Zayıf-saçılma Konular Dijital Inline Holografik Mikroskop (DIHM)
8 Şubat 2014
Zayıf yaymalı nesnelerin üç boyutlu yerleri benzersiz standart bir mikroskop için küçük bir değişiklik içerir dijital inline holografik mikroskobu (DIHM) kullanılarak tespit edilebilir. Bizim yazılım üç boyutlu pozisyon ve bir mikroskopik faz nesnenin geometrisine vermek üzere Rayleigh-Sommerfeld geri yayılma ile birlikte basit bir görüntüleme buluşsal kullanır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüzen bakteri hücrelerinin bir zincirinin geometrisindeki 3 boyutlu konumu yeniden yapılandırmaktır. Bu, görüntüleme için uygun bir numune sağlamak için önce bakteri hücrelerinin doğru konsantrasyonda büyütülmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, LED ışık kaynağı kurulur ve hizalanır, böylece holografik görüntülerin elde edilmesini sağlar.
Daha sonra, bir bakteri hücresi zincirinin 3D koordinatlarını elde etmek için rekonstrüksiyon yazılımı kullanılır. Sonuçlar, holografik görüntülemeye dayalı olarak bakteri hücrelerinin 3B konumunu ve konfigürasyonunu yeniden yapılandırma yeteneğini göstermektedir. Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yüksek kare hızlarında etiketsiz hacimsel görüntülemenin mümkün olmasıdır.
Aşılamaya başlamak için, donmuş bir streptokok suşu V 4 0 5 1 1 97 stoğundan buz kristalleri içeren 10 mililitre KTY ortamı, başlangıç kültürünü gece boyunca 35 santigrat derece ve 150 RPM'de döner bir çalkalayıcıda inkübe eder. Büyüdükten sonra, 10 mililitre taze KTY ortamını doymuş başlangıç kültüründen 500 mikrolitre ile aşılayın. Hücreler 600 nanometre dalga boyunda 0.8 ila 1.0 optik yoğunluğa ulaşana kadar 35 santigrat derece ve 150 RPM'de 3.5 saat inkübe edin.
Bu, mililitre başına yaklaşık beş kez 10 ila sekizinci hücreleri temsil eder. Daha sonra, mililitre başına yaklaşık 1 milyon hücrenin nihai konsantrasyonunu elde etmek için hücreleri taze ortamda bir ila 400 arasında seyreltin. Daha sonra, bir şırıngayı vazelin ile doldurun ve bir mikroskop lamı üzerinde bir milimetre yüksekliğinde bir yağ halkası yapın.
Ardından ortasına bir damla numune çözeltisi yerleştirin. Numunenin üzerine nazikçe bir kapak camı yerleştirin ve kenarları kapatmak için camın üzerine hafifçe bastırın, sıvının hem sürgü hem de kapak camı ile temas halinde olduğundan emin olun. Elde edilen numune odası 100 ila 200 mikrometre derinliğe kadar bitmelidir.
60 x yağa daldırma lensini yerine döndürün ve bir damla yağ ekleyin. Ardından, numune haznesini, kapak camı aşağı bakacak şekilde mikroskop tablasına yerleştirin. Cam kapak kayması ile lens arasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olun.
Numune odasının alt yüzeyine odaklanın ve ardından kondansatörü odaklayın. Ardından, standart aydınlatmayı kapatın ve LED kafasını mikroskobun kondansatör açıklığının arkasına yerleştirin. Kondansatörün parlak alan moduna ayarlandığından emin olun ve LED güç kaynağını maksimum çıkışa ayarlayın.
Ardından kondansatör açıklığını sonuna kadar kapatın ve aydınlatma objektif lens açıklığında ortalanana kadar LED'i yuvasında itin. Bilgisayarı açın ve ardından ışık yolunu mikroskobun kamera bağlantı noktasına yönlendirin. Görüntü alma yazılımında kare hızını saniyede 30 kareye ve görüntü boyutunu beşe 12 x beş 12 piksele ayarlayın.
Görüntünün hiçbir bölümünün doygun veya az pozlanmış olmadığından emin olmak için görüntü yoğunluğu histogramını kontrol edin. Kare pozlama süresi, iyi kontrastı korurken mümkün olduğunca kısa olmalıdır. Hücreler bir arayüze yakın toplanırsa, bakteri hücrelerinin hafifçe bulanıklaşması için mikroskobu yeniden odaklayın.
Optimal rekonstrüksiyon için hücreler odak düzleminden yaklaşık 10 ila 30 mikron uzakta olmalıdır. Yeniden odaklama işleminden sonra, bir dizi video karesi alın ve sıkıştırılmamış bir VI dosyası olarak kaydedin. Ardından, bir video karesini sayısal olarak yeniden odaklanmış bir görüntü yığınına dönüştürmek için ücretsiz olarak indirilebilen DIHM yazılımını başlatın.
Yeniden yapılandırmaya başlamak için yazılımla birlikte örnek çerçeveler sağlanır. İlgilenilen çerçeveyi ve arka planını kutulara ayrı görüntü dosyaları olarak girin. Arka plan görüntüsü, hologramın yokluğunda videonun arka planını adil bir şekilde temsil eder ve holografik yerelleştirme ve analize müdahale edebilecek herhangi bir sabit desen gürültüsünü bastırmak için kullanılır.
Ardından, çıkış yığını parametrelerini genel ayarlar kutularına girin. İlk olarak, başlangıç odağındaki ilk karenin eksenel konumunu girin. Ardından, yeniden oluşturulan yığındaki dilim sayısını adım sayısı olarak girin ve son olarak, yığındaki her dilim arasındaki gerçek mesafeyi adım boyutu olarak girin.
Örnek verileri kullanarak nesneleri doğru oranlarda yeniden oluşturmak için adım boyutunu yanal piksel aralığıyla aynı olacak şekilde ayarlayın. Bu değer 0.233 mikrometre olmalıdır. Ardından, kameranın aydınlatmasını, dalga boyunu ve orta kırılma indisini ve yanal örnekleme frekansını girin.
Mikron başına piksel kutusunda, kameranın yanal örnekleme frekansı, objektif lens büyütmesinin kamera sensörü piksel boyutuna bölünmesiyle bulunabilir. Örnek verileri kullanarak, sayı 60 x bölü 14 mikrometre, mikron başına 4.29 piksele eşit olacaktır. Ardından, hologramda nesnenin merkezi karanlıksa, Z gradyanını çevir düğmesine basın.
Bu, orijinal örnekteki odak düzleminin altındaki nesneleri ayıklayan bir filtre uygulayacaktır. Ardından, görüntüye gürültülü piksel katkısını bastırmaktan sorumlu olan bant geçiren filtreyi açın. Oluşturulduktan hemen sonra her görüntü dilimine uygulanır.
Ardından, ara çıkış anahtarının açık durumunu kontrol edin ve açık olduklarından emin olun. Bu anahtarlar açık olduğunda, iki videonun oluşturulmasına neden olur. İlk çıktı, yığın a ile biten bir dosya adına sahip yeniden odaklama yığınıdır.İkinci yığın, gradyan a ile biten bir dosya adına sahip gerçek gradyan işlemidir VI.İdeal olarak, bu ikinci yığın, karanlık bir arka plana karşı parlak bir nesne olarak vurgulanan ilgilenilen nesneyi içerecektir.
Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, komutları yürütmek için ana pencerede çalıştır düğmesine basın. Seçilen çerçeve, yazılımın ana kutusunda görünecektir. Ardından, yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için görüntünün solundaki araç çubuğunda bulunan büyüteç aracını kullanın.
Bir ilgi alanı veya ROI seçmek için dikdörtgen aracını kullanın ve yeniden yapılandırmayı iyileştirmek için dikdörtgenin içinde mümkün olduğunca çok sayıda hologram saçağı yakalayın. Son olarak, iki ayrı görüntü yığını oluşturmak için işlem düğmesine basın. Bu web sitesinde bulunan Image J'yi kullanarak ortaya çıkan yığınları inceleyin.
İlgilenilen nesne degrade görüntü yığınında net bir şekilde görülebiliyorsa, nesne koordinatlarını çıkarmak için oluşturma bölümüne ilerleyin. Oluşturmaya başlamak için, X, Y, Z koordinat konumu işlevini etkinleştirmek üzere özellik çıkarma düğmesine basın. Ardından çıkış koordinatları dosyası için bir yol ve uzantı girin, çıkış koordinat stili kutusunda POV ışın stilini seçin.
Bu, programın bu web sitesinden edinilebilecek ücretsiz POV ışını ışın izleme yazılım paketi kullanılarak görselleştirilebilen bir nesne dosyası yazmasına neden olur, nesnelerin koordinatlarını çıkarmak için görüntüleri yeniden işler. Program, çıkış kabloları kutusundaki dosya adına yazılan seçilen ROI'de bir dizi X, Y, Z koordinatı sağlayacaktır. Nesne koordinatlarının çıkarılması, yığın oluşturmadan önemli ölçüde daha uzun sürer.
Örnek POV ışını file yeniden yapılandırma koduyla birlikte verilir, çıktı koordinatları Dosyası ile aynı klasörde bulunur. Örnek nokta bakış açı dosyasını düzenleyin ve dosya adını satırdaki ters virgülle değiştirin. Yeniden yapılandırma kodu tarafından oluşturulan veri dosyasının adıyla NC dosyamı ekleyin.
Ardından POV ray'de kamera konumunu, aydınlatmayı, dokuyu ve oluşturma seçeneklerini özelleştirin. İşiniz bittiğinde, bir bitmap görüntüsü oluşturmak için çalıştır düğmesine tıklayın. Bu, anlık olarak yönlendirilmiş bir streptokok bakteri zincirinin görüntüsüdür.
Odak düzlemine geçin. Bu yapılandırmadaki nesnelerin yeniden yapılandırılması zordur ve genellikle odak düzlemine yakın bir blob oluşturur. Burada, zincirin doğrudan optik eksen boyunca yönlendirilmediği bu serideki çoğu kareyi temsil eden düzgün bir şekilde oluşturulmuş bir görüntü gösterilmektedir.
Nesnenin şekli ve konumu, sağdaki panelde görüldüğü gibi işlemede aslına sadık bir şekilde yeniden üretilir. Bu tekniğe hakim olduktan sonra dakikalar içinde yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, yüzen bakteri hücrelerinin üç boyutlu konumlarını ve geometrilerini yeniden oluşturmak için dijital satır içi holografik mikroskobinin (DIHM) kullanımını göstermektedir. Bu teknik, yüksek kare hızlarında etiketsiz volumetrik görüntülemeye olanak tanıyarak geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaj sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Dijital satır içi holografik mikroskopi (DIHM), modifiye edilmiş bir mikroskopi tekniğidir.
- Zayıf saçılımlı nesnelerin üç boyutta benzersiz şekilde tanımlanmasını sağlar.
- Holografik görüntüleme, dinamik süreçleri gerçek zamanlı olarak yakalayabilir.
- Konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemler genellikle etiketleme gerektirir ve bu durum biyolojik örneklerin davranışını değiştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Yüzen bakteri hücrelerinin 3D konumunu ve geometrisini yeniden oluşturmak.
- Canlı hücre dinamiklerini yakalamada DIHM'nin etkinliğini göstermek.
- DIHM'nin geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre avantajlarını karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteriyel hücre kültürlerinin uygun konsantrasyonlarda hazırlanması.
- Optimal holografik görüntüleme için bir LED ışık kaynağının hizalanması.
- 3D koordinatları elde etmek için rekonstrüksiyon yazılımının kullanılması.
- Hücre konfigürasyonunu değerlendirmek için elde edilen holografik görüntülerin analizi.
Temel Sonuçlar
- Bakteri hücrelerinin 3D konumları başarıyla yeniden oluşturuldu.
- Teknik, etiketleme gereksinimi olmadan yüksek kare hızında görüntüleme sağladığını kanıtladı.
- Sonuçlar, görüntüleme hızı ve numune bütünlüğü açısından konfokal mikroskobiye göre belirgin bir avantaj olduğunu gösterdi.
- Holografik görüntülemenin dinamik biyolojik süreçler için etkili olduğu kanıtlandı.
Sonuçlar
- DIHM, canlı bakteriyel hücre dinamiklerinin incelenmesi için güçlü bir araçtır.
- Yöntem, örneği değiştirmeden detaylı 3D görüntüleme yapılmasına olanak tanır.
- Bu teknik, çeşitli biyolojik araştırma alanlarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Dijital sıralı holografik mikroskopi (DIHM), geleneksel yöntemlerin etiketleme gerektirdiği veya 3D uzamsal çözünürlükten yoksun olduğu canlı hücre görüntülemedeki temel bir kısıtlamayı gidererek, zayıf saçılım gösteren biyolojik örneklerin yüksek kare hızlarında etiketsiz hacimsel görüntülenmesini sağlar. Bu yetenek, hücre konumunun ve geometrisinin doğal koşullardaki kantitatif ve modelden bağımsız ölçümlerini sunarak, hedef doğrulama ve fenotipik taramadaki mekanistik belirsizlikleri azaltır ve erken keşif iş akışlarını destekler. Tekniğin standart görüntüleme donanımlarıyla uyumluluğu ve ölçeklenebilir örnek hacimleri, onu keşif biyolojisinde terapötik hipotezlerin riskini azaltmak için yeniden kullanılabilir bir platform haline getirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Mikroskobik örneklerde nesne konumunun ve şeklinin belirsizliğe yer bırakmayan, modelden bağımsız ölçümünü sağlayarak ekzojen etiketler olmaksızın terapötik hipotezlerin sorgulanmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Standart CMOS/CCD kameralar ile LED veya lazer aydınlatma kullanarak, özel reaktiflere ihtiyaç duymadan mevcut mikroskopi iş akışlarına entegrasyon imkanı sunar.
- Öngörücü Değer: Hücresel yapıların kantitatif 3D koordinatlarını sağlayarak, doğal dinamiklerin doğrudan gözlemi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını ve biyolojik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: 3D rekonstrüksiyon için derinlik bilgisi içeren girişim desenlerini yakalayarak, karmaşık mikroortamlardaki hücresel yanıtların etiketsiz değerlendirilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kamera sensör boyutu ve aydınlatma koheransı aracılığıyla erişilebilir örnek hacmini tanımlayarak, lazer aydınlatması kullanılarak 5 mm³'e kadar olan hacimlerle platformlar arası standardizasyonu destekler.
- Öngörücü Değer: Analiz hazırlığı ve ölçeklenebilirlik için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar üretmek amacıyla Rayleigh-Sommerfeld geri yayılımı ve Gouy faz anomalisi sezgisellerini kullanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili sistemlerdeki dinamik biyolojik süreçlerin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlayarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Operasyonel Değer: Örnekte herhangi bir değişikliğe yol açmadan yüksek kare hızında görüntüleme yapılmasına olanak tanır ve preklinik modellerde boylamsal takip için doğal davranışları korur.
- Öngörücü Değer: Hücresel geometri ve konumlandırmadaki belirsizliği azaltarak mekanistik risk azaltımı sağlar ve risk ayarlı ilerleme kararlarına bilgi sunar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
DIHM, erken dönem biyolojideki hipotez testlemesinden aday madde belirleme ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle etiketsiz, volumetrik ve dinamik görüntülemenin deneysel koşulları karşılaştırmak için gerekli olduğu durumlara uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Bakteri hücreleri veya hücre altı yapılar gibi zayıf saçılımlı nesnelerin modelden bağımsız 3D lokalizasyonunu sağlayarak hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Koşullar arasında hücresel konfigürasyonların karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif, yeniden odaklanmış görüntü yığınları aracılığıyla analiz hazırlığını mümkün kılar.
- Analitik: Özellik çıkarımı yoluyla X, Y, Z koordinat çıktıları üreterek uzaysal dağılımların ve hareket modellerinin istatistiksel analizini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Dinamik süreçlerin boylamsal görüntülemesi sırasında örnek bütünlüğünü koruyarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Ücretsiz rekonstrüksiyon yazılımlarından ve standart donanımlardan yararlanarak tek kullanımlık bir teknikten ziyade yeniden kullanılabilir bir görüntüleme kapasitesi olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nesne geometrisinin ve konumunun etiketsiz, modelsiz 3D rekonstrüksiyonu yoluyla öngörü güvenilirliği.
- Operasyonel Değer: Sayısal yeniden odaklama ve arka plan çıkarma kullanılarak sabit desen gürültüsünün bastırılması aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Yerli hücresel dinamiklerin erken ve yüksek sadakatle gözlemlenmesi yoluyla geç aşama biyolojik risklerin azaltılmasıyla daha iyi devam/dur kararları.
- Portföy Etkisi: Hedef güvenilirliği ve öncü seçimine ışık tutan kantitatif uzamsal veriler aracılığıyla riske göre ayarlanmış önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Holografik görüntü elde etme ve Rayleigh-Sommerfeld geri yayılımı kullanarak sayısal rekonstrüksiyon konusunda uzmanlık gerektirir.
- Düz dalga aydınlatması yapabilen ve tanımlanmış kare hızları ile çözünürlüklerde CMOS/CCD görüntü yakalama kapasitesine sahip enstrümantasyon gereklidir.
- Tekrarlanabilir 3D rekonstrüksiyon için aydınlatma koheransı, adım boyutu ve lateral örnekleme frekansının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Çıktı yığını parametrelerinin (başlangıç odağı, adım sayısı, adım boyutu), deneysel ölçek ve büyütme ile uyumlu olacak şekilde adapte edilmesini gerektirir.
- Pratik sınırlama: optimal rekonstrüksiyon için nesnelerin odak düzleminden 10–30 mikron uzaklıkta olması gerekir, bu da hassas numune hazırlama ve odaklama işlemini zorunlu kılar.
