Name: Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, kanser hücrelerinde hücre yaşlanmasını hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için akış sitometrisi tabanlı yeni bir yöntemi. Doksorubisin ile indüklenen senesansı kantitatif olarak değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sitometri tesisin kullanımı için SF 4206 icore (Université de Caen) teşekkür ederim. JC Conseil de Radyokorunum d&#39;EDF ve Basse-Normandie Conseil Régional gelen doktora sonrası burslar aldı. Comites de l&#39;Orne et du Calvados - Bu veriler Ligue Nationale contre le Kanser tarafından finanse edilen projelerin bir parçasıydı.

1. C12FDG bafilomisin A1 ve Hücre Kültürü hazırlanması <ol><li> 20 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 12 C FDG toz çözülür. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza DMSO uygun emniyet koşulları ile birlikte kullanılmalıdır. </li><li> 0.1 mM nihai konsantrasyona kadar DMSO içinde bafilomisin A1 toz çözülür. De kısım ve mağaza - 20 ° C Bafilomisin uygun emniyet koşulları ile birlikte kullanılmalıdır. </li><li> 37,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 antibiyotik, ° C,% 5 CO2 içeren bir ortam içinde, RPMI 8226 hücre hattı ile, ya da bağlı olan veya olmayan diğer hücre hatları geliştirin. Deney için gereken hücre sayısı tahmin. Akış sitometrisi analizi sırasında yeterli sayıda kayıt altına almak için, 5 x 10 5 hücre gereklidir. Yaşlanan hücrelerin yüzdesini belirlemek için, üç hücre örnekleri gereklidir: etiketsiz örnek, tedavi edilmezse hücreleri C 12 FDG ile boyanmış, tedavi hücreleri ile boyandıC 12 FDG. </li><li> Hücrelerinin hücre çoğalmasını eğrisinin log-faz böylece tohum hücreleri, 24 saat önce bir deney. </li></ol> 2. Yaşlılık indüksiyon <ol><li> Bir kemoterapik madde ekleyerek kanser hücrelerinin yaşlanması neden olur. İlaç konsantrasyonu ve tedavi süresi, test edilen hücre tipi için adapte edilmelidir. Yaklaşık 10 6 hücre / ml &#39;de bir hücre konsantrasyonu 50 nM doksorubisin nihai konsantrasyonda, 48 saat tedavi ile başlar. (Negatif kontrol) tedavi edilmemiş örnek eklemeyi unutmayın. </li></ol> 3. Bafilomisin A1 Tedavi <ol><li> Önceki adımda kullanılan kemoterapik ilaç hücre apoptoza yol olabilir gibi, tripan mavisi (v / v) ile karıştırılması hücreleri tarafından hücre canlılığı edin. Bir Malassez odasına doldurun ve mavi hücreleri (ölü hücreleri) ve beyaz hücreleri (canlı hücreler) sayısını. Canlılığı yüzdesi en az% 70 olması durumunda, ölü hücreler ayni olabilirsağlamak için uygun bir kiti kullanılarak çekip çıkarılmış ölü hücreleri önyargı sonraki analiz olmaz ki. </li><li> Kültür ortamı çıkarın ve önceden ısıtılmış taze kültür ortamı ile değiştirin. Bafilomisin A1, 100 nM bir nihai konsantrasyon hücreler ile tedavi. Bafilomisin A1 lizozomlar asidik pH hale getirmek için kullanılır. 37 ° C,% 5 CO2 &#39;de 1 saat inkübe edin. </li></ol> 4. C 12 FDG Boyama <ol><li> 2 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar önceden ısıtılmış taze kültür ortamı C 12 FDG çözülür. </li><li> 33 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda hücrelere ait bileşik ekleyin ve 37 ° C&#39;de 2 saat inkübe ° C,% 5 CO2. Yapışmayan hücreler kullanılıyorsa, 4 ° C (hız kullanılan hücre tipi için ayarlanması sahip olabilir), 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj hücreler, PBS ile 2x yıkayın. Soğuk PBS ile 500 ul hücre pelletini. Yapışık hücreleri kullanıyorsanız, ortamı çıkarın ve PBS ile 2x yıkayın. Bir tripsin çözeltisi ve santrifüj kullanarak yapışık hücreler hasat4, 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri ° C (hız kullanılan hücre tipi için ayarlanabilir için) olabilir. Soğuk PBS ile 500 ul hücre pelletini. Her iki durumda da, hücre konsantrasyonu yaklaşık 10 6 hücre / ml olmalıdır. </li><li> Daha ihtiyarlık hücre popülasyonunun, karakterize etmek için bir ko-immün gerçekleştirin. </li></ol> 5. Sitometrisi Analizi <ol><li> Akış sitometresinin üretici tarafından önerilen kontrol boncuklar kullanarak akış sitometresinin kalibre edin. Tüm adımları için, en az 10 4 olaylar kaydedilmelidir. </li><li> Etiketsiz hücreleri içeren ilk örnek çalıştırın. Iki parametre grafik görüntüleme Forward Scatter Kanal (FSC) karşı Side Scatter Kanal (SSC) hazırlayın. Photomultiplier Tüpler (Proje Yönetim Ekipleri) ayarlayın ve örnek hazırlama sırasında ortaya olabilir ölü hücreleri ve hücresel enkaz faiz hariç bir bölge tanımlar. Günlük ölçekte FL1 gösteren tek parametre histogram Gate ilgi bu bölgedex-ekseni ve y-ekseni olayların sayısını. Olayların sayısı analiz hücrelerin sayısını temsil eder. Etiketsiz hücrelerin x-ekseninin günlük ölçekte ilk on görünür şekilde PMT ayarlayın. Gerekirse hücrelerin otofloresans belirler. </li><li> Tedavi edilmezse hücreleri içeren ikinci örnek çalıştırın. FL1 (C 12 FDG floresan) gösteren tek parametre histogramda, loş etiketli nüfusun sonra imleci. Bu eşik olmayan yaşlanan hücreleri (loş etiketli hücreleri) ve yaşlanan hücreler (parlak etiketli hücreleri) arasındaki ayrımcılığa izin verecek. </li><li> Tedavi edilen hücreleri içeren üçüncü örnek çalıştırın. Aydınlık hücreleri etiketli örneğin, senil hücrelerin önceki adımda belirlenen eşik üzerinde görüntülenir. Olaylarının toplam sayısı başına parlak etkinlikleri sayısına bölünmesiyle senil hücrelerin yüzdesini değerlendirmek. Gerekirse, β-galaktosidaz aktivitesi ortalama floresan kullanılarak tahmin edilebilir,yoğunluğu. </li></ol>

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li>
<li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li>
<li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li>
<li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis%3A+a+link+between+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li>
<li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li>
<li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%28beta%29-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada canlı kanser hücrelerinin hücresel yaşlanma ölçmek için bir akım sitometri tabanlı bir yöntem sundu. Bu yöntem, zarın geçirgen bileşik, C 12 FDG kullanımına dayanmaktadır, ve bu bileşiğin hücreler tarafından alınır gibi bu nedenle herhangi bir hücre tipinde ve uzun gibi çeşitli tedavilerden sonra kullanılabilir. Hücresel alımı üzerine, C 12 FDG senil hücrelerin lizozomlarında zenginleştirilmiş β-galaktosidaz ile hidrolize edilir. Lazer uyarımı geçtikten sonra, bileşik senil hücrelerin ölçümü...

Erken altmışlı ve Hayflick ve Moorhead tarafından keşfedilmesinden bu yana, yaşlılık hala bir cep merak 1 kalır. İnsan hücreleri süresiz yaşlanma ile, Hayflick ve Moorhead yaşlanma hücresel süreci icat, çoğalırlar ve yok. Yaşlanması hücresel ölüme karşı hücrelerin metabolik olarak aktif kaldığı istikrarlı bir hücre döngüsü tutuklama olduğunu. Telomer kısalması, DNA hasarı, kromatin pertürbasyon ve mitojenik onkogenler anormal ifadesi 2: Bugüne kadar, dört hücresel mekanizmaları yaşlanması neden gösterilmiştir. Bu, normal hücrelere değil sadece göstermekle kalmaz, ayrıca kanser hücrelerinin yaşlanmayı 3 geçmesi mümkündür. Nitekim olarak, yaşlanması geçiren kanser hücreleri daha fazla tümör ilerlemesi 4-5 için bir engel teşkil gösterilmiştir. Ancak, bazı raporlar artık belirli koşullar altında, hücresel yaşlanma da malignite 6-7 teşvik edebilir, dikkat çekmişlerdir. Kanser cel bir yaşlılık incelenmesils şu anda kemoterapötik ilaçların in vitro hem de in vivo 8&#39;de sadece kanser hücrelerinin yaşlanması yol açabilir kullanılan kanser araştırmalarında bir dürtü haline üzere. Senil hücrelerin varlığını araştırmak için ana tahlil asidik pH değerinde β-galaktosidaz deneyidir. Bu, histokimyasal deney en yaşlı hücrelerdeki meydana lizozomal biogenesizdeki artış gösterir. Kısaca, hücreler uygulanmış ekzojen X-gal, mavi bir renk 9 sebebiyet veren, yaşlanmış hücrelerin lizozomlarında zenginleştirilmiş β-galaktosidaz ile yarılır. Mavi ihtiyarlık hücreler daha sonra bir parlak saha mikroskop altında ölçülebilir. Çok popüler olsa da, β-galaktosidaz deney büyük sakıncaları sunulur. İlk olarak, bu tahlil sabit hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Bir mikroskop altında yaşlanan hücrelerin oldukça yüksek sayarak yaşlılık derecesini ölçmek için ima çünkü İkinci olarak, zaman alıcıdır. Üçüncü olarak, bu testteyaşlılık ve olmayan yaşlanan hücreler arasındaki ayrım tamamen gözlemci dayanır gibi hassas değildir. Burada canlı yaşlanan hücrelerin varlığı için değerlendirmek için bir keşfedilmemiş, hızlı ve hassas sitometri bazlı analiz tartışmak. Bu tahlil, bir membran geçirgen molekülünün hidrolizi, 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopiranosid (C 12 FDG) esas alınmaktadır, β-galaktosidaz ile yaşlı hücrelerdeki zenginleştirilmiştir. Hidroliz ve lazer uyarımı sonra C 12 FDG yeşil flüoresan yayan ve bu nedenle akış sitometrisi 10, 11 ile tespit edilebilir. Akım sitometrisi ile senil hücrelerin tespit hızlı ve hassas olma büyük bir avantaj sunar. Buna ek olarak, akış sitometrisi ile ihtiyarlık hücrelerin saptanması diğer hücresel markerlerin saptanması ile akuple edilebilir. Bu deney, kemoterapi ile tedavi edilen kanser hücrelerinin bir popülasyon içindeki senil hücrelerin tespit etmek için kullanılabilir ve rutin olarak ayarlanabilirkadar doku kesitlerinde, hücresel ayrışma sonra, klinikte.

<table><tbody><tr><td>5-dodekanoylaminofloresein di-&#946;-D-galaktopiranosid </td><td>İnvitrojen</td><td>D-2893</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit </td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomisin A1</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td></td></tr><tr><td>Doksorubisin</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 hücre kültürü ortamı</td><td>Lonza</td><td>BE12-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>PAA Laboratuvarları GmBH</td><td>A15 101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>Gibco</td><td>5290-018</td><td></td></tr><tr><td>Gallios akış sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94291</td><td></td></tr></tbody></table>

senesent kanser hücreleri ölçmek için bir hassas yöntem

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

İnsan hücreleri süresiz çoğalmaya yok. Dış ve / veya iç kuyrukları üzerine, hücreler ölür veya yaşlılık olarak adlandırılan sabit bir hücre siklüs hapsine girebilir. Bu telomer kısalması ve mitojenik onkogenlerin anormal ifadesi olarak çeşitli hücresel mekanizmaları, yaşlılık neden olduğu gösterilmiştir. Yaşlılık normal hücreler ile sınırlı değildir, kanser hücreleri de senesce bildirilmiştir. Kemoterapik ilaçlar kanser hücrelerinde yaşlanmasının neden olduğu gösterilmiştir. Ancak, yaşlılık engelleyen veya tümörogenez teşvik olmadığını tartışmalıdır. Bunun sonunda hastaya özgü olabilir gibi, kanser hücresi yaşlanmayı değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yöntem bir süre gerekli olacaktır. Bu amaçla, standart β-galaktosidaz deney, şu anda kullanılan yöntem, büyük sakıncaları sunulur: o zaman alıcı ve duyarlı değildir. Burada li yaşlılık çalışma bir akım sitometri bazlı analiz teklifhücreleri ettik. Bu deney, hassas ve hızlı olma avantajına sahiptir, ve çeşitli hücresel belirteçlerin immün akuple edilebilir.

Multipl Miyelom, bir hematolojik kanser, bir kemoterapik prosedür ile uyarılan yaşlanmayı değerlendirmek için kullanılmıştır. Bir ticari olarak temin edilebilen MM hücre hattı (RPMI 8226) doksorubisin, bir kemoterapik madde ile 2 gün boyunca tedavi edildi yapmak için. Hücreler daha sonra bafilomisin A1 muameleye tabi tutulur ve daha da C 12 FDG ile inkübe edildi. Hücreler akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1, senil hücrelerin yüzdesi C 12 FDG kullanımı ile, bir gün içind...

Yaşlanması önler veya tümörogenez tartışmalıdır teşvik olsun. Kemoterapik ilaçlar senesce için kanser hücrelerinin neden olabilir bu yana, yaşlılık okuyan yeni tedaviler önermek için gereklidir. Ancak, standart ve geniş kullanılan β-galaktosidaz tahlil büyük sakıncaları sunar. Burada yaşlılık ölçmek için hızlı ve hassas akım sitometri bazlı analiz öneriyoruz.

Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre yaşlanmasını hızlı ve hassas bir şekilde nicelleştirmektir. Burada, potansiyel kemoterapötik ilaçların taranmasında bu yöntemin faydasını gösteriyoruz. İlk olarak hücresel yaşlanma indüklenir.Kanser hücrelerine kemoterapötik ilaç doxorubicin eklenir. Ardından, hücresel lizozomların asidik pH'ını nötralize etmek için Bain A one uygulanır. Daha sonra, hücresel alım üzerine hücre geçirgen beta galacto substratı C 12 FDG eklenir.C 12 FDG hidrolize olur ve floresan yayar. Beta GCSE'ler senesent hücrelerin lizozomlarında zenginleştiğinden, bu hücreler senesent olmayan hücrelere göre daha fazla floresan özellik gösterirler. Floresan farkını nicelleştirmek için hücreler bir akış sitometresinde analiz edilir; elde edilen verilerin analizi, farklı tedavi koşulları altındaki senesent kanser hücrelerinin yüzdesinin nicelleştirilmesine olanak tanır.Bu tekniğin beta-galaktozidaz gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, senesent hücrelerin hızlı ve hassas bir şekilde kantifikasyonunu kolaylaştırmasıdır. Aslında, bu yönteme dair fikri ilk olarak, yaygın olarak kullanılan beta-galaktozidaz analizi ile senesent hücrelerin kantifikasyonunda zorluk yaşadığımızda geliştirdik. Bu tekniği kanser hücrelerinde senesansı tespit etmek için kullanmış olsak da, normal hücreler üzerinde de kullanılabilir.Bu yöntem, kemoterapötik bir ilacın kanser hücrelerini maligniteyi artırabilecek şekilde sse'ye yönlendirip yönlendirmediği gibi, kanser alanındaki hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu teknik nihayetinde kanser için yeni terapötik tedavilerin belirlenmesine katkı sağlayabilir. Kimyasal çeker ocak içerisinde çalışarak, C 12 FDG tozunu DMSO içinde 20 millimolar nihai konsantrasyona gelecek şekilde çözün, 0,5 milliliter'lik eppendorf tüplerine paylaştırın ve minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.DMSO uygun güvenlik koşulları altında kullanılmalı ve CIN A tozu DMSO içinde 0,1 mM nihai konsantrasyonda çözülmelidir. Çözeltiyi 0,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine paylaştırın ve -20 °C'de saklayın.Not: CIN, uygun güvenlik önlemleri ile kullanılmalıdır. Bu prosedür, hem adheran hem de non-adheran hücreler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada prosedür, insan miyelom hücre hattı RPMI 8 2 2 6 kullanılarak gösterilmiştir.Bu hücreler süspansiyon halinde büyür; RPMI 8 2 2 6 hücrelerini %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren ortamda, 37 degrees Celsius ve %5 carbon dioxide koşullarında kültüre edin. Deneyi gerçekleştirmeden 24 saat önce, hücrelerin hücresel proliferasyon eğrisinin log fazında olmalarını sağlamak için hücreleri altı kuyuklu plakalara ekleyin. Senesent hücrelerin yüzdesini belirlemek için deney sırasında üç hücre örneği gerekecektir: İşlem görmemiş ve ST ile boyanmamış hücreler, C 12 FDG ile boyanmış işlem görmemiş hücreler ve C 12 FTG ile boyanmış işlem görmüş hücreler.Kanser hücrelerinin akış sitometrisi ile indüklenen senesansı için her koşulda minimum beş çarpı 10 üzeri 5 hücre gereklidir. Kemoterapötik ilaç doksorubisin ekleyerek, ilaç konsantrasyonu ve tedavi süresi hücre tipine göre uyarlanmalıdır. rpmi 8 2 2 6 hücreleri için test edilmiştir.Senesans, mililitre başına altı hücreden 10'unun 48 saat boyunca 15 nanomolar doksorubisin ile işleme tabi tutulmasıyla indüklenebilir. Negatif kontrol olarak işlem görmemiş örneği dahil etmeyi unutmayın; 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Kemoterapötik ilaçlarla yapılan tedavi, hücre apoptozisine yol açabilir.Bu nedenle, iki gün sonra, bir hemositometre ve mikroskop kullanarak trypan mavi dışlama yöntemiyle hücre canlılığını kontrol edin. Canlılık yüzdesi %70'den düşükse, ölü hücrelerin sonraki analizleri etkilememesini sağlamak için Milton E'den alınan ölü hücre uzaklaştırma kiti gibi uygun bir kit kullanarak ölü hücreleri uzaklaştırın. Aksi takdirde, hücreleri 300 ×g'de beş dakika santrifüj ederek kültür ortamını uzaklaştırın.Ardından, süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, lizozomların asidik pH'ını nötralize etmek için 100 anom veya cin, A bir içeren ön ısıtılmış taze kültür ortamında 37 °C ve %5 karbon dioksit altında bir saat inkübe edin. Beta galakto a substratı C 12 FDG'yi, ön ısıtılmış taze kültür ortamında 2 mM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde çözün. Beilmycin ile inkübasyonu takiben.C 12 FDG'yi, final konsantrasyonu 33 µM olacak şekilde doğrudan hücrelere ve besiyerine ekleyin; 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücreleri 4 °C'de 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjden sonra, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın; her seferinde daha önce olduğu gibi çöktürme işlemi uygulayın ve ikinci yıkamadan sonra süpernatantı uzaklaştırın. Hücre peletini 500 µL soğuk PBS içinde yeniden süspande edin ve ardından senesent hücre popülasyonunu daha ayrıntılı karakterize etmek için ko-immün etiketleme gerçekleştirin. Akış sitometrisi konusunda deneyiminiz yoksa, bu prosedürün en zor kısmı akış sitometrisi analizini gerçekleştirmek olacaktır.Başarıyı garanti altına almak için uygun kontrolleri eklediğinizden emin olun ve gerektiğinde deneyimsiz kişilerden yardım isteyin. İlk örneği çalıştırmadan önce, ileri saçılım kanalı (FSC) ile yan saçılım kanalının (SSC) karşılaştırıldığı iki parametreli bir grafik hazırlayın. Ardından, işaretlenmemiş hücreler içeren ilk örneği çalıştırın.Fotomultiplier tüpleri veya PMT'leri ayarlayın ve örnek hazırlama kapısı sırasında ortaya çıkmış olabilecek ölü hücreleri ve hücresel debrisleri hariç tutarak bir ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın. Bu ilgi bölgesi, C 12 FDG floresansını x ekseninin logaritmik ölçeğinde FL bir olarak ve olay sayısını Y ekseninde görüntüleyen tek parametreli bir histogramdadır. Toplam olay sayısı, analiz edilen hücre sayısını temsil eder.İşaretlenmemiş hücreler, x ekseninin logaritmik ölçeğindeki ilk onluk dilimde görünecek şekilde PMT'yi ayarlayın. Gerekiyorsa, işaretlenmemiş hücreleri akış sitometresinden geçirerek hücrelerin otofloresansını belirleyin. İşlem görmemiş hücreleri içeren ikinci örneği, FL1'i gösteren tek parametreli histogramda çalıştırın ve imleci hafif işaretli popülasyondan sonraya yerleştirin.Bu eşik, sönük şekilde işaretlenmiş senesent olmayan hücreler ile parlak şekilde işaretlenmiş senesent hücrelerin ayırt edilmesini sağlayacaktır. İşlem görmüş hücreleri içeren üçüncü örneği çalıştırın. Parlak şekilde işaretlenmiş senesent hücreler, önceki adımda belirlenen eşiğin üzerinde görünür.Gerektiğinde, parlak olay sayısını toplam olay sayısına bölerek senesen (yaşlılık) hücrelerin yüzdesini değerlendirin. Kemoterapötik bir prosedürün indüklediği senesansı değerlendirmek için beta galaktosidaz aktivitesi, ortalama floresans yoğunluğu kullanılarak da tahmin edilebilir. Ticari olarak mevcut olan RRPI 8226 multipl miyelom hücre hattı, kemoterapötik bir ilaç olan doksorubisin ile iki gün boyunca işleme tabi tutulmuş ve bu videoda açıklandığı üzere senesans analizi yapılmıştır; bu histogramlar solda işlem görmemiş hücrelerin, sağda ise işlem görmüş hücrelerin floresansını göstermektedir.Bölge V'de, senesent hücreleri temsil eden parlak şekilde işaretlenmiş bir hücre popülasyonu görülmektedir. Paralel olarak, aynı hücre örneği beta galaktosidaz testi kullanılarak boyanmıştır. Bu temsili resimde, tamamen mavi hücreler ve kısmen mavi hücreler, gerçek mavi senesent hücreleri ayırt etmedeki zorluğu göstermek için sunulmuştur. Senesent hücrelerin yüzdesinin belirlenmesinde C 12 FDG'nin özgüllüğünü göstermek amacıyla, hücreler çeşitli konsantrasyonlarda doksorubisin ile de işleme tabi tutulmuştur.Senesens hücrelerin yüzdesi, parlak olayların sayısının toplam olay sayısına bölünmesiyle belirlenmiştir. Sırasıyla 5, 25 ve 50 nanomolar doksorubisin dozu için senesen hücrelerin yüzdeleri %0,8, %15,78 ve %26,31 olarak bulunmuştur. Bu durum, C 12 FTG işaretlemesinin senesen hücrelere özgü olduğunu göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedür takip edilerek akış sitometrisi ile senesan hücrelerin nasıl nicelendirileceğine dair iyi bir anlayış kazanmış olmalı ve senesan hücreleri karakterize etmek için immün işaretleme gibi yöntemlerin nasıl uygulanacağını öğrenmiş olmalısınız. DMSO veya kanser hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman önlemler alınmalıdır.

a-sensitive-method-to-quantify-senescent-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, çift yaşlanma belirteçleri ile tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerini ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Yaşlanan hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi, bir β-galaktosidaz substratının kullanılmasını içerir. Substrat, yaşlanan hücreler içindeki aktif lizozomal β-galaktosidaz ile parçalanır ve otofloresan lipofusin granülleri ile birlikte yaşlanan kanser hücrelerini işaretleyen bir floresan ürün üretir.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinin Akış Sitometrisine Dayalı Miktar Tayini

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsü tutuklama tersinmez durum, çeşitli hücresel stresler tarafından indüklenebilir. Burada, yaşlanmanın işaretlerini değerlendirmek için hücre yaşlanmasının ve yöntemleri ikna etmek protokolleri açıklar.

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

Burada, bir dizi indüksiyon için protokol ve kültürlü hücrelerdeki hücresel yaşlanma doğrulanmasını tartışmak. Biz farklı yaşlanma-inducing uyaranlara üzerinde odaklanmak ve ortak yaşlanma ilişkili işaretçileri miktar açıklayın. Fibroblastlar içerebilen bir model olarak kullanarak teknik ayrıntıları sağlar, ancak iletişim kuralları için çeşitli hücresel modelleri adapte edilebilir.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Hücre içi ROS hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında miktarının için hassas bir tahlil açıklayın. Ayrıca bildirildi çeşitli yaş ile ilgili işlev bozuklukları için katkıda yaşlanma ilişkili salgı fenotip, değerlendirmek için protokolleri sağlar.

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Kemoterapi ilaçlarının hücre kültüründe veya murin tümör modellerinde indüklediği yaşlanan kanser hücrelerinin floresan, akım sitometrik nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur. İsteğe bağlı prosedürler arasında ko-immün boyama, büyük parti veya zaman noktası analizini kolaylaştırmak için numune fiksasyonu ve akış sitometrik sıralama ile canlı yaşlanan hücrelerin zenginleştirilmesi yer almaktadır.

Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu

Bu çalışma, gerçek zamanlı izleme ile üç in vitro model kullanarak, yaşlanan HeLa hücrelerinden yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi (SASP) faktörlerinin yaşlanmayan HeLa hücreleri üzerindeki proliferatif etkilerini değerlendirmektedir. Kanserde hücre-hücre etkileşimlerini daha iyi anlamak için her yöntemin avantajları ve sınırlamaları sistematik olarak karşılaştırıldı.

SASP Faktörlerinin Kanser Hücrelerinin Proliferasyonu Üzerindeki Etkisinin Üç Farklı Metodolojinin Karşılaştırmalı Analizi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Bu protokol, insan yağ dokusundan izole edilen stromal damar fraksiyonunda yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin objektif ve tek hücreli tespiti için yansıtılmış ışık konfokal mikroskopisi sunmaktadır. Yöntem, immünositokimya ile uyumludur, nicel değerlendirme için pH kontrollerini içerir ve ayrıca geleneksel SA-β-gal boyamaya daha hassas ve daha az öznel bir alternatif sunar.

Yağlı stromal damar fraksiyonunda yansıtılan ışık kullanılarak yaşlanma tespiti

Bu makale, IMR-90 insan fibroblastlarında yaşlanma sırasında lizozomal yeniden modelleşmeyi ölçmek için canlı hücreli bir LysoTracker protokolünü sunmaktadır.

İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Öğrenin, kanser hücrelerinde hücre yaşlanmasını hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için akış sitometrisi tabanlı yeni bir yöntemi. Doksorubisin ile indüklenen senesansı kantitatif olarak değerlendirin.

Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Daha fazla video keşfet