Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, kök hücre endotel hücre etkileşimlerini in vivo olarak görselleştirmektir. Bu, önce intra arteriyel erişim için sedasyonlu bir hayvana e femoral arter kateteri sokularak gerçekleştirilir. İkinci adımda, kroma kası intravital floresan mikroskobu için cerrahi olarak hazırlanır.

Daha sonra, ilgilenilen kök hücre popülasyonu femoral arter kateteri yoluyla enjekte edilir. Sonuç olarak, evlat edinilerek transfer edilen kök hücreler ile ana kas mikrosirkülasyonunun endotelyumu arasındaki etkileşimler görselleştirilebilir ve ölçülebilir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanında, terapötik olarak uygulanan kök hücrelerin göçünün canlı bir organizma içinde nasıl düzenlendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Mikrocerrahiye başlamadan önce,% 0.9 sodyum klorür içeren bir mililitrelik şırıngaya bağlı bir kateter hava. Daha sonra sağ testis torbasının ön tarafını, 20 ila 25 miligram anestezi uygulanmış bir erkek farenin sağ uyluğunu ve kasıklarını nazikçe tıraş edin. Tüm gevşek saçları nemli bir pamuklu çubukla toplayın ve ardından farenin ventral tarafını yukarı bakacak şekilde, her iki arka bacağın ve skrotumun yükseltilmesi için taban plakasının alt kenarında bir taban plakası ve ikinci bir plakadan oluşan pleksiglas, özel yapım bir görüntüleme aşamasına yerleştirin.

Ayakları elastik bir örtü ile sabitledikten sonra, hayvanın vücut ısısını 37 santigrat derecede tutmak için sahneyi bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. Daha sonra 10 ila 16 kat büyütme kullanarak, sağ uylukta, dizden kasıklara kadar femoral damarların hemen önünde ilk kesi yapmak için bir diseksiyon mikroskobu ve bir makas kullanın. Femoral arteri tanımlayın ve proksimal olarak takip edin, arteri çevredeki yumuşak dokudan mobilize edin.

Daha sonra termo koter kullanarak, sol testise giden büyük bir arteriyel dalı tanımlayın ve kesin. Sol testise yüzeysel olarak altı oh prolene stay sütür yerleştirin. Daha sonra uylukta medial olarak uzanan büyük arteriyel dalı tanımlayın ve termo koterize edin.

Daha sonra, hafif çekiş kullanarak, sağ uyluğun distal kısmında femoral arteri serbest bırakın ve ardından proksimal femoral arterin etrafına hayvanın merkezine mümkün olduğunca yakın bir dikiş yerleştirin. Şimdi, femoral arterin etrafına gevşek bir düğüm yerleştirin, ancak bağlamayın. Ardından, arteriyel bir bükülme oluşturmak için dikişe hafif bir çekiş uygulayın.

Kıvrılmayı kurduktan sonra, femoral vene zarar vermemeye özellikle dikkat ederek arteri dikkatlice boyutlandırmak için bir çift mikro makas kullanın. Daha sonra, önceden hazırlanmış mikrokateteri insizyona yerleştirin. Kateterin geçişini kolaylaştırmak için bükülmeyi dikkatlice gevşetin.

Arteriyel kan akışı kateter içinde hemen görünür olmalıdır. Kateteri yavaşça önceki bükülmenin birkaç milimetre ötesine ilerletin. Daha sonra kateterin sabitlenmesi için hazırlanan ligatürü bağlayın.

Şimdi kateteri sodyum klorür ile nazikçe yıkayın ve ardından kateterin doğru konumunu doğrulamak için çözeltiyi aspire edin. Kateteri operasyon aşamasına daha fazla sabitlemek için bir parça bant kullanın. Kateter yeterince sabitlendikten ve bir kenara çekildikten sonra, sağ skrotumun ventral yönünün üzerindeki cildi ve fasyayı kesin.

Alttaki dokuya herhangi bir aletle dokunmamaya özen gösterin. İnsizyonu kasık kıvrımına kadar uzatın ve kıvrık bir şekilde skrotumun distal ucuna kadar uzatın. Ardından, dokunun kendisine dokunmadan kremaster kesenin üzerindeki alttaki yumuşak ve bağ dokularını dikkatlice ayırın.

Ardından, kası hafifçe uzatmak için kremasterin distal ucuna altı oh prolene stay sütür yerleştirin. Daha sonra, kas kesesinin altında kalan yumuşak dokuyu rezeke etmek için kası hafifçe ve öne doğru çekin. Bağ dokusundan tamamen ayrıldıktan sonra, kraniyal kenardaki C ana kesesini açmak için bir makas kullanın ve kesiyi bu açıklıktan kasın distal ucuna kadar uzatın.

Testisi kremaster üzerine bağlayan küçük damarı termal koterize ettikten sonra, kas ile testis arasındaki kalan bağlantıları kesmek için makas kullanın. Açılan kremader şimdi sahnede düz bir şekilde duracaktır. Şimdi dokunun kenarlarına dört adet altı oh prolene Stay sütürü yerleştirin ve bunları elastik örtü ile sabitleyin.

Cremaster kas dokusunu bu noktadan itibaren yaymak için, dokuyu PBS ile sürekli olarak nemlendirmek için bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Preparat 15 dakika dinlendirildikten sonra, mikro vaskülatürün kontrast arttırımı için sol femoral arter yoluyla 0.05 ila 0.1 mililitre% 1 rodin dekstrin enjekte edin. Şimdi, fareyi hareket ettirin ve şarj bağlantılı bir cihazın altına girin.

Femoral arter kateterinin yerinden çıkmamasına özellikle dikkat ederek, epi aydınlatma için modifiye edilmiş video kamera bağlantılı floresan mikroskobu. Suya daldırma hedefini ayarladıktan sonra, chma mikrosirkülasyonunun yeterli görselleştirilmesi için, sağlam kök hücre yapışmasının daha sonraki analizi için stokastik olarak tanımlanmış altı post kılcal ES. Daha sonra, önceden etiketlenmiş floresan donör kemik iliği kök hücrelerinin 200 mikrolitresini içeren bir mililitrelik bir şırınga yükleyin.

Şırıngaya yeniden canlandırmak için hafifçe vurun, hücre süspansiyonunu askıya alın ve ardından hücreleri femoral kateterden 40 mikrolitrelik enjeksiyonlarda toplam beş ardışık enjeksiyon için uygulayın. Hücre enjeksiyonundan hemen sonra kök hücre yuvarlanmasını kaydedin. Haddelemeyi, tipik hücresel çubuk ve serbest bırakma hareketleri ile birlikte endotel astarı boyunca hücre hızının %50'den fazla azalması olarak tanımlamak.

İntra vital mikroskopi tamamlandıktan sonra, kremaster kasını dikkatlice çıkarın ve daha sonra analiz etmek üzere saklayın. Genel olarak, doğrudan enjekte edilen kök veya progenitör hücrelerin kremaster kas mikrosirkülasyonu içindeki vasküler endotel ile etkileşimi nadir bir olaydır ve floresan etiketleme nedeniyle sadece post kapiller lezlerde meydana gelir. Siyah ok ucu ile gösterilen yuvarlanan hücreler ve beyaz oklarla gösterildiği gibi sıkıca yapışan kök hücreler, es'teki dolaşımdaki endojen lökositlerden açıkça ayırt edilebilir.

Kan akış hızı ve duvar kesme hızı ile temsil edilen mikro dolaşım koşulları, genellikle farklı kemokin tedavisi ile ilgili deney grupları arasında önemli ölçüde farklılık göstermez. Kermaster kas dokusunun farklı kemokinler veya inflamatuar yanıt mediatörleri ile lokal tedavisi. Örneğin, stromal hücreden türetilmiş faktör bir alfa veya tümör nekroz faktörü alfa, belirli mikroçevresel koşulları taklit edebilir.

Bu tür koşullar, uygulanan spesifik kemokin veya mediatöre ve enjekte edilen kök hücre popülasyonuna bağlı olarak kök hücre endotel hücre etkileşimlerini değişen derecelerde arttırır. Bu videoyu izledikten sonra, CreER kas mikrosirkülasyonunun intravital mikroskobu ile kök hücre ve hücre etkileşimlerinin in vivo olarak nasıl görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.