Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, hücre yaşlanmasını hızlı ve hassas bir şekilde ölçmektir. Burada, bu yöntemin potansiyel kemoterapötik ilaçların taranmasında faydasını gösteriyoruz. İlk önce hücresel yaşlanmayı indüklemek için.

Kemoterapötik ilaç doksorubisin kanser hücrelerine eklenir. Daha sonra, hücresel lizozomların asidik pH'ını nötralize etmek için Bain A uygulanır. Daha sonra hücre permeat beta galakto substratı C 12 FDG, hücresel alım üzerine eklenir.

C 12 FDG hidrolize edilir ve floresan verir. Beta GCSE'ler yaşlanan hücrelerin lizozomlarında zengin olduğundan, yaşlanmayan hücrelerden daha fazla floresan hale gelirler. Floresanstaki farkı ölçmek için, hücreler bir akış üzerinde çalıştırılır Elde edilen verilerin sitometre analizi, farklı tedavi koşulları altında yaşlanan kanser hücrelerinin yüzdesinin ölçülmesine izin verir.

Bu tekniğin beta galaktoz gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yaşlanan hücrelerin hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesini kolaylaştırmasıdır. Aslında, bu yöntem fikrini ilk olarak, yaygın olarak kullanılan beta galaktoz tahlilini kullanarak yaşlanan hücreleri ölçmede zorluk yaşadığımızda ekliyoruz. Bu tekniği kanser hücrelerinde yaşlanmayı tespit etmek için kullanmamıza rağmen, normal hücrelerde de kullanılabilir.

Bu yöntem, kemoterapötik bir ilacın kanser hücrelerini sse'ye indükleyip indüklemediği ve bunun da maligniteyi teşvik edip etmediği gibi kanser alanındaki hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu teknik sonuçta kanser için yeni terapötik tedavilerin bildirilmesine yardımcı olabilir. Kimyasal bir davlumbazda çalışmak, C 12 FDG tozunu DMSO'da 20 milimolar alikotluk nihai konsantrasyona 0.5 mililitrelik einor tüplere çözdü ve eksi 80 santigrat derecede sakladı.

DMSO uygun güvenlik koşulları ile kullanılmalı, ayrıca çözülmelidir. CIN A, DMSO'da bir toz halinde 0.1'lik bir nihai konsantrasyona kadar. Milimolar Eloqua, çözeltiyi 0.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine koyun ve eksi 20 santigrat derecede saklayın.

CIN'in uygun güvenlik önlemleriyle kullanılması gerektiğini unutmayın. Bu prosedür, yapışık veya yapışık olmayan hücreler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada prosedür, insan miyelom hücre hattı RPMI 8 2 2 6 kullanılarak gösterilmiştir.

Bu hücreler süspansiyon halinde büyür, deneyi gerçekleştirmeden 24 saat önce 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren ortamda RPMI 8 2 2 6 hücrelerini yetiştirir, hücreleri altı oyuklu plakalarda tohumlar, böylece hücresel proliferasyon eğrisinin log fazında olurlar. Deney sırasında, yaşlanan hücrelerin yüzdesini belirlemek için üç hücre örneği gerekli olacaktır. İşlenmemiş ve ST boyanmamış hücreler, C 12 FDG ile boyanmış tedavi edilmemiş hücreler ve C 12 FTG ile boyanmış tedavi edilmiş hücreler.

Her koşul için, kanser hücrelerinin akış sitometrisi ile indüklenen yaşlanması için en az beş kez 10 ila beşinci hücre gereklidir. Kemoterapötik ilaç doksorubisin eklenerek, ilaç konsantrasyonu ve tedavi süresi hücre tipine göre uyarlanmalıdır. rpmi 8 2 2 6 hücreleri için test edilmiştir.

Yaşlanma, mililitredeki altı hücrenin 10'uncusunun 48 saat boyunca 15 nanomolar doksorubisin ile muamele edilmesiyle indüklenebilir. İşlenmemiş numuneyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte negatif kontrol inkübasyonu olarak eklemeyi unutmayın. Kemoterapötik ilaçlarla tedavi hücre apoptozuna yol açabilir.

Bu nedenle, iki gün sonra, bir hemo, sitometre ve bir mikroskop kullanarak trian mavisi dışlama ile hücre canlılığını kontrol edin. Canlılık yüzdesi %70'in altındaysa, ölü hücrelerin sonraki analizi önyargılı hale getirmemesini sağlamak için Milton E'nin ölü hücre çıkarma kiti gibi uygun bir kit kullanarak ölü hücreleri çıkarın. Aksi takdirde, hücreleri beş dakika boyunca 300 GS'de döndürerek kültür ortamını çıkarın.

Daha sonra, 100 anom veya cin içeren Prewarm taze kültür ortamında süpernatanı çıkardıktan sonra, lizozomların asidik pH'ını nötralize etmek için bir tane, 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin ve% 5 karbondioksit, beta galakto a substratı C 12 FDG'yi savaş öncesi taze kültürde çözer. Orta ila iki milimolar nihai konsantrasyon. Beil mycin ile inkübasyonun ardından.

C 12 FDG'yi doğrudan hücrelere ve ortama 33 ° C'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Mikromolar, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin.

Sıkma işleminden sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, her seferinde daha önce olduğu gibi aşağı doğru döndürün ve ikinci yıkamadan sonra süpernatanı çıkarın. Resus, hücre peletini 500 mikrolitre soğuk PBS'de askıya alır, ardından yaşlanan hücrelerin popülasyonunu daha fazla karakterize etmek için bir ortak immün etiketleme gerçekleştirir. Akış sitometrisi ile ilgili deneyiminiz yoksa, bu prosedürün en zor yönü akış sitometrisi analizini yapmak olacaktır.

Başarıyı sağlamak için uygun kontrolleri eklediğinizden ve gerektiğinde deneyimsiz kişilerden yardım aldığınızdan emin olun. İlk numuneyi çalıştırmadan önce, ileri saçılma kanalını veya FSC'yi yan saçılma kanalı SSC'ye karşı gösteren iki parametreli bir grafik hazırlayın. Ardından, etiketlenmemiş hücreler içeren ilk örneği çalıştırın.

Fotoçoğaltıcı tüpleri veya PMT'leri ayarlayın ve numune hazırlama kapısı sırasında ortaya çıkmış olabilecek ölü hücreler ve hücresel kalıntılar hariç olmak üzere bir ilgi alanı tanımlayın. C 12 FDG'nin floresansını FL olarak gösteren tek parametreli bir histogramdaki bu ilgi alanı, x ekseninin log ölçeğinde bir tane ve Y eksenindeki olay sayısı. Toplam olay sayısı, analiz edilen hücre sayısını temsil eder.

PMT'yi, etiketlenmemiş hücreler x ekseninin günlük ölçeğinde ilk on yılda görünecek şekilde ayarlayın. Gerekirse, etiketlenmemiş hücreleri akışta çalıştırarak hücrelerin otofloresansını belirleyin. Sitometre, işlenmemiş hücreleri içeren ikinci numuneyi, FL'yi gösteren bir parametre histogramında çalıştırır ve imleci loş etiketli popülasyondan sonra bir yere yerleştirir.

Bu eşik, loş etiketli yaşlanmayan hücreler ile parlak etiketli yaşlanan hücreler arasındaki ayrıma izin verecektir. İşlenmiş hücreleri içeren üçüncü örneği çalıştırın. Parlak etiketli yaşlanan hücreler, önceki adımda belirlenen eşiğin üzerinde görünür.

Gerekirse, parlak olayların sayısını toplam olay sayısına bölerek yaşlanan hücrelerin yüzdesini değerlendirin. Beta galakto tazın aktivitesi, bir kemoterapötik prosedür tarafından indüklenen yaşlanmayı değerlendirmek için ortalama floresan yoğunluğu kullanılarak da tahmin edilebilir. Ticari olarak temin edilebilen multipl miyelom hücre hattı R RRP I 8 2 2 6, iki gün boyunca doksorubisin ile tedavi edildi, kemoterapötik bir ilaç ve yaşlanma testi Bu videoda anlatıldığı gibi, bu histogramlar solda tedavi edilmemiş hücrelerin floresansını ve sağda tedavi edilen hücrelerin floresansını göstermektedir.

Yaşlanan hücreleri temsil eden parlak etiketli hücrelerden oluşan bir popülasyon, paralel V.In bölgede ortaya çıkar, aynı hücre örneği beta galakto sase testi kullanılarak boyanmıştır. Bu temsili resimde, tamamen mavi hücreler ve kısmen mavi hücrelerin, gerçekten mavi yaşlanan hücreleri ayırt etmenin zorluğunu gösterdiği gösterilmiştir. Yaşlanan hücrelerin yüzdesinin belirlenmesinde C 12 FDG'nin özgüllüğünü göstermek için, hücreler ayrıca çeşitli konsantrasyonlarda doksorubisin ile muamele edildi.

Yaşlanan hücrelerin yüzdesi, parlak olayların sayısına bölünerek belirlendi. Toplam olay sayısına göre, yaşlanan hücrelerin yüzdeleri 5, 25 ve 50 nanomolar doksorubisin dozu için sırasıyla %0.8, %15.78 ve %26.31 idi. Bu, C 12 FTG etiketlemesinin yaşlanan hücrelere özgü olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, yaşlanan hücreleri karakterize etmek için immünoetiketleme gibi yöntemlerin gerçekleştirilmesi prosedürünü takiben bu prosedürü takiben akış sitometrisi ile yaşlanan hücrelerin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. DMSO veya kanser hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken her zaman önlem alınmalıdır.