05-0.1 ml. Herhangi bir kemokin veya inflamatuvar ajanlar uygulaması için planlanan ise, şimdi topikal 1 ml şırınga kullanarak ilgili reaktif ile kas nemlendirin gerekir. Bir kontrol deneyi durumunda, PBS ile nemlendirme devam etmektedir. </li></ol> 2. İntra vital mikroskopik <ol><li> Işletme aşamasında sabit fare tutmak ve epi-aydınlatma için modifiye edilmiş ve bir CCD (şarj bağlı cihaz) video kamera bağlanmış bir floresan mikroskop altında hareket. Femoral arter kateteri yerinden değil özel özen gösterin. </li><li> Bir suya daldırma objektif kullanarak deneyler. </li><li> Cremaster&#39;ın mikrodolaşımında yeterli görselleştirme ve hücre enjeksiyonu öncesi hedefi ayarladıktan sonra, davranışsal firma kök hücre bağlılık daha sonra analiz için altı postkapiller venüllerinde tanımlar. </li><li> Floresan etiketli kök hücreleri yönetmek,Femoral arter kateteri kullanılarak beş ardışık enjeksiyonları toplam bir 1 ml şırınga ile, enjeksiyon başına 0.4 x 10 6 hücre, 200 ul PBS içinde çözülmüştür. Dikkatle önce ilk enjeksiyondan hücre örneği sallayın. </li><li> Record kök hücre böylece tipik bir hücresel birlikte endotel hücre astar boyunca bir hız daha fazla% 50 azalma olarak &quot;pano&quot; tanımlayan hücre enjeksiyonundan hemen sonra haddeleme &quot;çubuğu ve serbest&quot; hareketleri. Haddeleme kök hücre sayma ve her enjeksiyonunu takiben gözlem 1 dakika boyunca önceden tanımlanmış bir venüler mesafeyi geçen tüm kök hücreleri gerçekleştirin. Kök hücre haddeleme miktarı her geçen hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. Haddeleme hücreleri gibi rasgele kısa bağlama olayları sergileyen hücreler sayılmaz. </li><li> Son hücre enjeksiyon sayılması ile sıkıca yapışık kök hücre sayısını belirlemek ve th hesaplanan endotel yüzeyine göre miktarı ifade izlenerekE önceden tanımlanmış altı venüller (çap x uzunluk x π) yapışık hücre / mm 2 olarak. Hiçbir hücre hareketi, 30 saniye için tespit olduğunda Firma yapışma olarak kabul edilir. </li><li> Intravital mikroskopi tamamlanmasından sonra dikkatlice Cremaster&#39;ın kas kaldırmak ve daha sonra analiz (immünhistokimya veya moleküler biyoloji) yazışmanın içinde saklayın. Servikal dislokasyon ile hayvan kurban. Kök hücre haddeleme ve sağlam endotel yapışma, yanı sıra kırmızı kan hücresi hızı (mm / sn), damar uzunluğu (um), damar çapı (mikron), duvar payı oranı olarak mikrovasküler hemodinami, ölçümü için intravital mikroskopi kayıtların analizi (sn -1); bir görüntü işleme yazılımı kullanan ilgili deneysel doku tedavisi bilmeyen bir araştırmacı tarafından çevrimdışı yapılmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
<li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+stem+cells+find+their+way+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">How do stem cells find their way home?</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li>
<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Endosc%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874(2011).</li>
<li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha%2FCXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit%2B+bone+marrow+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB-1+induces+c-kit%2B+cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

Bu yazının için yapılan tüm hayvan deneyleri, yerel hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır. Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

<html> Intravital floresan mikroskopi doğrudan görselleştirme ve kök hücre-endotel etkileşimleri kantitatif analiz için izin verir. Mikrocerrahi teknikleri maruz kalma ve intravital görselleştirme de lökosit-endotel etkileşimleri ve çeşitli kimyasal bileşenlerin üzerinde yapılan araştırmalar sırasında seçici olarak basit bir teknik ile süperfüzyon hedef dokuya uygulanabilir kurulmuştur yana Cremaster&#39;ın kas modeli, özellikle yararlıdır. Nedeniyle hareket artefaktları ve ağır görüntü gürültü yokluğunda için, bu model,...

Bu makalenin amacı, periferik kemik iliği kök hücre göçü doğrudan gözlem ve analiz için fare Cremaster&#39;ın mikrosirkülasyonda uygulanan intravital mikroskopi tekniği (IVM) tanımlamaktır. Kök hücre mevcut kavram tabanlı doku ve organ yenilenmesi yaralı dokuya 1 kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin homing içerir. Başarılı bir kök hücre göçü için önemli bir adım transendotelyal göç ve sonunda organı engraftment 2 tarafından takip yaralanan organ içinde yerel endotel ile hücre etkileşimini kök içermektedir. Bu kök hücre Intravital analizi - endotel hücre etkileşimleri in vivo olarak farklı patofizyolojik ortamlarda bir kök hücre tabanlı rejeneratif tepkisinin ölçümü için ideal bir parametre oluşturur. Bundan başka, bu akla görünüyor ki, gelecekte belirli kök hücre p göç kapasitesinin intravital analizistandardize mikrosirkülatuar ortamlarında opulations, önce başka klinik testler için bu popülasyonları ilerleyen uygulanan olabilir. İntra vital mikroskopik ilk olarak enflamatuar araştırma 3 alanında, in vivo olarak lökosit-endoteliyal hücre etkileşiminin gözlenmesi ve ölçümü için geliştirilmiştir. Intravital mikroskopi çalışmaların ilk başarılı kayıtları bir ışık mikroskobu altında 4 kurbağaların dilleri ve mesentere okuyan, 19. yüzyılda zaten Cohnheim tarafından bildirilmiştir. Ilk kullanım IVM büyük bir teknik gelişme ve bugün uğramıştır yana bazı temel bileşenleri kantitatif IVM gerçekleştirmek için, ön koşullar meydana getirir: (i) ya da doku, optik erişim izni preparasyonlar, (ii) bir mikroskop ile tespit edilebilir, moleküler problar, (iii ) bir algılama sistemi ve görüntü verilerinden ilgi parametreleri özü (iv) bilgisayar destekli analiz sistemlerine bağlı bir mikroskop4. set. Doku preparatlarının çeşitli mesentere ve fare ve sıçan 5, 6 ve fare, hamster, tavşan kulak ve birkaç isim Hamster yanak kese dorsal Deri kıvrım odalarının karaciğer de dahil olmak üzere IVM çalışmalar için getirilmiştir. Ancak, hazırlık ve görselleştirme iyi standardize cerrahi işlemin mümkün olduğu kadar aşağıda biz intravital gözlemleri için ideal doku temsil fare Cremaster&#39;ın kas, üzerinde durulacak, ve genel olarak hareket eserler hiçbir sorunlar oluşur. Açık Cremaster&#39;ın kas hazırlık Baez tarafından 1970&#39;li yıllarda ilk kez gerçekleştirilen ve arkadaşları 7. oldu. Başlangıçta tarif edilen fareler için, bu fare 8 de başarılı bir şekilde kabul edilmiştir. Önceki çalışmalarda ağırlıklı olarak damar duvarı ile lökosit etkileşimlerine odaklanmış ettikten sonra, kendi grubu son bir değerleme olarak fare Cremaster&#39;ın kas hazırlık tanıttıdoğrudan görselleştirme ve tanımlanmış bir mikro 9 içindeki kök hücre-endotel etkileşimleri kantitatif analiz için ble aracı. Çeşitli kök hücresi alt-popülasyonları murin c-kit + kemik iliği kök hücre ve mezenkimal kök hücreleri, hem de insan CD 133 + kemik iliği kök hücreleri, 10-12 de dahil olmak üzere, bu model kullanılarak incelenmiştir. Vericinin kemik iliği ve görselleştirme için floresan etiketleme hücre izolasyonu takiben, kök hücreler selektif bir şekilde uzak organlardaki içinde herhangi bir cep tutulmasının önüne, femoral arter yoluyla arteriyel enjeksiyonu kullanan Cremaster&#39;ın mikrosirkülasyondaki içine uygulanır. Potansiyel olarak ilgili ayarları içinde yerel kök hücre göçü aracılık çeşitli kemokinler, topikal basit süperfüzyon tekniği ile hedef dokuya uygulanabilir Bundan başka, Cremaster&#39;ın kas modeli özellikle yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>Karboksi-floresein diasetat süksinimidilester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G (% 1)</td><td>Sigma-Aldrich, Münih, Almanya</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Almanya</td><td>mevcut</td><td></td>değil</tr><tr><td>Xylacin (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Almanya</td><td>mevcut</td><td></td></tr> <tr><td>değilDulbecco'nun Fosfat - tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Almanya</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

periferik kök hücre göç analizi fare cremaster muscle mikrosirkülasyon intravital mikroskopi

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Rejeneratif hücre tedavisinin bağlamında intravasküler hücre uygulama protokolleri çağında, doku nonmarrow için kök hücre göçünün altında yatan mekanizmaları tamamen açıklığa olmamıştır. Burada in vivo çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için fare Cremaster&#39;ın mikro uygulanan intravital mikroskobu tekniğini tarif eder. M. Cremaster&#39;ın Intravital mikroskopi önceden vasküler endotel ile lökosit etkileşiminin doğrudan gözlem için inflamatuar araştırma alanında girmiştir. Yeterli periferik kök ve progenitör hücre göçü bu endotel ile intravasculary uygulanan kök hücre etkileşim gözlem ve ölçümü için M. Cremaster&#39;ın modeli uygulamak için düşünülebilir astar endotel yanlarında ve sağlam yapışma haddeleme benzer ilk adımları içerdiğinden. Çeşitli kimyasal bileşenlerin seçici olarak hedef t uygulanabilir gibiBasit süperfüzyon teknikleri ile sorun, bu kemik iliği dışında yaşayan organizmada gerçekleşecek ilk kök hücre toplanması için, gerekli microenvironmental önkoşullar kurmak mümkündür.

Genel olarak, doğrudan bir etkileşim Cremaster&#39;ın kas mikro dolaşımı içinde vasküler endotelyum ile kök veya projenitör hücreleri enjekte edilen bir nadir bir olaydır ve kılcal damarlar (çap: 30-80 um) içinde özel olarak ortaya çıkar. Dolayı floresan etiketleme haddeleme ve sıkıca yapışık kök hücreleri net bir şekilde (Şekil 2) gözlenen venüllerde lökosit endojen dolaşan ayrılmasında belirlenebilir. Kan akım hızı ve duvar kayma hızı ile temsil mikrosirkülatuar koşulları ...

Fare M. Cremaster&#39;ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Bu prosedürün genel amacı, kök hücre ile endotel hücre etkileşimlerini in vivo olarak görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle intraarteriyel erişim için sedate edilmiş bir hayvana femoral arter kateteri yerleştirilerek gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, intravital floresan mikroskopi için krema kası cerrahi olarak hazırlanır.Ardından, hedeflenen kök hücre popülasyonu femoral arter kateteri aracılığıyla enjekte edilir. Nihayetinde, adoptif olarak transfer edilen kök hücreler ile ana kas mikrosirkülasyonu endoteliyumu arasındaki etkileşimler görselleştirilebilir ve nicelendirilebilir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanındaki, terapötik olarak uygulanan kök hücrelerin canlı bir organizma içindeki migrasyonunun nasıl düzenlendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Mikrocerrahiye başlamadan önce, bir mililitrelik şırıngaya bağlı bir kateter %0.9 sodyum klorür ile doldurulur. Ardından, anestezi uygulanmış 20 ila 25 milligram ağırlığındaki erkek farenin sağ skrotumunun anterior kısmının yanı sıra sağ uyluk ve kasık bölgesi nazikçe tıraş edilir. Gevşek tüylerin tamamı nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla toplanır ve ardından fare, bir taban plaka ile her iki arka bacağın ve skrotumun yükseltilmesi için taban plakanın kenar kısmında bulunan ikinci bir plakadan oluşan, özel yapım pleksiglas bir görüntüleme sahnesine ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirilir.Ayaklar elastik bir örtü ile sabitlendikten sonra, hayvanın vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için sahneyi bir ısıtıcı ped üzerine yerleştirin. Ardından, 10 ila 16 kat büyütme kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu ve bir makas yardımıyla, sağ uylukta, dizden kasığa kadar femoral damarların hemen ön kısmından ilk insizyonu yapın. Femoral arteri tanımlayın ve arteri çevreleyen yumuşak dokudan mobilize ederek proksimal yönde takip edin.Ardından termokoter kullanılarak, sol testise giden büyük bir arter dalı belirlenir ve kesilir. Sol testise yüzeysel bir 6-0 prolene tutma süturu yerleştirilir. Sonrasında, uylukta medialde seyreden büyük arter dalı belirlenir ve termokoterize edilir.Ardından, hafif bir traksiyon uygulayarak sağ uyluğun distal kısmındaki femoral arteri ligatize edin ve ardından proksimal femoral arterin etrafına, hayvanın merkezine mümkün olduğunca yakın bir noktadan bir sütür yerleştirin. Şimdi, femoral arterin etrafına gevşek bir düğüm atın ancak düğümü sıkmayın. Daha sonra, arteriyel kıvrılma (kinking) oluşturmak için sütüre hafif bir traksiyon uygulayın.Kinkleme işlemi tamamlandıktan sonra, femoral vene zarar vermemeye özellikle dikkat ederek, arteri dikkatlice boyutlandırmak için bir mikro makas çifti kullanın. Ardından, önceden hazırlanmış mikrokateteri insizyona yerleştirin. Kateterin geçişini kolaylaştırmak için kinklemeyi dikkatle gevşetin.Arteryal kan akışı kateter içerisinde hemen görünür olmalıdır. Kateteri, önceki kıvrılmanın birkaç milimetre ötesine yavaşça ilerletin. Ardından, kateterin sabitlenmesi için hazırlanan ligatürü bağlayın.Şimdi kateteri sodyum klorür ile nazikçe yıkayın ve ardından kateterin doğru konumda olduğunu onaylamak için solüsyonu aspire edin. Kateteri operasyon tablasına daha iyi sabitlemek için bir parça bant kullanın. Kateter yeterince sabitlendikten ve kenara çekildikten sonra, sağ skrotumun ventral kısmının üzerindeki deri ve fasyayı kesin.Herhangi bir aletle alttaki dokuya temas etmemeye dikkat edin. İnsizyonu kasık katlanma noktasına kadar uzatın ve skrotumun distal ucuna kadar dikkatlice ilerletin. Ardından, dokunun kendisine temas etmeden, kremaster torbasının üzerindeki yumuşak dokuları ve bağ dokularını dikkatlice ayırın.Ardından, kası hafifçe germek için kremasterin distal ucuna 6-0 prolene stay sütur yerleştirin. Sonra, kas kesesinin altındaki kalan yumuşak dokuyu rezeke etmek için kası nazikçe koddal ve anterior yönde çekin. Bağ dokudan tamamen ayrıldıktan sonra, bir makas yardımıyla kremaster kesesini kranial kenardan açın ve insizyonu bu açıklıktan kasın distal ucuna kadar uzatın.Kremaster üzerindeki testisle bağlantılı küçük damarı termal koterizasyonla yaktıktan sonra, kas ile testis arasındaki kalan bağlantıları kesmek için makas kullanın. Açılan kremaster artık sahne üzerinde düz bir şekilde yatacaktır. Şimdi dokunun kenarlarına dört adet altı sıfır prolene Stay dikişi yerleştirin ve bunları elastik örtü ile sabitleyin.Bu noktadan itibaren kremaster kas dokusunu yaymak için, dokuyu PBS ile sürekli olarak nemlendirmek üzere bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Preparat 15 dakika dinlendikten sonra, mikrovaskülatürün kontrast artırımı için sol femoral arter üzerinden 0,05 ila 0,1 mililitre %1 rodine dekstrin enjekte edin. Şimdi, fareyi ve sahneyi bir şarj bağlı aygıt (CCD) altına yerleştirin.Femoral arter kateterini yerinden oynatmamaya özel dikkat ederek, epi aydınlatma için modifiye edilmiş, video kamerası bağlantılı floresan mikroskobu kullanın. Su daldırma objektifini, chma mikrosirkülasyonunun yeterince görüntülenmesi için ayarladıktan sonra, kök hücrelerin sıkı adezyonunun daha sonra analiz edilmesi amacıyla stokastik olarak tanımlanmış altı postkapiller ES belirleyin. Ardından, bir mililitrelik şırıngayı daha önce etiketlenmiş 200 µL floresan donör kemik iliği kök hücresi ile doldurun.Hücre süspansiyonunu yeniden dağıtmak ve askıya almak için şırıngaya hafifçe vurun, ardından hücreleri femoral kateter aracılığıyla, toplam beş ardışık enjeksiyon şeklinde 40 µL'lik enjeksiyonlarla uygulayın. Hücre enjeksiyonundan hemen sonra kök hücre yuvarlanmasını kaydedin. Yuvarlanma, endotel astarı boyunca hücre hızının %50'den fazla azalması ve bununla birlikte tipik hücresel yapışma ve bırakma hareketlerinin görülmesi olarak tanımlanır.İntravital mikroskopi tamamlandıktan sonra, kremaster kasını dikkatlice çıkarın ve daha sonraki analizler için saklayın. Genel olarak, doğrudan enjekte edilen kök veya progenitör hücrelerin kremaster kası mikrosirkülasyonundaki vasküler endotel ile etkileşimi nadir bir olaydır ve floresan etiketleme sayesinde yalnızca postkapiller venüllerde meydana gelir. Siyah ok ucuyla belirtilen yuvarlanan hücreler ve beyaz oklarla belirtilen sıkıca yapışmış kök hücreler, venüllerde dolaşan endojen lökositlerden net bir şekilde ayırt edilebilir.Kan akış hızı ve duvar kayma hızı ile temsil edilen mikrosirkülasyon koşulları, genellikle farklı kemokin tedavisi uygulanan ilgili deneysel gruplar arasında önemli ölçüde farklılık göstermez. Ker master kas dokusunun farklı kemokinler veya enflamatuar yanıt mediyatörleri ile lokal tedavisi. Örneğin, stromal hücre kaynaklı faktör bir alfa veya tümör nekroz faktörü alfa, spesifik mikroçevresel koşulları taklit edebilme kapasitesine sahiptir.Bu tür koşullar, uygulanan spesifik kemokin veya medyatöre ve enjekte edilen kök hücre popülasyonuna bağlı olarak, kök hücre-endotel hücre etkileşimlerini farklı derecelerde artırır. Bu videoyu izledikten sonra, CreER kas mikrosirkülasyonunun intravital mikroskopisi aracılığıyla kök hücre ve endotel hücre etkileşimlerinin in vivo olarak nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikrodolaşımında gözlem için yeni bir çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bu uzun vadeli bir gözlem için uygun olduğu düşünülen ve pharmacophysiological veya moleküler biyolojik müdahaleler ile birlikte.

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Bir doku hazırlanması, görselleştirme ve yaşam mikrosirkülasyon deneysel manipülasyon için tarif edilir. Anestezi erkek farelerde, ince, yüksek vaskülarize Cremaster'ın kas arteriol, kapiller ve venüllerde mikrovasküler ağları da dahil olmak üzere çalışma intravital mikroskopi için hazırlanmıştır. Bu preparat, sıçan ve hamster için kolayca adapte.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Microiontophoresis mikropipet içi ve dışı arasındaki elektriksel potansiyel bir fark yanıt mikropipet iyonların hareketi gerektirir. Biyolojik aktif molekülleri böylece elektrik akımı ile orantılı olarak teslim edilir. Biz mikrosirkülasyon endotel bağımlı vazodilatasyon çalışma mikromanipülasyon ile birlikte asetilkolin microiontophoresis göstermektedir.

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Kremasterik mikrosirkülasyonda postkapiller venüllerde Dijital intravital Epifloresans mikroskopi lökosit-endotel etkileşimi içgörü kazanmak için uygun bir...

Sıçan Cremaster&#39;ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Farelerde mezenter damarlarının intravital mikroskopisinin bu basitleştirilmiş uygulaması, lökosit-endotel ve trombosit-lökosit etkileşimlerini gözlemlemek için farklı inflamasyon modellerinde kullanılabilir.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Öğrenin fare M. cremaster mikrosirkülasyonunda intravital mikroskopi ile kök hücre-endotelyal hücre etkileşimlerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik rejeneratif tıpta hücre göçünü canlı organizmada incelemeye olanak tanır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

Daha fazla video keşfet