Tripsin Digest Protokolü Fare Modeli Retina damarları Analiz

Bu prosedürün genel amacı retina vasküler ağını izole etmektir. Bu, önce izole retina üzerinde bir dizi su yıkama işlemi gerçekleştirilerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, retina, retinanın boyutuna bağlı olarak yaklaşık bir ila bir buçuk saat boyunca 37 santigrat derecede tripsin içinde sindirilir.

Daha sonra, damar sistemi ek su yıkamaları ve mikroskop altında diseksiyon yoluyla izole edilir. Sonuç olarak, mikro anevrizmalar, kapiller dejenerasyon ve anormal endotel hücresi/parazit oranı gibi patolojik vasküler değişiklikler görüntülenebilir. Bu nedenle, retinal düz montajların hazırlanması gibi mevcut yöntemlere göre deneme ve sindirmenin ana avantajı, tüm vasküler ağın büyük bir netlikle vurgulanabilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, teknik olarak zorlayıcı ve tutarlı bir şekilde gerçekleştirmesi zor olduğu için mücadele edeceklerdir. Vasküler izolasyon adımlarının tek başına kelimelerle öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Bu, diyabetik retinopati gibi bazı hastalıklar gibi retinal vasküler biyoloji çalışmaları yapan herhangi bir laboratuvarda çok değerli bir araçtır ve bu tekniği gösteren Jonathan Chow, laboratuvarımdan yetenekli bir tıp öğrencisi olacaktır.

Enükleasyonlu fare gözü ve% 10 nötr tamponlu formini 24 saat boyunca sabitledikten sonra, gözü bir Petri kabına koyun ve az miktarda su ile kaplayın. Korneada dikkatli bir şekilde ilk kesimi yapmak için bir çift diseksiyon makası kullanarak diseksiyona başlayın. Daha sonra, kesilen bölgeyi düz forsepslerle tutarken, korneanın sınırı boyunca kesmek için bir makas kullanın ve korneayı çıkaran sklera.

Ardından, ince, kavisli ve düz forseps kullanın. Sklera ve koroidi retinadan optik sinire doğru yavaş ve dikkatli bir şekilde soymak için. Ardından, nöral retina katmanlarını kan damarlarından ayırmaya yardımcı olmak için lensi ve retinadaki fazla iris ve kalıntıları çıkarın.

Yaklaşık 500 mikrolitrede 45 mikrometre filtrelenmiş suyu 24 oyuklu bir plakaya koyun ve retinayı bir kuyuya yerleştirin, ardından oda sıcaklığında dört ila beş saat boyunca hafifçe çalkalayın ve suyu her 30 ila 60 dakikada bir değiştirin. Retinayı gece boyunca hafifçe çalkalanarak suda yıkamaya devam edin Ertesi gün oda sıcaklığında suyu çıkarın ve% 3 tripsin'de, kuyuda kalıntı bulunmadığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Damar sisteminin ona yapışmasını önlemek için, dokuyu 37 santigrat derecede bir ila bir buçuk saat boyunca hafifçe veya hiç sallamadan inkübe edin.

Doku parçalanma belirtileri göstermeye başladığında, plakayı mikroskop sahnesine yerleştirin ve ardından retinadan kaçının. Damar sistemini ayırmak için tripsini dikkatlice çıkarın. İlk olarak, forseps kullanarak retinaya filtrelenmiş su ekleyin.

İnce, şeffaf bir tabaka olarak görünen iç sınırlayıcı zarı soyun. Plakayı hafif bir çalkalama ile sallayın. Beş dakika sonra, plakayı tekrar mikroskop tablasına yerleştirin ve damar ağını yapışık retina dokusundan kurtarmaya yardımcı olmak için retinaya zarar vermekten kaçınarak suyu dikkatlice değiştirin.

Son yıkamadan sonra suda çok az kalıntı kalana veya hiç kalıntı kalmayana kadar retinayı gösterildiği gibi yıkayın. Bu nedenle, tipik olarak tüm vasküler olmayan dokuyu çıkarmak, prosedürün en zor kısmıdır. Aşağıdaki teknikler sırayla veya ayrı ayrı kullanılabilir: Vasküler ağın izolasyonunu kolaylaştırmak için önemli bir ipucu, retinayı manipüle etmeden önce tüm aletleri ve tripsini batırmaktır.

Bu, bir dokunun ekipmana yapışmasını önlemeye yardımcı olabilir. 200 mikrolitrelik bir mikro pipet ucunu ayrılmış tripsin ile kaplayın ve ardından suyu dikkatlice yukarı ve aşağı, retina damarlarına bitişik ve doğru üfleyerek hafif çalkalamaya neden olacak şekilde pipetleyin. Vasküler olmayan doku hala dirençli merkezse, optik sinirde tripsin kaplı bir mikro pipet ucu ve vasküler olmayan dokuyu parçalamaya yardımcı olmak için tüm damar ağını dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.

Sonunda, iyi. Forseps, herhangi bir yapışma vasküler olmayan bileşeni çıkarmak için damar sistemini sudan nazikçe kaldırmak için kullanılabilir. Sonuç, sağlam bir kalıntı içermeyen retinal damar sistemi ağı olmalıdır.

Damar sistemini görselleştirmek için önce temiz bir slayta bir damla su koyun. Daha sonra sindirilmiş kapları bir dürbün kontrolü altında suya aktarın. VA'ların kanat montajı katlanır veya açılırsa, katlanmış damarlar görüşün zayıf olmasına neden olur.

Lekelendiğinde, doku katlanırsa, ilave su ekleyin ve açılmayı kolaylaştırmak için slaytı hafifçe sallayın. Ardından fazla suyu yavaşça çıkarmak için bir mikro pipet kullanın. Başarılı bir prosedürün nihai ürünü, hemat, toin ve eoin ile korunan ve boyanan mimari ile fare retinal vaskülatürünün tüm ağının düz bir montajıdır.

Burada gösterildiği gibi, bu görüntüde görüldüğü gibi, retinada endotel hücreleri ve perisitler arasında net bir farklılaşma gözlenebilir. Endotel hücrelerinin çekirdekleri, beyaz okla gösterildiği gibi, oval veya uzundur ve tamamen damar duvarı içinde yer alır. Parazit çekirdekleri siyah okla gösterilir, küçük, küresel leke yoğundur ve genellikle kılcal duvar boyunca çıkıntılı bir konuma sahiptir.

Tripsin ve sindirim, diyabetik hayvan modellerinde vasküler patolojiyi analiz etmek için kullanılan yaygın bir prosedürdür. Bu görüntü, tip iki diyabet için bir model olan DB DB faresinde gözlemlendiği gibi beyaz okla gösterildiği gibi kılcal dejenerasyonun bir örneğini göstermektedir. Bu prosedür fare retinaları için optimize edilmiş olsa da, sıçan retinalarında da benzer sonuçlar elde edilebilir.

Bu görüntülerde gösterildiği gibi sıçan retinalarının fare retinalarından daha büyük olduğunu ve plakaları 24 yerine 12 gerektirdiğini not etmek önemlidir. Sıçan retinasının damar sistemi ağı da fare muadilinden daha az kırılgandır. Vasküler olmayan dokunun mümkün olduğunca çok çıkarılması son derece önemlidir.

Herhangi bir kalıntı, spesifik olmayan lekelenmeye yol açacak ve vaskülatürün zayıf görselleştirilmesine yol açacaktır. Bu görüntüde, örneğin, tüm vasküler olmayan dokunun başarısız bir şekilde çıkarılması gözlemlenebilir. Aynı şekilde, damar sisteminin görselleştirilmesini iyileştirmek için montaj sırasında retinanın açılması da önemlidir.

Bu görüntü, vasküler düz montajın başarısız bir şekilde açılmasını göstermektedir. Bu teknik olarak zor prosedüre hakim olduktan sonra. Geziler ve sindirmeler, tüm damar ağının ayrıntılı bir şekilde görüntülenmesini sağlayan son derece değerli bir yöntem olabilir.

Araştırmacılar, fare gözünde bu tekniği geliştirerek, retina damar sistemini kontrol altına alabilecek ve çeşitli retina hastalıklarının patofizyolojisini anlamamıza izin verebilecek çeşitli yolları incelemek için genetik olarak manipüle edilmiş farelerden yararlanabilirler. Bunun bir sonucu olarak, diyabetik retinopati gibi hastalık patolojileri hakkındaki anlayışımızı geliştirebiliriz. DVDB faresi gibi fare modellerini inceleyerek, bu sonuçta retina damar sistemini hedef alan yeni potansiyel terapötik müdahaleler bulma fırsatı verebilir.