Name: Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Öğrenin, insan nöroprogenitör hücrelerini nöronlara farklılaştırma ve lazer yakalama mikrodisseksiyon ile saf nöron popülasyonları izole etme yöntemini. Bu teknik gen ifadesi analizi için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma (SP) Gaziler İdaresi Liyakat İnceleme hibe (NEUD-004-07F) tarafından desteklenmiştir.

1.. İnsan NPC genişleme (Şekil 1) <ol><li> Dondurulmuş fetal beyin (Lonza, Walkersville, MD, USA) ve proliferasyon takviyeleri, EGF (10 ng / ml) ihtiva eden bir ortam içinde neurobasal neurospheres (Şekil 1A) gibi T-75 şişelerinde süspansiyon kültür bunları insan NPC&#39;nin stok ve canlandırmak FGF (10 ng / ml). </li><li> Kültür içinde 3 gün sonra, 5 dakika boyunca 500 rpm&#39;de bir 15 ml tüp ve santrifüj neurospheres aktarın. </li><li> Hücre peleti ~ 100 | il yukarıda orta geride bırakarak Süpernatant atılır ve bir Eppendorf tüpüne aktarılır. A 100 ul hücre peleti 2 T-75 şişelerinde bölmek yeterlidir. Neuroprogenitor hücreler ince bölerseniz çoğalırlar başarısız olarak daha az, şişelerin sayısını azaltın. </li><li> Tüpün alt karşı 200 ul ucu tutarken bir 200 ul 50x ucu ile pelet Karışım. Iki eşit parçaya bölün ve hücre süspansiyonu 2 T-75 şişelerinde (1-2 split), sürekli için birine eklemenizfarklılaşması için genişleme ve başka. </li><li> Neurospheres 300-500 mikron orijinal boyutuna ulaşana kadar her 4-5 gün orta değiştirerek genişleme (ilk şişe) için neuroprogenitor hücrelerin kültürü devam etmektedir. (500 rpm, 5 dk) santrifüj ile orta değiştirin, eski orta atmak ve yeni orta ekleyin. </li></ol> 2. Bir Nöron-zengin Kültür içine İnsan NPC Farklılaşma (Şekil 2) <ol><li> Bir nöron zengin kültürüne neuroprogenitor hücrelerin farklılaşması, her bir kuyuya 500 ul ilave edilerek poli-L-lisin, 100 ug / ml, 24-çukurlu plaka ve ceket her oyuğuna tek bir lamel yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika için yemekler inkübe edin. </li><li> Poli-L-lisin solüsyonu aspire ve steril su ile plaka yıkayın. </li><li> Daha sonra, kat 5 ug / ml fare laminin 500 ul plakanın kuyuları ve 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS ile kuyu yıkayın. </li><li> 4 gün sonra, splittiHücreleri (adım 1.4) ng, 24 çukurlu levha başına ~ 500 neurospheres yoğunluğunda kaplı kaplar içine &#39;ayrımı için,&#39; etiketlenmiş şişenin küçük neurospheres aktarın. </li><li> Neurospheres çanak iliştirdiğinizde 6 saat sonra, yayılması orta kaldırmak ve neurobasal orta oluşan farklılaşma orta ekleyin, B27 takviyesi, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), ve retinoik asit (2 uM). </li></ol> 3. Farklılaştırılmış NPC İmmünofloresan boyanması (Şekil 3) <ol><li> Iki hafta içinde nöronal farklılaşma ortam içinde neuroprogenitor hücrelerinin kültürü takiben, nöron zengin bir kültür elde edilir. Bir kere PBS içinde nöronları yıkayın ve daha sonra 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde tespit edin. Sabit sonra, hücreler PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> 60 dakika boyunca oda sıcaklığında permeabilizasyon tamponu (% 5 BSA ve PBS içinde% 0.2 Triton X-100) ile hücrelerin inkübe edin. </li><li> 4 ° C i de yemekler O / N inkübena aşağıdaki PBS içinde% 3 BSA içinde poliklonal ve monoklonal antikorların bir kombinasyonu ile çalkalama: neun (1:250) ve synapsin (1:250) asetil kolinesteraz (1:500) ve sinaptofizin (1:250), BDNF (1 : 500) ve GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) ve GFAP (1:1000). </li><li> PBS ile lamelleri üç kez yıkayın ve daha sonra 90 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında anti-tavşan-Cy3 ve anti-fare-FITC sekonder antikor ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS ile lamelleri üç kez yıkayın. </li><li> Forseps ile kültürü çanak lamel dışarı almak ve montaj ortamına ters yerleştirin, bir cam slayt üzerine montaj orta 10 ul yerleştirin. Yavaşça, herhangi bir aşırı montaj orta siliyorum ve oje ile kenarları mühür. </li><li> Bir floresan mikroskobunda immunosteyn nöronlar inceleyin. </li></ol> 4. Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (Şekil 4) <ol><li> PEN membran slayt üzerinde nöron-zengin kültürüne NPCleri ayırtŞekil 2 için tarif edilen yöntemler kullanılarak poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare var. </li><li> RNAse içermeyen koşullar altında tüm sonraki basamakları gerçekleştirir. </li><li> Hücreleri görselleştirmek için HistoGene Leke (Arcturus) kullanarak kültürleri Leke. </li><li> Veritas LCM sistemi ile tüm slayt yol haritası görüntü kullanılarak astrositlerde yoksun saf nöronal nüfus alanları bulabilirsiniz. Çizim araçlarını kullanarak nöronlar işaretleyin. </li><li> Iki aşamalı bir işlemde, bilgisayar kontrollü hassas ve otomasyon kullanılarak bu alanların lazer yakalama yapın. İlk olarak, IR (Kızıl Ötesi) membran kapağa bağlamak için 70 mW ve 2500 mikro-saniye bir darbenin bir lazer güç ayarına çok yerlerde ateşlenir. Daha sonra, işaretli alanı 10 mV düşük seviyede UV ayarda bir kesme aleti ile eksize edilir. </li><li> Bu süreçlerin kombinasyonu seçici CapSure LCM makro kapaklar üzerine PEN zardan İşaretli alanların yakalar. Kapak kaldırıldığında olduğunda, N ile zareurons kapağa bağlıdır. </li><li> Bir PicoPure RNA izolasyon kiti (Arcturus) kullanarak LCM örneklerinden total RNA izole ve DNase ile tedavi. </li><li> Kiti talimatları izleyerek RiboAMP RNA amplifikasyon kiti kullanılarak izole RNA yükseltin. </li><li> İnsan nörofilaman ağır zinciri (hNFHc) algılamak için TaqMan problar kullanılarak gerçek zamanlı RT-PCR analizi yapın. </li></ol> Kısaltmalar: AD, Alzheimer hastalığı, BDNF, beyin türevli nörotrofik faktör, CREB, siklik AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein; DBC, dibutiril siklik AMP, EGF, epidermal büyüme faktörü; FGF, fibroblast büyüme faktörü; GFAP, gliyal fibriler asidik protein, LCM, lazer mikrodiseksiyon yakalama, NGF, sinir büyüme faktörü, NPC, neuroprogenitor hücre, PEN, polietilen naftalat.

<ol><li>Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+identity+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial identity of neural stem cells.</a> Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).</li>
<li>Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: an overview.</a> Circ. Res. 92, 598-608 (2003).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review.</a> J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).</li>
<li>Breier, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+as+models+for+high-throughput+screens+of+developmental+neurotoxicity%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).</li>
<li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+supplementation+of+differentiating+human+neural+progenitors+and+embryonic+stem+cells+leads+to+enhanced+neurogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro.</a> J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+gene+expression+with+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection.</a> J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).</li>
<li>Robles, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+gene+expression+profiling+in+spatial+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning.</a> Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).</li>
<li>Su, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ethanol+versus+formalin+fixation+on+preservation+of+histology+and+RNA+in+laser+capture+microdissected+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues.</a> Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).</li>
<li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain%3A+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).</li>
<li>Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+CREB+expression+in+Alzheimer%27s+brain+and+in+Abeta-treated+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons.</a> Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).</li>
<li>Dworkin, S., Mantamadiotis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CREB+signalling+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting CREB signalling in neurogenesis.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+perspectives+of+neural+stem+cell+differentiation%3A+from+neurotransmitters+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.</a> Cytometry A. 75, 38-53 (2009).</li>
<li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li>
<li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li>
</ol>

Ilan etmek hiçbir çıkar çatışması.

Bu çalışmada, kendi kendini yenileyen insan neuroprogenitor hücrelerin farklılaşması ile nöron-zengin bir hücre kültürü modeli ve lazer yakalama mikro-kesim ile nöronların saf popülasyonu izole etmek için bir yöntem tarif eder. Biz NGF, BDNF, DBC ve NPC nöronal farklılaşma için retinoik asit bir arada kullandık. DBC CREB, nöron 12 arttıran bir transkripsiyon faktörü aktif hale getirmek için kullanılır. Retinoik asit, hücre döngüsü çıkışına neden ve glial nüfusu 13 azaltır. Bu çalışmada açıklanan yö...

Yaşam boyu nöron yan karıncıkların subventricular bölgesinde ve yetişkin memeli beyin 1 kıvrımlarının subgranular tabakasında meydana geldiği bilinmektedir. Neuroprogenitor hücreler (NPC) bu bölgelerde kaynaklanan nöronları, astrositlerde ve oligodendrositlerin 2 farklılaşabildiği multipotent hücrelerdir. NPC nedeniyle, Parkinson hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, felç ve Alzheimer hastalığı (AD) 3 de dahil olmak üzere, çeşitli nörodejeneratif bozukluğu olan hastalarda nakledilen için potansiyel ilgi yarattı. NPC&#39;ler ile çalışmalar genellikle bu nakli açısına odaklanmış ama Nörodejenerasyonun mekanizmasını belirlemek için hücre kültürü modeli olarak NPC-türetilmiş nöronların potansiyeli tam olmamıştır. Değillerse olarak daha önceki çalışmalarda, genellikle, her bir deney için izole edilmesi gerekli kemirgen beyin dokularından izole post-mitotik nöronlar kullandıkkendini yenileyen. SH-SY5Y ve SK-N-MC hücreleri de dahil olmak üzere insan nöroblastoma hücre çizgileri genişletilebilir de, primer nöron özelliklerine sahip değildir. Birden çok geçişleri için genişletilebilir ve primer nöron 4,5 olan özelliklere sahip bir hücre popülasyonu elde etmek için farklı olabilir, çünkü insan NPC, diğer taraftan, iki avantajlar sunmaktadır. Bu çalışmada, insan fetal beyninden izole edilmiş ticari olarak temin edilebilen NPC&#39;lerden tutarlı bir nöron zengin nüfus elde etmek için yeni bir farklılaşma protokol açıklar. Bu kültürler, glial hücrelerin küçük bir yüzde içeren olduğundan, biz moleküler karakterizasyonu için nöron saf popülasyonu izole etmek için ek yöntemler gerekir. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) bir doku bölümünden hücrelerinin homojen bir popülasyon seçici gen ekspresyon analizi 6 yakalanabilir hangi bir yeni bir tekniktir. Beyin nöronları, glia ve diğer hücre ty oluşan heterojen bir dokudurpes. LCM nörona özgü gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılmıştır 7-10 analiz eder. Daha önce, özellikle hipokampal nöronlar 11 azalma siklik AMP yanıt elemanı bağlayıcı proteinin ekspresyonunu (CREB) ve BDNF göstermek için AD (Tg2576) fare beyin kesitlerden hipokampal nöronlar LCM gerçekleştirdik. Bu çalışmada, biz PEN membran slaytlar kültüre nöronların izolasyonu için insan NPC genişlemesi, nöronal farklılaşma, nöronal belirteçler için immunofluorescent boyama ve LCM için prosedürler açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Nöroprogenitör hücreler (NPC'ler) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Nörokült NS-A insan bazal ortamı</td><td>Kök hücre teknolojisi</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Nörokült NS-A Proliferasyon takviyesi</td><td>Kök hücre teknolojisi</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Nörokült NS-A Farklılaşma takviyesi</td><td>Kök hücre teknolojisi</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x) </td><td>İnvitrojen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>İnsan epidermal büyüme faktörü</td><td>Kök hücre teknolojisi</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast büyüme faktörü </td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör </td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>Sinir Büyüme Faktörü </td><td>İnvitrojen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Dibutiril siklik AMP</td><td>Sigma</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizin </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>Fare laminin </td><td>Sigma</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>STAT3 antikoru</td><td>Hücre sinyali</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antikoru</td><td>Hücre sinyali</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>GAP43 antikoru</td><td>İletim laboratuvarları</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>BDNF antikoru</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>Asetil kolinesteraz antikoru </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>Sinaptofizin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>NeuN antikoru</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Sinapsin antikoru</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti fare FITC</td><td>Jackson İmmüno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Araştırma Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti Tavşan Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Araştırma Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Lamel (Büyük daire kapak kayması)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı (Prolong Gold)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Kalem zarı</td><td>Uygulanan biyosistemler</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Histogene LCM donmuş kesit boyama kiti</td><td>Uygulamalı biyosistemler</td><td>KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp RNA Amplifikasyon kiti</td><td>Uygulamalı biyosistemler</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Picopure RNA İzolasyon kiti</td><td>Uygulanan biyosistemler</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>CapsureMacro LCM kapakları</td><td>Uygulanan biyosistemler LCM0211</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kültür farklılaştırılmış insan neuroprogenitor hücreler nöronlar lazer yakalama mikrodisseksiyon

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Insan fetal beyninden izole Neuroprogenitor hücreleri (NPC) epidermal büyüme faktörü (EGF) ve hücrelerin bol kaynağı sağlamak için fibroblast büyüme faktörü (FGF) mevcudiyetinde çoğalma koşulları altında genişletilmiştir. NPC sinir büyüme faktörü (NGF), yeni bir kombinasyonunun mevcudiyetinde ayırt edildi, beyin-türevi nörotrofik faktör (BDNF), dibutiril cAMP (DBC) ve poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare yemekler retinoik asit nöron elde edilmesi için zengin kültürleri. NPC da nörotrofinlerin olmaması, DBC ve retinoik asit ve astrosit zengin kültürler elde etmek için, siliar nörotropik faktör (CNTF) mevcudiyetinde ayırt edildi. Farklılaştırılmış NPC Neun, synapsin, asetilkolinesteraz, sinaptofizin ve GAP43 dahil nöronal belirteçlerin bir panel için immunofloresan boyama ile karakterize edildi. Glial fibriller asidik protein (GFAP) ve STAT3, astrosit belirteçleri, farklı NPC&#39;nin 10-15% olarak tespit edilmiştir. Kolaylaştırmakhücre tipi özel moleküler karakterizasyonu, lazer yakalama mikrodiseksiyon polietilen naftalat (PEN) membran slaytlar üzerinde kültürlenmiş nöronlar izole etmek için yapıldı. Bu çalışmada açıklanan yöntemler nörodejenerasyonun moleküler mekanizması anlayışımızı ilerletmek için değerli bir araç sağlar.

NPC genişleme (Şekil 1) Neurospheres tritürasyon ile tek bir hücre süspansiyonu için ayrılmış zaman, pipet ucu süspansiyon yukarı ve aşağı pipetle bir direnç, böylece tüpün alt dokunun gerekiyor. Öğütülmesinden sayısıdır bireyler ve bir mikroskop altında elde edilen hücre süspansiyonu incelenerek deneme yanılma ile karar verilmesi gereken arasında değişir. NPC yakın temas sırasında proliferasyon, bir daha hızlı olacaktır, çünkü bu hücre süspansiyonunun yeterli yoğunluğu sağlama...

İnsan neuroprogenitor hücreleri (NPC) çoğalan koşullar altında genişletilmiştir. NPC nörotrofinlerin bir kombinasyonunun mevcudiyetinde nöron zengin kültürler içine ayırt edildi. Nöronal belirteçler immunofloresan boyama ile tespit edilmiştir. Nöron saf bir popülasyonu izole etmek için, NPC PEN membran slaytlar üzerinde farklılaştırılmış ve lazer yakalama mikrodiseksiyon uygulandı.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir insan nöronal kültür modeli geliştirmek, nöronal belirteçleri tanımlamak ve gen ekspresyon analizi için saf bir nöron popülasyonu izole etmektir. Bu, öncelikle progenitör hücrelerin sürekli bir kaynağı oluşturmak için insan nöro progenitör hücrelerinin genişletilmesiyle sağlanır. İkinci adım olarak nöro progenitör hücreler, yapışma faktörleri ile kaplanmış kaplarda, diferansiyasyon takviyeleri ve nörotrofik büyüme faktörlerinin varlığında kültüre edilir.Ardından, diferansiye olmuş nöro progenitör hücrelerin kaderini belirlemek için nöronal markerlar için immünofloresan boyama gerçekleştirilir. Son olarak, nöron spesifik gen ekspresyon analizini kolaylaştırmak amacıyla PEN membran lamlar üzerinde kültüre edilen nöronların lazer yakalama mikrodissection işlemi yapılır. Diferansiye olmuş nöro progenitör hücrelerin ağırlıklı olarak nöronal yapıda olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir.İmmünofloresan boyama ve nöron yakalamaya dayalı olarak, lazer yakalama mikrodissection yöntemiyle insan nöral progenitör hücreleri genişletilebilir ve nöron açısından zengin kültürlere farklılaştırılabilir. İn vitro çalışmalar için, bu kültürler bazı glial hücreler içer

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video in vitro lazer cımbız kullanarak manipülasyon kültürlü nöronların açıklamaktadır.

In Vitro İzole Nöronlar kurgulama için Lazer Cımbız

Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden...

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Atılır insan fetal kortikal doku sinir kök hücrelerin izolasyonu ve kültürü üzerinde basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Bilinen insan nörolojik bozukluklar türetilen Kültürler farmakolojik etkinliğini değerlendirmek için bir platform sağlamak gibi, hücresel ve moleküler patolojik süreçleri karakterizasyonu için kullanılabilir.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Kaynak: Palma-Tortosa, S., et.al. İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, kök hücre kaynaklı nöronal progenitör hücrelerin insan kortikal doku dilimlerine naklini göstermektedir. Prosedür, bir bazal membran matrisinde progenitör hücrelerin izole edilmesini ve yeniden askıya alınmasını, ardından bunların bir transwell düzeneğine yerleştirilen kortikal bir dilime enjekte edilmesini içerir.

Kök Hücre Kaynaklı Nöronal Progenitörlerin İnsan Kortikal Dilimlerine Nakli

Bu video, insan nöral progenitör hücrelerini (NPC'ler) nöronlara ayırmak için bir yöntem göstermektedir. NPC'ler, yerleşik bir fare astrosit-sıçan kortikal nöron ko-kültürüne tanıtılır ve NPC'nin nöronlara farklılaşmasını teşvik eder. Farklılaşma, hücrelerin konfokal bir mikroskop altında görüntülenmesiyle doğrulanır.

İnsan Nöral Progenitör Hücrelerini Nöronlara Ayırmak İçin Bir Ko-Kültür Tekniği

Bu videoda, nöral kök hücrelerin yapışmasını ve büyümesini artırmak için poliornitin ve laminin ile kaplanmış cam lamellerin hazırlanmasına yönelik bir yöntem açıklanmaktadır. Teknik, nöronlarda bulunan yapıları taklit ederek nöronal hücre büyümesini ve farklılaşmasını destekleyen destekleyici bir matrisin oluşumunu kolaylaştıran sıralı inkübasyonları ve yıkamaları içerir.

İnsan Nöral Kök Hücrelerinden Kortikal Piramidal Nöronların Üretilmesi

Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR ve / veya tüm genom mikroarrayler kullanan sonraki gen ekspresyon analizi için yaralı sıçan beyinlerinin frozen adlı hipokampal nöronlar veya tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Bireysel dopamin nöronlarının izolasyon ya da doğrudan veya dolaylı olarak immunohistokimyasal ile ventral tegmental alan lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanılarak gösterilmiştir. Kızılötesi lazer kullanarak cam slayt doku izolasyonu ve bir kızılötesi ve morötesi lazer kombinasyonu kullanılarak membran slaytlar arasındaki parametreler tartışılmıştır.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Bu protokol, bölümlenmiş mikrofluidik çiplerin kullanımını gösterir, insan kök hücrelerinden ayırt edilen kültürlü nöronlara döngüsel olefin kopolimer enjeksiyon kalıplı. Bu cips önceden montajlı ve daha kolay-geleneksel bölümleşmiş Poly (dimetilsiloxane) cihazlar daha kullanımı. Viral etiketleme, fluidik izolasyon, akotomi ve immünostasyon gibi çoklu yaygın deneysel paradigmalar burada açıklanmıştır.

Ön montajlı plastik mikrofluidik cips içinde ınsan kök hücresi türeyen neurons compartmentalization

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Öğrenin, insan nöroprogenitör hücrelerini nöronlara farklılaştırma ve lazer yakalama mikrodisseksiyon ile saf nöron popülasyonları izole etme yöntemini. Bu teknik gen ifadesi analizi için değerlidir.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Daha fazla video keşfet