Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Bu prosedür, murn nazofarenksin streptococcus pnömonisi ile kolonizasyonunu ve ardından kolonize edici bakterilerin yanı sıra yapışık veya işe alınmış hücrelerin ekstraksiyonunu içerir. Bu, önce S pnömonisinin bakteriyel bir aşısının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İlgi gerginliği.

Canlı bakteriler daha sonra bir kısıtlayıcı aparat içindeyken anestezi uygulanmış farelere intranazal olarak uygulanır İstenilen kolonizasyon uzunluğundan sonra, fareler daha sonra ötenazi yapılır ve açıkta kalan trakealarını kanüle ederek ve içeriği nas yoluyla dışarı atarak burun lavajları gerçekleştirilir. Nazal lavajlarda bulunan bakteri sayıları mikrobiyolojik teknikler kullanılarak ölçülebilir. Alternatif olarak, immün yanıtlar, işe alınan hücreleri fenotiplemek için akış sitometrisi teknikleri veya kantitatif PCR teknikleri kullanılarak test edilebilir.

Başlamadan önce ifade edilen mRNA seviyelerini ölçmek için, prosedürün intranazal kolonizasyon kısmı için fare kısıtlayıcıları ve nazal lavajlar için kanüllü iğneler hazırlamanız gerekir. Bir fare tutucu, 50 mililitrelik bir şahin tüpünün konik ucunu keserek hazırlanabilir. Diyaframı oluşturduktan sonra, keskin uçları cilalamak için makas kullandığınızdan emin olun.

Kanüllü iğnelerin hazırlanması için, iç çapı 0,38 milimetre olan aşağıdaki PE 20 polietilen boruya ihtiyacınız olacaktır. Bir mil şırınga, 26 ve üç adet sekiz gauge eğimli iğne, bir çift keskin, ince iris, makas ve bir çift forseps ile kapatılmıştır. PE 20 borusunu ince makasla kabaca 2,5 santimetre veya bir inç uzunluğunda parçalar halinde kesin ve her bir ucun eğimli bir uca sahip olduğundan emin olun.

Forsepsleri kullanarak bu parçalardan birini iğnenizin ucuna dikkatlice kaydırın. Boru tarafının delinmesinden kaçınarak, kanüllü iğneler ihtiyaç duyulana kadar %70 etanol içinde tutulabilir ve kullanımdan önce doğrudan PBS ile yıkanabilir. S pmo'lu farelerin intranazal kolonizasyonu için, 10 mikrolitrede verilen mil başına 10 ila dokuz koloni oluşturan birim arasında bir konsantrasyon kullanmanızı öneririz.

10 ila yedi CFU'luk son bir doz için, aşılamayı kullanımdan hemen öncesine kadar buz üzerinde tutun ve her kolonizasyon arasında çalkaladığınızdan emin olun. Aşılamaya ek olarak, bir P 10 veya P 20 pipet sterilize edilmiş pipet ucuna ve fare tutucunuza da ihtiyacınız olacaktır. Tek bir fareyi kuyruğundan izole edin ve önceden hazırlanmış fare kısıtlama aparatınıza yerleştirerek onu kısıtlayın.

Fareyi sınırlayıcıya yönlendirmekte sorun yaşıyorsanız, farenin önüne ve üstüne yerleştirmek yardımcı olarak hayvanın yukarı doğru sürünmesine izin verebilir. Fare kısıtlayıcının içine girdikten sonra, burnu kısıtlayıcının konik ucundan çıkacak şekilde hafifçe yukarı doğru iterek vücudunun tabanından sabitleyin. Bir P 10 veya P 20 pipeti kullanarak, hazırlanan kültürden 10 mikrolitre biriktirerek her fareyi aşılayın ve her ikisi arasında eşit olarak dağıtın. Nares.

Farenin aşıyı soluması için gereken süreyi alarak, aşılamayı kademeli olarak nabız atarak aşının buruna damlamasına izin verin. Fare, aşının bir kısmını burnundan hapşırabilir, bu beklenen bir durumdur. Bakterilerin nazofarenkste lokalize kalmasını ve alt solunum yollarına yayılmamasını sağlamak için farelerin bu prosedür için uyuşturulması gerektiğini unutmayın.

Bu demonstrasyonun amaçları doğrultusunda, PBS ile aşılama yapıyoruz, ancak canlı bakterilerle çalışırken, prosedürü enstitü onaylı yönergelere göre uyguladığınızdan emin olun. Örneğin, çoğu kurum, kolonizasyonun biyogüvenlik seviyesi iki başlıkta yürütülmesini gerektirecektir. Uç nokta izleme yolunuzun bir parçası olarak ağırlık göstergelerini kullanıyorsanız, kolonizasyondan hemen sonra MA, fareleri uyuşukluk, fırfırlı kürk ve kilo kaybı gibi klinik semptomlar için her 12 ila 24 saatte bir izleyin.

Fareler kolonize olduktan sonra, onları istenen süre boyunca tutun. Bu sürenin sonunda farelere ötenazi yapılır ve rahim ağzı çıkığı trakeaya potansiyel olarak zarar verebileceği için nazal lavaj yapılır. Bu ötenazi yönteminden kaçınılmalıdır.

Nazal lavajları gerçekleştirmeden önce, aşağıdakilerin elinizin altında olduğundan emin olun. Önceden hazırlanmış kanüllü iğneler,% 70 sulu etanol, bir çift forseps, bir çift keskin ince iris makası, fosfat, tamponlu salin, RNA lizis tamponu ve bir mil einor tüpü. Başlamaya hazır olduğunuzda, hayvanı sırt üstü düz bir şekilde yatırın ve% 70 sulu etanol kullanarak kürkünün ön kısmını, özellikle boyun bölgesini sterilize edin.

Etanolün burunlara erişmesini önlemeye özen gösterin. Hayvanın boynunun orta çizgisi boyunca tek bir uzunlamasına kesim yapın ve trakeayı tasavvur etmek için bir açıklık oluşturmanıza izin verin. Altındaki boyun dokusunu ortaya çıkaracak şekilde her iki taraftaki cildi dikkatlice soyun.

Bu noktada, trakea her iki tarafta uzunlamasına kaslarla çevrili olarak görünür olmalıdır. Trakeanın kendisinin net bir görüntüsünü sağlamak için bunları dikkatlice kesin ve çevredeki damar sistemini kesmemeye dikkat edin. Yanlışlıkla damar sistemini kesmeniz durumunda, devam etmeden önce bölgede kan bulunur.

Kanamanın durmasına izin verin ve ardından steril PBS dağıtarak ve fazla nemi nazikçe emmek için steril gazlı bez kullanarak alanı birkaç kez temizleyin. Trakea düzgün bir şekilde açığa çıktıktan sonra, trakeada yaklaşık yarıya kadar enine bir yarım ay kesimi yapın. Steril PBS'yi kanüllü bir şırıngaya bırakın.

Kanülü soluk borusuna buruna doğru yerleştirin ve yerleştirme kolaylığı için eğimli kenarı aşağı bakacak şekilde tutun. Kanül yerleştirildikten sonra, 180 derece döndürün ve ışık direnci hissedene kadar hafifçe yukarı doğru araştırın. Numune toplama için tasarlanmış EEND DPH tüpünü farenin burnunun hemen altına yerleştirin.

Minimum miktarda PBS lavaj sıvısı dağıtarak kanülün doğru yerleştirilmesini test edin. Bunu takiben, kanül doğru yerleştirilmişse farenin NAS'ı etrafında bir damla sıvı oluşmalıdır. Test PBS'si doğrudan hayvanın ağzından çıkarsa, kanülü geri çekin ve çok hafif bir direnç hissedilene kadar hafifçe ileri doğru inceleyerek tekrar konumlandırın.

Kanülü burun damağını geçip ağız boşluğuna doğru hareket ettireceğiniz için bu direnci çok fazla aşmamaya dikkat edin. Kanülün doğru yerleştirildiğini onayladıktan sonra, maksimum miktarda hücrenin yer değiştirmesine ve toplanmasına yardımcı olmak için 200 mikrolitre PBS'yi hızlı bir şekilde dağıtmaya devam edin. İçerik, farenin burun kısımlarından dışarı ve toplama tüpüne akmalıdır.

Numuneyi hemen buzun üzerine yerleştirin. Bu numuneler daha sonra bakteri yükü ve hücresel alım için test edilebilir. RNA analizi için numune toplamak için, ikincil bir burun lavajı gerçekleştirmek için 500 mikrolitre RNA lizis tamponu içeren ayrı bir kanüllü iğne kullanın.

RNA lizis tamponunun epiteli denüle edeceğini ve çevredeki dokuyu tahrip edeceğini unutmayın. Bu nedenle akciğer gibi organlarla temastan kaçınmak için özen gösterilmelidir. Nazofaringeal bakteri yükünü ölçmek için bu dokuların tutulması isteniyorsa, aşağıdakilere ihtiyacınız olacaktır.

Epicor tüpleri, triptik soya yumurtası içeren mikrobiyolojik plakalara %5 koyun kanı takviye edilir. Vorteks karıştırıcı, PBS steril pipet uçları ve P 20 ve P 200 pipetleri. İlk önce bir BSL iki başlıkta çalışarak, her mirin nazal lavaj numunesi için bir seri seyreltme serisi hazırlayın.

Genel olarak, nazofarenksteki S pneumoniae konsantrasyonlarının sıfır ile 10 ila dört CFU arasında olması beklenebilir. Bu nedenle, üç on kat seri seyreltme gerçekleştirin, ilk tüpe 10 mikrolitre temiz nazal lavaj örneğini mil başına 10 ila eksi bir CFU konsantrasyonuna ekleyin ve her seyreltme arasında üç örnek aşırı derecede seyreltilene kadar aşağı doğru devam edin. Lütfen bu videonun yalnızca tanıtım amaçlı olduğunu unutmayın.

Pipet uçlarının dilu arasında değiştirilmesi de dahil olmak üzere uygun laboratuvar tekniğine her zaman uyulmalıdır Bir sharpie kullanarak, onu mantıksal plakanıza geri kadranlara bölün ve kadranları, üzerine kaplanacak karşılık gelen seyreltme ile etiketleyin. Agar plakası üzerindeki seyreltmenizin her birinden üç damla 10 mikrolitre numune alın. Bunların üstü açık olarak 15 ila 30 dakika kurumasına izin verin, ardından plakaları örtün ve pnömokok büyümesi için en uygun koşullara, tipik olarak 37 santigrat derece ve% 5 CO2'ye sahip bir bakteri inkübatöre baş aşağı yerleştirin.

Bu plakaları 24 ila 48 saat inkübe edin. Bu süreden sonra plakaları çıkarın ve plaka üzerinde oluşan kolonilerin ortalamasını alarak kolonize olan bakteri sayısını belirleyin. Her seyreltme için, animo kolonileri, kendine özgü bej renkleri, agardaki kan takviyesinin bakteriyel sindirimi ile oluşturulan, her koloninin etrafında küçük haleler olan alfa hemoliz bölgeleri ile tanımlanabilir.

Ve son olarak, her koloninin merkezinde, ona bir eritrosit görünümü veren küçük çöküntülerle. Bu videoyu izledikten sonra, bir nazofaringeal es pmo'nun nasıl kurulacağı, bir farede kolonizasyonun, kolonizasyondan sonra bir farenin nazofarenksinden bakteri ve hücrelerin nasıl izole edileceği, nazal lavaj kullanılması ve mikrobiyolojik teknikler kullanılarak karşılık gelen bakteri yükünün nasıl ölçüleceği konusunda sağlam bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu videoda açıklanan yöntemlerin, bu az çalışılmış bölge bağlamında patojenlere karşı konak tepkilerini incelemek için intranazal bir kolonizasyon modeli kullanmanızı teşvik edeceğini umuyoruz.