İnsan Bağırsak Epitel Hücreleri ve BALB / c Fare makrofajlar kullanarak Tolere edilebilir yağ asitleri ve Kolera Toksin Konsantrasyonları belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, hücre sağkalımını olumsuz etkilemeyen tolere edilebilir yağ asidi ve kolera toksini konsantrasyonlarını belirlemektir. Bu işlem, öncelikle uygun hücre tipinin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin, test edilecek üç farklı yağ asidinin değişen konsantrasyonları veya kolera toksini ile inkübe edilmesidir.

24 saat sonra, hücre sağkalımı bir MTT deneyi kullanılarak değerlendirilir. Nihayetinde, MTT deneyinden elde edilen spektrometri verileri, hücrelerin sağkalımında belirgin bir azalma olmaksızın uygulanabileceği optimal yağ asidi ve kolera toksini konsantrasyonlarını göstermektedir. Aşılamaların her zaman başarılı olmaması nedeniyle, bu tekniğin doğurduğu sonuçlar kolera enfeksiyonlarının önlenmesine yönelik katkı sağlamaktadır.

Tüm ko-toksin belirlemeleri için bowel C farelerinden elde edilen Mus musculus makrofajları kullanılacaktır; yağ asitlerinin daha geniş ölçekli konsantrasyon belirlemeleri için hücreler, %10 fetal bovine serum ve %1 antibiyotik antimikotik ile tamamlanmış L-glutamin içeren DMEM veya %10 fetal bovine serum, %5 L-glutamin ve %1 antibiyotik antimikotik ile tamamlanmış RPMI 1640 baz medyumdan herhangi birinde çoğaltılır. Bu protokol için bowel C hücrelerini, 37 °C'de, %95 hava ve %5 karbondioksit içeren, havalandırmalı kapaklı 75 cm²'lik Corning flasklarda büyütün. Küçük ölçekli yağ asidi konsantrasyon belirlemeleri için, %10 FBS ve 30 ng/mL ile tamamlanmış hypercare medyumunda, havalandırmalı kapaklı 75 cm²'lik Corning flasklarda çoğaltılmış insan intestinal epitel hücrelerini kullanın.

İnsan EGF kullanırken, üretici talimatları uyarınca antibiyotik ve antimikotik reaktifler kullanmayın; 37 °C'de, %95 hava ve %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Hücre tipine bağlı olarak, tüm hücreleri yaklaşık %70 konfluens düzeyindeyken 1:3 oranında pasajlayın; hücreler genellikle yağ asidi uygulamasından önce her iki ila beş günde bir pasajlanır. Yağ asitlerini hazırlayın: önce oleik, linoleik ve linolenik asitleri şirket tarafından sağlanan cam ampullerden steril cam şişelere aktarın. Ardından, her bir yağ asidini ayrı bir steril eppendorf tüpüne aktarın.

Her bir yağ asidini %100 Etanol içerisinde bir altı oranında seyrelterek çözün ve ardından son konsantrasyon 10 µg/µL olacak şekilde tamamlanmamış RPMI 1640 besiyeri ekleyin. Her bir çözeltiyi vorteksleyin ve -20 °C dondurucu plaka içerisinde saklamak üzere cam şişelere aktarın.

İnsan intestinal epitel hücrelerini, 96 kuyucuklu doku kültürü plakalarında kuyucuk başına 2.500 hücre olacak şekilde ekleyin ve her bir kuyucuğun toplam hacmini 200 µL'ye tamamlamak için uygun komple medyumu ekleyin. Hücreleri 37 °C, %95 hava ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca inkübe edin.

24 saatlik proliferasyon süresinin ardından besiyerini uzaklaştırın. Pozitif kontrol olarak, test edilecek her bir yağ asidinin uygun konsantrasyonlarını kuyucuklara ekleyin. Negatif kontrol olarak hücreleri komple besiyeri ile inkübe edin, hücreleri %70 etanol ile inkübe edin.

Ardından, her bir kuyucuğun toplam hacmini 200 microliters'a tamamlamak için tam besiyeri ekleyin. Kolera toksinini hücre tedavilerine hazırlamak için MTT analizi başlamadan önce işlem görmüş plakaları 24 saat boyunca inkübe edin. Kolera toksinini PBS içinde bir milligram per milliliter konsantrasyonda çözün.

Çözeltiyi kriyoviyallere paylaştırın ve hücre uygulamalarından önce 2 ila 8 °C'de saklayın. Toksini, son çalışma konsantrasyonu plaka başına 1 ng/µL olacak şekilde, sterilize edilmiş PBS veya eksiksiz olmayan DMEM ile 1/100 oranında seyreltin. Makrofajları 96 kuyucuklu plakada kuyucuk başına 2.500 hücre olacak şekilde ekleyin.

Kuyu tipi doku kültürü plaklarını 37 °C'de, %95 hava ve %5 karbondioksit içeren ortamda 24 saat inkübe edin. 24 saatlik proliferasyon süresinin ardından, besiyerini uzaklaştırın ve kuyucuklara uygun test konsantrasyonlarındaki kolera toksinini ekleyin. Yağ asidi uygulamalarında olduğu gibi, tüm örnekler ve uygulamalar için pozitif kontrol olarak komple besiyeri ve negatif kontrol olarak %70 etanol ile hücreleri inkübe edin.

Minimum üç tekrar kullanın; pozitif kontroller için daha fazla tekrar uygulayın. Her kuyucuğun toplam hacmini 200 microliters'a tamamlamak için tam besiyeri ekleyin. MTT deneyi başlamadan önce kolera toksini ile işlem görmüş plakaları 24 saat inkübe edin.

Hücreler yağ asitleri veya renkli tonla işlendikten 24 saat sonra, hücre canlılığı MTT analizi ile belirlenir. Test edilecek 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundaki solüsyonu uzaklaştırın ve yerine 200 microliters taze tamamlanmış besiyeri solüsyonu ekleyin.

Her bir kuyucuğa taze hazırlanmış 2.5 mg/mL MTT çözeltisinden 10 µL ekleyin. Plakayı 37 °C'de üç ila dört saat inkübe edin. Üç ila dört saat sonra, besiyeri çözeltisini boşaltın ve her birine izopropanol içinde 0.04 M hidroklorik asitten 100 µL ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, her kuyucuktaki çözeltiyi bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir pellet oluşana kadar veya bir dakika boyunca 20,000 GS hızında santrifüjleyin. Her örnekten 20 ile 40 µL arasını bir mikroplaka okuyucuya aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak 570 nm'de absorbansı ölçün.

Bu şekil, artan konsantrasyonlarda oleik asit, linoleik asit ve linoleik asit kullanılan tedaviler için pozitif kontrole bağlı olarak çoğu makrofajın sağkalımını göstermektedir. Hücrelerin, yağ asitlerinden herhangi biri için 100 ng/µL üzerindeki konsantrasyonları tolere etmediği açıkça görülmektedir. Deney, insan epitel hücreleri kullanılarak, 100 ng/µL'den düşük konsantrasyonlar için 10 ng/µL'lik artışlarla 70 ng/µL'ye kadar tekrarlanmıştır.

Bu grafik, oleik asidin her bir konsantrasyonu için hücre sağkalımını göstermektedir. Tek yönlü ANOVA, ortalamalardan bir veya daha fazlasının istatistiksel olarak farklı olduğunu göstermiştir. Ancak, yalnızca daha yüksek konsantrasyonlardaki uygulamalar, pozitif kontrole göre istatistiksel olarak farklı ortalamalar ortaya çıkarmıştır.

İlginç bir şekilde, gözlemlenen farklılıklar, daha fazla değişkenliğe sahip bir hücre canlılığı artışından kaynaklanmıştır. Linoleik ve linoleik asitler için benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bir yol.

Inova, tedavi ortalamalarının hiçbirinin pozitif kontrolün ortalamasından istatistiksel olarak farklı olmadığını göstermiştir; ancak bu sonuçlara göre, mikrolitre başına 60 nanogram linoleik asit gibi bazı yüksek konsantrasyonlarda değişkenliğin arttığı görülmektedir. İnsan intestinal epitel hücreleri kullanıldığında optimum yağ asidi konsantrasyonları, mikrolitre başına bir ile beş nanogram arasında görünmektedir. Farklı kolera toksini konsantrasyonlarının çoğu makrofaj sağkalımı üzerindeki etkileri de, toksin seviyeleri için nispeten geniş artışlarla yapılan tedavilerle test edilmiştir.

Her bir işlem için hücre canlılığının büyük ölçüde değişmesiyle, beklendiği üzere hücre sağkalımında azalan bir canlılık eğilimi gözlemlenmiştir. Canlılıktaki bu yüksek değişkenlik, pozitif kontrolün ortalaması ile işlemlerden herhangi biri arasında anlamlı bir fark oluşmamasına neden olmuş ve bu durum, 100 nanogram veya daha düşük toksin düzeylerinin daha ayrıntılı test edilmesine yol açmıştır. Bu grafik, daha düşük toksin düzeyi işlemlerindeki hücre canlılığını göstermektedir.

Hemen hemen tüm toksin konsantrasyonları için hücre canlılığı oldukça değişkendir; buna rağmen, uygulamalar sonucunda canlılıkta hafif artışlar gözlemlenmiştir. Bu artışlar, uygulamaların hiçbiri için pozitif kontrolün ortalamasıyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı değildir. Bu sonuçlara dayanarak.

Bowel C fare makrofajları geliştirildikten sonra kullanıldığında, önerilen kolera toksini konsantrasyonu tedavi başına 30 nanogramdan azdır. Bu teknik, kolera araştırmaları alanındaki araştırmacıların, yağ asitlerinin Vibrio cholerae enfeksiyonuna karşı bağışıklığı artırıp artırmayacağını keşfetmelerine yol açmıştır.