Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir insan nöronal kültür modeli geliştirmek, nöronal belirteçleri tanımlamak ve gen ekspresyon analizi için saf bir nöron popülasyonu izole etmektir. Bu, öncelikle progenitör hücrelerin sürekli bir kaynağı oluşturmak için insan nöro progenitör hücrelerinin genişletilmesiyle sağlanır. İkinci adım olarak nöro progenitör hücreler, yapışma faktörleri ile kaplanmış kaplarda, diferansiyasyon takviyeleri ve nörotrofik büyüme faktörlerinin varlığında kültüre edilir.

Ardından, diferansiye olmuş nöro progenitör hücrelerin kaderini belirlemek için nöronal markerlar için immünofloresan boyama gerçekleştirilir. Son olarak, nöron spesifik gen ekspresyon analizini kolaylaştırmak amacıyla PEN membran lamlar üzerinde kültüre edilen nöronların lazer yakalama mikrodissection işlemi yapılır. Diferansiye olmuş nöro progenitör hücrelerin ağırlıklı olarak nöronal yapıda olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir.

İmmünofloresan boyama ve nöron yakalamaya dayalı olarak, lazer yakalama mikrodissection yöntemiyle insan nöral progenitör hücreleri genişletilebilir ve nöron açısından zengin kültürlere farklılaştırılabilir. İn vitro çalışmalar için, bu kültürler bazı glial hücreler içerdiğinden, saf bir nöron popülasyonu izole etmek için lazer yakalama mikrodissection kullanabiliriz.

Bu prosedürleri, mikroskop merkez tesisimizdeki kıdemli araştırma görevlisi Ron Bouchard uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, fetal beyinden izole edilmiş dondurulmuş insan nöral progenitör hücre stoklarını hızla 37 °C'ye ısıtarak canlandırın ve ardından hücreleri, 10 ng/mL EGF ve FGF ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış 15 mL nöral bazal medyum içeren bir T 75 flaskona ekleyin. Hücreleri üç gün boyunca kültüre ettikten sonra, nörosferleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Santrifüj işleminin ardından, yaklaşık 100 µL medyum bırakacak şekilde süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini bir eppendorf tüpüne aktarın.

100 µL hücre peleti, iki adet T 75 flask'a bölmek için yeterlidir. Miktar daha azsa, nöroprogenitör hücreler çoğalamayacağı için flask sayısını azaltın. Eğer seyrek bir şekilde bölündüyse, 200 µL'lik pipet ucunu tüpün tabanına dayayarak 50 kez yukarı-aşağı pipetleme yaparak nörosferleri tamamen tek hücre süspansiyonuna dönüştürün.

Nörosferlerin ayrıştığından emin olmak için mikroskop altında ilerlemeyi görsel olarak kontrol edin. Ardından, hücre süspansiyonunu eşit miktarlarda ikiye bölün ve iki adet T 75 flaskına ekleyin. Flasklardan biri genişletme işlemine devam etmek, diğeri ise farklılaştırma için kullanılacaktır.

Ardından flaskları inkübe edin. Ekspansiyon için işaretlenmiş flasktaki nöral progenitör hücrelerin ortamını santrifüj yoluyla değiştirin. Eski ortamı dökün ve yeni ortam ekleyin.

Nörosferler 300 ila 500 mikronluk orijinal boyutlarına ulaşana kadar ortamı her dört ila beş günde bir değiştirin. Nöral progenitör hücrelerin nöron açısından zengin bir kültüre farklılaşmasını başlatmak için, 24 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa tek bir lamel yerleştirin ve her birine 500 µL 100 µg/mL poli-L-lizin ekleyerek kaplayın. Plakaları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından poli-L-lizin solüsyonunu aspire edin.

Plakayı deiyonize steril su ile durulayın ve tekrar aspire edin. Ardından, plağın kuyucuklarını 500 µL 5 µg/mL fare laminini ile kaplayın ve 30 dakika inkübe edin; inkübasyonun ardından kuyucukları PBS ile yıkayın, tekrar aspire edin ve doku kültürü kabininde kurumaya bırakın. Hücrelerin pasajlanmasından dört gün sonra, farklılaşma için etiketlenmiş flasktaki küçük nörosferleri kaplanmış 24 kuyucuklu plağa aktarın.

Kuyu başına yaklaşık 500 nörosfer yoğunluğunda ekleme yapın; altı saatlik inkübasyonun ardından nörosferler kaba yapıştığında, proliferasyon ortamını uzaklaştırın ve farklılaşma ortamını ekleyin. Bu ortam; nörobazal ortam, B 27 takviyesi, N-G-F-B-D-N-F-D-B-C ve retinoik asitten oluşmaktadır. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin; nöral öncül hücrelerin nöronal farklılaşma ortamında iki hafta boyunca kültüre edilmesinin ardından, nöron açısından zengin bir kültür elde edilir.

Nöronları bir kez PBS ile durulayın ve ardından 30 dakika boyunca %4 paraformaldehitte sabitleyin. Sabitleme işlemi tamamlandıktan sonra, hücreleri üç kez PBS ile durulayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca permeabilizasyon tamponu ile inkübe ederek immün boyama için hazırlayın.

Ardından, kuyucuklara PBS içinde %3 BSA ile hazırlanmış poliklonal ve monoklonal antikorları ekleyin. Her bir kuyucuğa farklı bir antikor çifti ekleyerek, bunları bir çalkalayıcıda dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah lamel kapaklarını üç kez PBS ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında, karanlıkta 90 dakika boyunca anti-tavşan P SI 3 ve anti-US fitzy sekonder antikorlarla inkübe edin.

Lamelleri üç kez PBS ile yıkayın. Ardından, bir lam üzerine 10 µL montaj ortamı damlatın. Lameli kültür kabından çıkarın ve montaj ortamının üzerine ters şekilde yerleştirin.

Fazla montaj ortamını nazikçe silin ve kenarları oje ile mühürleyin. Hücreleri mikrodiseksiyon için hazırlamak amacıyla, önce nöral progenitör hücreleri PEN membran üzerinde nöron açısından zengin bir kültüre farklılaştırın. Lamlar poli L lizin ve laminin ile kaplanmıştır.

Sonraki tüm adımları RNA içermeyen koşullar altında gerçekleştirin. Ardından, hücreleri görüntülemek için kültürleri histo gene boyası ile boyayın; histo gene boyası çekirdekleri mor, sitoplazmayı ise açık pembe boyayarak nöronların ve glial hücrelerin belirgin morfolojileriyle ayırt edilmesini kolaylaştırır. Lamı 30 saniye boyunca %75 etanol ve deiyonize steril su içerisinde bekletin.

Ardından lamı bir Kim wipe üzerine yerleştirin. 200 µL histo gene ekleyin ve 20 saniye bekleyin. Sonra lamı sırasıyla deiyonize steril su, %75 etanol, %95 etanol ve %100 etanol içerisine her biri için 30 saniye olacak şekilde yerleştirin.

Ardından beş dakika boyunca ksilen içerisinde bekletin ve beş dakika boyunca bir Kim wipe üzerinde kurutun. Sonra, standart lamın üzerine bir PEN membran lam yerleştirin ve bunları Veritas lazer yakalama mikrodisseksiyon sistemine veya yazılımu kullanarak LCM'ye yerleştirin. Astrosit içermeyen saf nöronal popülasyon bölgelerini bulmak için bir yol haritası görüntüsü alın.

Çizim araçlarını kullanarak bu nöronları işaretleyin. Ardından, bilgisayar kontrollü hassasiyet ve otomasyon kullanarak bu alanların lazer yakalama işlemini iki aşamalı bir süreçle gerçekleştirin. İlk olarak, membranı kapağa yapıştırmak için 70 milliwatts lazer güç ayarı ve 2, 500 microseconds impuls ile birden fazla noktaya IR uygulanır.

Ardından, işaretli alan 10 millivolt düşük seviye ayarına sahip bir UV kesme aracı kullanılarak eksize edilir. Bu süreçlerin kombinasyonu, işaretli alanların seçici olarak LCM makro kapaklara yakalanmasını sağlar. En az 100 nöron yakalandığında, membranı kapaktan çıkarmak için bir mikroskop kullanın ve membranı bir tüpe yerleştirin.

Bir P OPU RNA izolasyon kiti kullanarak LCM örneklerinden toplam RNA izole edin ve DNase ile işlemden geçirin. Ardından, kit talimatlarını izleyerek ribo amp RNA amplifikasyon kiti ile izole edilen RNA'yı amplifiye edin. Son olarak, insan nörofilament ağır zincirini tespit etmek için TAC MAN probları kullanarak gerçek zamanlı R-T-P-C-R analizi gerçekleştirin.

Dört günlük nörosferlerin, poli L-lizine ve laminat kaplı yüzeyler ile diferansiyasyona özgü büyüme faktörlerinin kombinasyonu kullanılarak diferansiyasyonuyla nöron açısından zengin bir kültür elde edilir. İki hafta sonra, düşük yoğunluklu bölgelerde burada gösterilen nöron açısından zengin bir kültür elde edilir. Hücreler, burada görülenler gibi astrositlere diferansiye olabilirler.

Astrosit farklılaşması, nöron farklılaşması için kullanılanların yerine CNTF büyüme faktörü kullanılarak da yönlendirilebilir. Nöron farklılaşması, spesifik nöronal belirteçlere yönelik antikorlar, yeni N ve sinapsin, asetilkolinesteraz ve sinaptofizin ile BDNF ve GAAP 43 kullanılarak tanımlanabilir. Pozitif boyama, farklılaşmış hücrelerin primer nöron özelliklerine sahip olduğunun kanıtıdır. Ayrıca astrositler, pozitif stat üç ve GAP immün boyaması yoluyla tanımlanabilir.

Nöronların lazer yakalama mikrodiseksiyonu, poli L-lizin ve laminin kaplı PEN membran üzerine diferansiye edilmiş hücreler üzerinde gerçekleştirilir; burada gösterilenler histo-boya ile boyanmış nöronlardır. Hücreleri görselleştirmek için, ilgilenilen hücreler PEN membranı eriten bir lazer kullanılarak ana hatlarıyla belirlenebilir, bu da membranın üzerine yerleştirilen yakalama kapağına yapışmasını sağlar. Sonuç olarak, DNA veya RNA analizi için çok sayıda hücre ana hatlarıyla belirlenip aynı kapak üzerine yakalanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, lazer yakalama mikrodisseksiyonu kullanarak nöronların nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.