Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Bu prosedür, fare nazofarenksinin streptococcus pneumonia ile kolonize edilmesini ve ardından kolonize olan bakterilerin yanı sıra yapışmış veya mobilize olmuş hücrelerin ekstrasyonunu içerir. Bu işlem, öncelikle ilgili S pneumonia suşundan bir bakteriyel inokulum hazırlanarak gerçekleştirilir.

Canlı bakteriler, daha sonra anestezi altındaki farelere, bir sabitleyici aparat içerisindeyken intranazal olarak uygulanır. İstenilen kolonizasyon süresi sonunda fareler ötanize edilir ve açıkta kalan trakeaları kanüle edilip içeriklerin burun yoluyla dışarı atılmasıyla nazal lavaj işlemleri gerçekleştirilir. Nazal lavajlarda bulunan bakteri sayıları, mikrobiyolojik teknikler kullanılarak nicelendirilebilir. Alternatif olarak, immün yanıtlar, gerek recruit edilen hücrelerin fenotiplemesi için akış sitometrisi teknikleri gerekse kantitatif PCR teknikleri kullanılarak analiz edilebilir.

Başlamadan önce, ilgilenilen eksprese mRNA seviyelerini ölçmek için, prosedürün intranazal kolonizasyon kısmı için fare sabitleyiciler ve nazal lavajlar için kanüllü iğneler hazırlamanız gerekecektir. Bir fare sabitleyici, 50 mililitrelik bir falcon tüpünün konik ucunun kesilmesiyle basitçe hazırlanabilir. Açıklığı oluşturduktan sonra, keskin uçları düzeltmek için makas kullandığınızdan emin olun.

Kanüllü iğnelerin hazırlanması için, 0,38 milimetre iç çaplı PE 20 polietilen tüplerle birlikte şu malzemelere ihtiyacınız olacaktır: 26 ve 3/8 gauge eğimli iğnelerle kapatılmış bir milen şırınga, bir çift keskin, ince iris makası ve bir pens. PE 20 tüpü ince makasla yaklaşık 2,5 santimetre veya bir inç uzunluğunda parçalar halinde kesin ve her iki ucun da eğimli bir uca sahip olduğundan emin olun.

Pens kullanarak bu parçalardan birini dikkatlice iğnenizin ucuna geçirin. Tüp kısmını delmemeye dikkat ederek, kanüllü iğneler ihtiyaç duyulana kadar %70 etanol içinde saklanabilir ve kullanımdan hemen önce PBS ile yıkanabilir. Farelerin S. pneumoniae ile intranazal kolonizasyonu için, 10 µL içerisinde iletilen 10⁹ koloni oluşturan birim/ml konsantrasyonun kullanılmasını öneririz.

10⁷ CFU'luk bir son doz için, inokülumu kullanımdan hemen öncesine kadar buz üzerinde tutun ve her kolonizasyon arasında çalkaladığınızdan emin olun. İnoküluma ek olarak, steril pipet uçlarına sahip bir P 10 veya P 20 pipete ve fare sabitleyicinize ihtiyacınız olacaktır. Bireysel bir fareyi kuyruğundan tutarak izole edin ve önceden hazırladığınız fare sabitleyici aparatına yerleştirerek sabitleyin.

Fareyi sabitleyiciye yönlendirmekte zorlanıyorsanız, sabitleyiciyi farenin önüne ve üzerine yerleştirerek hayvanın yukarı doğru tırmanmasına izin vermek yardımcı olabilir. Fare sabitleyicinin içine girdiğinde, burnu sabitleyicinin konik ucundan çıkacak şekilde onu hafifçe yukarı iterek vücudunun alt kısmından sabitleyin. P 10 veya P 20 pipet kullanarak, hazırlanan kültürden 10 microliters'ı her iki burun deliğine eşit şekilde dağıtarak her fareye inoküle edin.

İnokülasyonu kademeli olarak uygulayarak, farenin inokülümü soluması için gerekli süreyi tanıyın ve inokülümün buruna damlamasını sağlayın. Farenin inokülümün bir kısmını burnundan hapşırarak atması beklenebilir. Bakterilerin nazofarenkste lokalize kalmasını ve alt solunum yollarına yayılmamasını sağlamak için farelerin bu işlem sırasında anestezi altında olması gerektiğini unutmayın.

Bu gösterim amacıyla PBS ile inokülasyon yapıyoruz, ancak canlı bakterilerle çalışırken prosedürü kurum tarafından onaylanmış kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirdiğinizden emin olun. Örneğin, çoğu kurum kolonizasyonun ikinci düzey biyogüvenlik kabininde yapılmasına şart koşacaktır. Bitiş noktası izleme yönteminizin bir parçası olarak ağırlık göstergelerini kullanıyorsanız, kolonizasyonun hemen ardından fareleri letarji, tüylerde karışıklık ve kilo kaybı dahil olmak üzere klinik semptomlar açısından her 12 ila 24 saatte bir izleyin.

Fareler kolonize olduktan sonra, onları istenen süre boyunca tutun. Bu sürenin sonunda, fareler ötanize edilir ve nazal lavaj uygulanır; çünkü servikal dislokasyon trakeaya zarar verme potansiyeline sahiptir. Bu ötanazi yönteminden kaçınılmalıdır.

Nazal lavajları gerçekleştirmeden önce, şu malzemelerin elinizin altında olduğundan emin olun. Önceden hazırlanmış kanüllü iğneler, %70 sulu etanol, bir pens, bir adet keskin ince iris makası, fosfat tamponlu salin, RNA lizis tamponu ve 1 ml'lik eppendorf tüpleri. Başlamaya hazır olduğunuzda, hayvanı sırt üstü düz bir şekilde yatırın ve %70 sulu etanol kullanarak kürkünün ön kısmını, özellikle boyun bölgesini sterilize edin.

Etanolün burun deliklerine ulaşmasını önlemeye dikkat edin. Hayvanın boynunun orta hattı boyunca tek bir boylamasına kesi yaparak trakeayı görebilmeniz için bir açıklık oluşturun. Alttaki boyun dokusunu ortaya çıkarmak için deriyi her iki yana dikkatlice sıyırın.

Bu aşamada, trakea her iki yanındaki boylamsal kaslarla çevrili olarak görünmelidir. Çevredeki damar yapısını kesmemeye dikkat ederek, trakeanın kendisini net bir şekilde görebilmek için bu kasları dikkatlice kesin. Damar yapısını yanlışlıkla kesmeniz ve işleme devam etmeden önce bölgede kan olması durumunda.

Kanamanın durmasını bekleyin ve ardından steril PBS döküp steril gazlı bezle fazla nemi nazikçe emdirerek bölgeyi birkaç kez temizleyin. Trakea uygun şekilde açığa çıktığında, trakeanın yaklaşık orta kısmına enine yarım ay şeklinde bir kesi yapın. Kanüllü bir şırıngaya steril PBS doldurun.

Kanülü, yerleştirme işlemini kolaylaştırmak için eğimli kenarı aşağı bakacak şekilde buruna doğru trakeaya yerleştirin. Kanül yerleştiğinde, 180 derece döndürün ve hafif bir direnç hissedene kadar nazikçe yukarıya doğru ilerletin. Örnek toplama için ayrılan EEND DPH tüpünü farenin burnunun hemen altına yerleştirin.

Minimal miktarda PBS lavaj sıvısı vererek kanülün doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini test edin. Kanül doğru yerleştirilmişse, bunun ardından farenin NAS bölgesinin çevresinde bir sıvı damlası oluşmalıdır. Test PBS'si doğrudan hayvanın ağzından çıkıyorsa, kanülü geri çekin ve çok hafif bir direnç hissedene kadar nazikçe ileriye doğru sürerek yeniden konumlandırın.

Kanülü bu direncin ötesine çok fazla itmemeye dikkat edin, aksi takdirde nazal palatı geçerek oral kaviteye ulaşabilirsiniz. Kanülün doğru şekilde konumlandırıldığını onayladığınızda, maksimum miktarda hücrenin yer değiştirmesine ve toplanmasına yardımcı olmak için hızla 200 µL PBS dağıtma işlemine geçin. İçerik, farenin burun deliklerinden dışarıya ve toplama tüpüne doğru akmalıdır.

Numuneyi derhal buz üzerine yerleştirin. Bu numunelerle daha sonra bakteriyel yükün yanı sıra hücresel göç için de analizler yapılabilir. RNA analizi için numune toplamak amacıyla, sekonder bir nazal lavaj gerçekleştirmek için 500 µL RNA liziz tamponu içeren ayrı bir kanüllü iğne kullanın.

RNA lizis tamponunun epitelyumu soyacağının ve çevre dokuyu yok edeceğinin unutulmaması gerekir. Bu nedenle, akciğerler gibi organlarla temas etmemesine dikkat edilmelidir. Nazofaringeal bakteriyel yükü nicelleştirmek için bu dokuların korunması isteniyorsa, aşağıdakilere ihtiyaç duyulacaktır.

Triptik soya yumurta içeren mikrobiyolojik plaklar, Epicor tüpleri ve %5 koyun kanı ile desteklenmiştir. Bir vorteks karıştırıcı, steril PBS, pipet uçları ile P 20 ve P 200 pipetleri kullanılır. İlk olarak, BSL 2 kabininde çalışarak her bir mirin nazal lavaj örneği için seri dilüsyon serisi hazırlayın.

Genel olarak, nazofarenkste S pneumoniae konsantrasyonlarının sıfır ile 10⁴ CFU arasında olması beklenir. Bu nedenle, üç adet on katlık seri dilüsyon gerçekleştirin, saf nazal lavaj örneğinden ilk tüpe 10 µL ekleyerek konsantrasyonu 10⁻¹ CFU/ml'ye getirin ve üç örnek aşırı derecede dilüye olana kadar aşağıya doğru devam edin; her dilüsyon arasında örnekleri iyice vorteksleyin. Lütfen bu videonun sadece gösterim amaçlı olduğunu unutmayın.

Seyreltmeler arasında pipet uçlarının değiştirilmesi dahil olmak üzere uygun laboratuvar tekniklerine her zaman bağlı kalınmalıdır. Bir keçeli kalem kullanarak, lojik plağınızı kadranlara ayırın ve kadranları üzerine ekilecek ilgili seyreltme ile etiketleyin. Her bir seyreltmenizden 10 µL'lik üç damla örneği agar plağına ekleyin. Bunların kapaksız olarak 15 ila 30 dakika kurumasını bekleyin, ardından plakların kapağını kapatın ve pnömokok gelişimi için optimal koşulların (genellikle 37 °C ve %5 CO2) bulunduğu bir bakteri inkübatörüne ters şekilde yerleştirin.

Bu plakları 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Bu sürenin sonunda plakları çıkarın ve plakta oluşan kolonilerin ortalamasını alarak kolonize olan bakteri sayısını belirleyin. Her dilüsyon için animo kolonileri, kendilerine özgü bej renklerinden ve agar içindeki kan takviyesinin bakteriyel sindirimi sonucu her koloninin etrafında oluşan küçük haleler şeklindeki alfa hemoliz bölgelerinden tanımlanabilir.

Ve son olarak, her koloninin merkezinde bulunan ve ona bir eritrosit görünümü veren küçük çökmelerle tanınırlar. Bu videoyu izledikten sonra, bir farede nazofaringeal kolonizasyonun nasıl kurulacağını, kolonizasyon sonrası nazal lavaj kullanarak farenin nazofarinksinden bakterilerin ve hücrelerin nasıl izole edileceğini ve mikrobiyolojik teknikler kullanarak ilgili bakteriyel yükün nasıl belirleneceğini derinlemesine kavramış olmanız gerekir. Bu videoda açıklanan yöntemlerin, yeterince çalışılmamış olan bu bölgedeki konakçı yanıtlarını incelemek için intranazal kolonizasyon modelini kullanmanız konusunda sizi teşvik edeceğini umuyoruz.