Zayıf-saçılma Konular Dijital Inline Holografik Mikroskop (DIHM)
February 8th, 2014
Zayıf yaymalı nesnelerin üç boyutlu yerleri benzersiz standart bir mikroskop için küçük bir değişiklik içerir dijital inline holografik mikroskobu (DIHM) kullanılarak tespit edilebilir. Bizim yazılım üç boyutlu pozisyon ve bir mikroskopik faz nesnenin geometrisine vermek üzere Rayleigh-Sommerfeld geri yayılma ile birlikte basit bir görüntüleme buluşsal kullanır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüzen bakteri hücrelerinin bir zincirinin geometrisindeki 3 boyutlu konumu yeniden yapılandırmaktır. Bu, görüntüleme için uygun bir numune sağlamak için önce bakteri hücrelerinin doğru konsantrasyonda büyütülmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, LED ışık kaynağı kurulur ve hizalanır, böylece holografik görüntülerin elde edilmesini sağlar.
Daha sonra, bir bakteri hücresi zincirinin 3D koordinatlarını elde etmek için rekonstrüksiyon yazılımı kullanılır. Sonuçlar, holografik görüntülemeye dayalı olarak bakteri hücrelerinin 3B konumunu ve konfigürasyonunu yeniden yapılandırma yeteneğini göstermektedir. Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yüksek kare hızlarında etiketsiz hacimsel görüntülemenin mümkün olmasıdır.
Aşılamaya başlamak için, donmuş bir streptokok suşu V 4 0 5 1 1 97 stoğundan buz kristalleri içeren 10 mililitre KTY ortamı, başlangıç kültürünü gece boyunca 35 santigrat derece ve 150 RPM'de döner bir çalkalayıcıda inkübe eder. Büyüdükten sonra, 10 mililitre taze KTY ortamını doymuş başlangıç kültüründen 500 mikrolitre ile aşılayın. Hücreler 600 nanometre dalga boyunda 0.8 ila 1.0 optik yoğunluğa ulaşana kadar 35 santigrat derece ve 150 RPM'de 3.5 saat inkübe edin.
Bu, mililitre başına yaklaşık beş kez 10 ila sekizinci hücreleri temsil eder. Daha sonra, mililitre başına yaklaşık 1 milyon hücrenin nihai konsantrasyonunu elde etmek için hücreleri taze ortamda bir ila 400 arasında seyreltin. Daha sonra, bir şırıngayı vazelin ile doldurun ve bir mikroskop lamı üzerinde bir milimetre yüksekliğinde bir yağ halkası yapın.
Ardından ortasına bir damla numune çözeltisi yerleştirin. Numunenin üzerine nazikçe bir kapak camı yerleştirin ve kenarları kapatmak için camın üzerine hafifçe bastırın, sıvının hem sürgü hem de kapak camı ile temas halinde olduğundan emin olun. Elde edilen numune odası 100 ila 200 mikrometre derinliğe kadar bitmelidir.
60 x yağa daldırma lensini yerine döndürün ve bir damla yağ ekleyin. Ardından, numune haznesini, kapak camı aşağı bakacak şekilde mikroskop tablasına yerleştirin. Cam kapak kayması ile lens arasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olun.
Numune odasının alt yüzeyine odaklanın ve ardından kondansatörü odaklayın. Ardından, standart aydınlatmayı kapatın ve LED kafasını mikroskobun kondansatör açıklığının arkasına yerleştirin. Kondansatörün parlak alan moduna ayarlandığından emin olun ve LED güç kaynağını maksimum çıkışa ayarlayın.
Ardından kondansatör açıklığını sonuna kadar kapatın ve aydınlatma objektif lens açıklığında ortalanana kadar LED'i yuvasında itin. Bilgisayarı açın ve ardından ışık yolunu mikroskobun kamera bağlantı noktasına yönlendirin. Görüntü alma yazılımında kare hızını saniyede 30 kareye ve görüntü boyutunu beşe 12 x beş 12 piksele ayarlayın.
Görüntünün hiçbir bölümünün doygun veya az pozlanmış olmadığından emin olmak için görüntü yoğunluğu histogramını kontrol edin. Kare pozlama süresi, iyi kontrastı korurken mümkün olduğunca kısa olmalıdır. Hücreler bir arayüze yakın toplanırsa, bakteri hücrelerinin hafifçe bulanıklaşması için mikroskobu yeniden odaklayın.
Optimal rekonstrüksiyon için hücreler odak düzleminden yaklaşık 10 ila 30 mikron uzakta olmalıdır. Yeniden odaklama işleminden sonra, bir dizi video karesi alın ve sıkıştırılmamış bir VI dosyası olarak kaydedin. Ardından, bir video karesini sayısal olarak yeniden odaklanmış bir görüntü yığınına dönüştürmek için ücretsiz olarak indirilebilen DIHM yazılımını başlatın.
Yeniden yapılandırmaya başlamak için yazılımla birlikte örnek çerçeveler sağlanır. İlgilenilen çerçeveyi ve arka planını kutulara ayrı görüntü dosyaları olarak girin. Arka plan görüntüsü, hologramın yokluğunda videonun arka planını adil bir şekilde temsil eder ve holografik yerelleştirme ve analize müdahale edebilecek herhangi bir sabit desen gürültüsünü bastırmak için kullanılır.
Ardından, çıkış yığını parametrelerini genel ayarlar kutularına girin. İlk olarak, başlangıç odağındaki ilk karenin eksenel konumunu girin. Ardından, yeniden oluşturulan yığındaki dilim sayısını adım sayısı olarak girin ve son olarak, yığındaki her dilim arasındaki gerçek mesafeyi adım boyutu olarak girin.
Örnek verileri kullanarak nesneleri doğru oranlarda yeniden oluşturmak için adım boyutunu yanal piksel aralığıyla aynı olacak şekilde ayarlayın. Bu değer 0.233 mikrometre olmalıdır. Ardından, kameranın aydınlatmasını, dalga boyunu ve orta kırılma indisini ve yanal örnekleme frekansını girin.
Mikron başına piksel kutusunda, kameranın yanal örnekleme frekansı, objektif lens büyütmesinin kamera sensörü piksel boyutuna bölünmesiyle bulunabilir. Örnek verileri kullanarak, sayı 60 x bölü 14 mikrometre, mikron başına 4.29 piksele eşit olacaktır. Ardından, hologramda nesnenin merkezi karanlıksa, Z gradyanını çevir düğmesine basın.
Bu, orijinal örnekteki odak düzleminin altındaki nesneleri ayıklayan bir filtre uygulayacaktır. Ardından, görüntüye gürültülü piksel katkısını bastırmaktan sorumlu olan bant geçiren filtreyi açın. Oluşturulduktan hemen sonra her görüntü dilimine uygulanır.
Ardından, ara çıkış anahtarının açık durumunu kontrol edin ve açık olduklarından emin olun. Bu anahtarlar açık olduğunda, iki videonun oluşturulmasına neden olur. İlk çıktı, yığın a ile biten bir dosya adına sahip yeniden odaklama yığınıdır.İkinci yığın, gradyan a ile biten bir dosya adına sahip gerçek gradyan işlemidir VI.İdeal olarak, bu ikinci yığın, karanlık bir arka plana karşı parlak bir nesne olarak vurgulanan ilgilenilen nesneyi içerecektir.
Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, komutları yürütmek için ana pencerede çalıştır düğmesine basın. Seçilen çerçeve, yazılımın ana kutusunda görünecektir. Ardından, yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için görüntünün solundaki araç çubuğunda bulunan büyüteç aracını kullanın.
Bir ilgi alanı veya ROI seçmek için dikdörtgen aracını kullanın ve yeniden yapılandırmayı iyileştirmek için dikdörtgenin içinde mümkün olduğunca çok sayıda hologram saçağı yakalayın. Son olarak, iki ayrı görüntü yığını oluşturmak için işlem düğmesine basın. Bu web sitesinde bulunan Image J'yi kullanarak ortaya çıkan yığınları inceleyin.
İlgilenilen nesne degrade görüntü yığınında net bir şekilde görülebiliyorsa, nesne koordinatlarını çıkarmak için oluşturma bölümüne ilerleyin. Oluşturmaya başlamak için, X, Y, Z koordinat konumu işlevini etkinleştirmek üzere özellik çıkarma düğmesine basın. Ardından çıkış koordinatları dosyası için bir yol ve uzantı girin, çıkış koordinat stili kutusunda POV ışın stilini seçin.
Bu, programın bu web sitesinden edinilebilecek ücretsiz POV ışını ışın izleme yazılım paketi kullanılarak görselleştirilebilen bir nesne dosyası yazmasına neden olur, nesnelerin koordinatlarını çıkarmak için görüntüleri yeniden işler. Program, çıkış kabloları kutusundaki dosya adına yazılan seçilen ROI'de bir dizi X, Y, Z koordinatı sağlayacaktır. Nesne koordinatlarının çıkarılması, yığın oluşturmadan önemli ölçüde daha uzun sürer.
Örnek POV ışını file yeniden yapılandırma koduyla birlikte verilir, çıktı koordinatları Dosyası ile aynı klasörde bulunur. Örnek nokta bakış açı dosyasını düzenleyin ve dosya adını satırdaki ters virgülle değiştirin. Yeniden yapılandırma kodu tarafından oluşturulan veri dosyasının adıyla NC dosyamı ekleyin.
Ardından POV ray'de kamera konumunu, aydınlatmayı, dokuyu ve oluşturma seçeneklerini özelleştirin. İşiniz bittiğinde, bir bitmap görüntüsü oluşturmak için çalıştır düğmesine tıklayın. Bu, anlık olarak yönlendirilmiş bir streptokok bakteri zincirinin görüntüsüdür.
Odak düzlemine geçin. Bu yapılandırmadaki nesnelerin yeniden yapılandırılması zordur ve genellikle odak düzlemine yakın bir blob oluşturur. Burada, zincirin doğrudan optik eksen boyunca yönlendirilmediği bu serideki çoğu kareyi temsil eden düzgün bir şekilde oluşturulmuş bir görüntü gösterilmektedir.
Nesnenin şekli ve konumu, sağdaki panelde görüldüğü gibi işlemede aslına sadık bir şekilde yeniden üretilir. Bu tekniğe hakim olduktan sonra dakikalar içinde yapılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, yüzen bakteri hücrelerinin üç boyutlu pozisyonlarını ve geometrilerini yeniden oluşturmak için dijital inline holografik mikroskopisi (DIHM) kullanımını gösterir. Teknik, yüksek kare hızında etiket içermeyen hacimsel görüntüleme sağlayarak geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaj sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Dijital inline holografik mikroskopisi (DIHM), modifiye edilmiş bir mikroskop tekniğidir.
- Üç boyutta zayıf dağılım gösteren nesnelerin benzersiz tanımlanmasını sağlar.
- Holografik görüntüleme, dinamik süreçleri gerçek zamanlı olarak yakalayabilir.
- Konfokal mikroskop gibi mevcut yöntemler genellikle etiketleme gerektirir, bu da biyolojik örneklerin davranışını değiştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Yüzen bakteri hücrelerinin 3D pozisyonunu ve geometrisini yeniden oluşturmak.
- Canlı hücre dinamiklerini yakalamada DIHM'nin etkinliğini göstermek.
- DIHM'nin geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre avantajlarını karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Uygun konsantrasyonlarda bakteri hücre kültürlerinin hazırlanması.
- Optimal holografik görüntüleme için bir LED ışık kaynağının hizalanması.
- 3D koordinatları elde etmek için yeniden yapılandırma yazılımının kullanılması.
- Hücre yapılandırmasını değerlendirmek için elde edilen holografik görüntülerin analizi.
Ana Sonuçlar
- Bakteri hücrelerinin 3D pozisyonları başarıyla yeniden oluşturuldu.
- Teknik, etiketlere ihtiyaç duymadan yüksek kare hızında görüntüleme sağladı.
- Sonuçlar, görüntüleme hızı ve örnek bütünlüğü açısından konfokal mikroskopiye göre net bir avantaj gösterdi.
- Holografik görüntüleme, dinamik biyolojik süreçler için etkili olduğunu kanıtladı.
Sonuçlar
- DIHM, canlı bakteri hücre dinamiklerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Yöntem, numuneyi değiştirmeden ayrıntılı 3D görüntüleme sağlar.
- Bu teknik çeşitli biyolojik araştırma alanlarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
