Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, hücre yaşlanmasını hızlı ve hassas bir şekilde nicelleştirmektir. Burada, potansiyel kemoterapötik ilaçların taranmasında bu yöntemin faydasını gösteriyoruz. İlk olarak hücresel yaşlanma indüklenir.

Kanser hücrelerine kemoterapötik ilaç doxorubicin eklenir. Ardından, hücresel lizozomların asidik pH'ını nötralize etmek için Bain A one uygulanır. Daha sonra, hücresel alım üzerine hücre geçirgen beta galacto substratı C 12 FDG eklenir.

C 12 FDG hidrolize olur ve floresan yayar. Beta GCSE'ler senesent hücrelerin lizozomlarında zenginleştiğinden, bu hücreler senesent olmayan hücrelere göre daha fazla floresan özellik gösterirler. Floresan farkını nicelleştirmek için hücreler bir akış sitometresinde analiz edilir; elde edilen verilerin analizi, farklı tedavi koşulları altındaki senesent kanser hücrelerinin yüzdesinin nicelleştirilmesine olanak tanır.

Bu tekniğin beta-galaktozidaz gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, senesent hücrelerin hızlı ve hassas bir şekilde kantifikasyonunu kolaylaştırmasıdır. Aslında, bu yönteme dair fikri ilk olarak, yaygın olarak kullanılan beta-galaktozidaz analizi ile senesent hücrelerin kantifikasyonunda zorluk yaşadığımızda geliştirdik. Bu tekniği kanser hücrelerinde senesansı tespit etmek için kullanmış olsak da, normal hücreler üzerinde de kullanılabilir.

Bu yöntem, kemoterapötik bir ilacın kanser hücrelerini maligniteyi artırabilecek şekilde sse'ye yönlendirip yönlendirmediği gibi, kanser alanındaki hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu teknik nihayetinde kanser için yeni terapötik tedavilerin belirlenmesine katkı sağlayabilir. Kimyasal çeker ocak içerisinde çalışarak, C 12 FDG tozunu DMSO içinde 20 millimolar nihai konsantrasyona gelecek şekilde çözün, 0,5 milliliter'lik eppendorf tüplerine paylaştırın ve minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.

DMSO uygun güvenlik koşulları altında kullanılmalı ve CIN A tozu DMSO içinde 0,1 mM nihai konsantrasyonda çözülmelidir. Çözeltiyi 0,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine paylaştırın ve -20 °C'de saklayın.

Not: CIN, uygun güvenlik önlemleri ile kullanılmalıdır. Bu prosedür, hem adheran hem de non-adheran hücreler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada prosedür, insan miyelom hücre hattı RPMI 8 2 2 6 kullanılarak gösterilmiştir.

Bu hücreler süspansiyon halinde büyür; RPMI 8 2 2 6 hücrelerini %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren ortamda, 37 degrees Celsius ve %5 carbon dioxide koşullarında kültüre edin. Deneyi gerçekleştirmeden 24 saat önce, hücrelerin hücresel proliferasyon eğrisinin log fazında olmalarını sağlamak için hücreleri altı kuyuklu plakalara ekleyin. Senesent hücrelerin yüzdesini belirlemek için deney sırasında üç hücre örneği gerekecektir: İşlem görmemiş ve ST ile boyanmamış hücreler, C 12 FDG ile boyanmış işlem görmemiş hücreler ve C 12 FTG ile boyanmış işlem görmüş hücreler.

Kanser hücrelerinin akış sitometrisi ile indüklenen senesansı için her koşulda minimum beş çarpı 10 üzeri 5 hücre gereklidir. Kemoterapötik ilaç doksorubisin ekleyerek, ilaç konsantrasyonu ve tedavi süresi hücre tipine göre uyarlanmalıdır. rpmi 8 2 2 6 hücreleri için test edilmiştir.

Senesans, mililitre başına altı hücreden 10'unun 48 saat boyunca 15 nanomolar doksorubisin ile işleme tabi tutulmasıyla indüklenebilir. Negatif kontrol olarak işlem görmemiş örneği dahil etmeyi unutmayın; 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Kemoterapötik ilaçlarla yapılan tedavi, hücre apoptozisine yol açabilir.

Bu nedenle, iki gün sonra, bir hemositometre ve mikroskop kullanarak trypan mavi dışlama yöntemiyle hücre canlılığını kontrol edin. Canlılık yüzdesi %70'den düşükse, ölü hücrelerin sonraki analizleri etkilememesini sağlamak için Milton E'den alınan ölü hücre uzaklaştırma kiti gibi uygun bir kit kullanarak ölü hücreleri uzaklaştırın. Aksi takdirde, hücreleri 300 ×g'de beş dakika santrifüj ederek kültür ortamını uzaklaştırın.

Ardından, süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, lizozomların asidik pH'ını nötralize etmek için 100 anom veya cin, A bir içeren ön ısıtılmış taze kültür ortamında 37 °C ve %5 karbon dioksit altında bir saat inkübe edin. Beta galakto a substratı C 12 FDG'yi, ön ısıtılmış taze kültür ortamında 2 mM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde çözün. Beilmycin ile inkübasyonu takiben.

C 12 FDG'yi, final konsantrasyonu 33 µM olacak şekilde doğrudan hücrelere ve besiyerine ekleyin; 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücreleri 4 °C'de 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın; her seferinde daha önce olduğu gibi çöktürme işlemi uygulayın ve ikinci yıkamadan sonra süpernatantı uzaklaştırın. Hücre peletini 500 µL soğuk PBS içinde yeniden süspande edin ve ardından senesent hücre popülasyonunu daha ayrıntılı karakterize etmek için ko-immün etiketleme gerçekleştirin. Akış sitometrisi konusunda deneyiminiz yoksa, bu prosedürün en zor kısmı akış sitometrisi analizini gerçekleştirmek olacaktır.

Başarıyı garanti altına almak için uygun kontrolleri eklediğinizden emin olun ve gerektiğinde deneyimsiz kişilerden yardım isteyin. İlk örneği çalıştırmadan önce, ileri saçılım kanalı (FSC) ile yan saçılım kanalının (SSC) karşılaştırıldığı iki parametreli bir grafik hazırlayın. Ardından, işaretlenmemiş hücreler içeren ilk örneği çalıştırın.

Fotomultiplier tüpleri veya PMT'leri ayarlayın ve örnek hazırlama kapısı sırasında ortaya çıkmış olabilecek ölü hücreleri ve hücresel debrisleri hariç tutarak bir ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın. Bu ilgi bölgesi, C 12 FDG floresansını x ekseninin logaritmik ölçeğinde FL bir olarak ve olay sayısını Y ekseninde görüntüleyen tek parametreli bir histogramdadır. Toplam olay sayısı, analiz edilen hücre sayısını temsil eder.

İşaretlenmemiş hücreler, x ekseninin logaritmik ölçeğindeki ilk onluk dilimde görünecek şekilde PMT'yi ayarlayın. Gerekiyorsa, işaretlenmemiş hücreleri akış sitometresinden geçirerek hücrelerin otofloresansını belirleyin. İşlem görmemiş hücreleri içeren ikinci örneği, FL1'i gösteren tek parametreli histogramda çalıştırın ve imleci hafif işaretli popülasyondan sonraya yerleştirin.

Bu eşik, sönük şekilde işaretlenmiş senesent olmayan hücreler ile parlak şekilde işaretlenmiş senesent hücrelerin ayırt edilmesini sağlayacaktır. İşlem görmüş hücreleri içeren üçüncü örneği çalıştırın. Parlak şekilde işaretlenmiş senesent hücreler, önceki adımda belirlenen eşiğin üzerinde görünür.

Gerektiğinde, parlak olay sayısını toplam olay sayısına bölerek senesen (yaşlılık) hücrelerin yüzdesini değerlendirin. Kemoterapötik bir prosedürün indüklediği senesansı değerlendirmek için beta galaktosidaz aktivitesi, ortalama floresans yoğunluğu kullanılarak da tahmin edilebilir. Ticari olarak mevcut olan RRPI 8226 multipl miyelom hücre hattı, kemoterapötik bir ilaç olan doksorubisin ile iki gün boyunca işleme tabi tutulmuş ve bu videoda açıklandığı üzere senesans analizi yapılmıştır; bu histogramlar solda işlem görmemiş hücrelerin, sağda ise işlem görmüş hücrelerin floresansını göstermektedir.

Bölge V'de, senesent hücreleri temsil eden parlak şekilde işaretlenmiş bir hücre popülasyonu görülmektedir. Paralel olarak, aynı hücre örneği beta galaktosidaz testi kullanılarak boyanmıştır. Bu temsili resimde, tamamen mavi hücreler ve kısmen mavi hücreler, gerçek mavi senesent hücreleri ayırt etmedeki zorluğu göstermek için sunulmuştur. Senesent hücrelerin yüzdesinin belirlenmesinde C 12 FDG'nin özgüllüğünü göstermek amacıyla, hücreler çeşitli konsantrasyonlarda doksorubisin ile de işleme tabi tutulmuştur.

Senesens hücrelerin yüzdesi, parlak olayların sayısının toplam olay sayısına bölünmesiyle belirlenmiştir. Sırasıyla 5, 25 ve 50 nanomolar doksorubisin dozu için senesen hücrelerin yüzdeleri %0,8, %15,78 ve %26,31 olarak bulunmuştur. Bu durum, C 12 FTG işaretlemesinin senesen hücrelere özgü olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedür takip edilerek akış sitometrisi ile senesan hücrelerin nasıl nicelendirileceğine dair iyi bir anlayış kazanmış olmalı ve senesan hücreleri karakterize etmek için immün işaretleme gibi yöntemlerin nasıl uygulanacağını öğrenmiş olmalısınız. DMSO veya kanser hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman önlemler alınmalıdır.