Name: İncelenmesi Drosophila Larva Trakeal Terminal Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, Drosophila larvalarında trakeal terminal hücrelerinin morfolojisini görüntülemek için hızlı ısı fiksasyonu yöntemini. Bu teknik, genetik analiz ve hücre gelişimi çalışmaları için yüksek verimli tarama olanağı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz el yazması yapılan yorumlar için Gillian Stanfield teşekkür ederim. TAJ NIH NIGMS Utah Genetik Eğitim Grant T32-GM007464 Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

1. Mozaik Üretimi <ol><li> Genetik Çapraz w FRT 19A küvet: Gal80 FLP 122 / Y, Pak-GAL4, UAS-GFP (erkek) X * incelenecek mutant temsil * FRT 19A / Bal (kadın),. Not: Bu hayvanların uygun arkadaşı için izin verdiği, önce deneme için en az bir gün çapraz kurun. </li><li> Ön yatıyordu: Transferi çapraz Ortama yerleştirilen yaş maya hamur küçük bir smear ile uçmak-gıda şişeleri için. 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca girebilmesine izin verir </li><li> Lay: öncesi yatıyordu şişe Transfer hayvanların yaş maya hamur küçük bir smear ile yeni bir flakon. 25 ° C&#39;de 6 saat boyunca girebilmesine izin verir </li><li> Transferi yetişkin geri depolama ve sonraki deneylerde kullanılmak üzere şişe önceden bırakmaya. Hemen ısı şok bir dolaşan su banyosunda 38 ° C&#39;de 45 dakika, için 0-6 saat eski embriyoları içeren yatıyordu flakon. Not: gıda yüzeyinin tamamını doğrulamak için, su seviyesinin altında olmalıdırEmbriyolar uygun ısı şokuna. </li><li> Üçüncü dönem larva dolaşmaya başlayıncaya kadar 4-5 gün boyunca 25 ° C&#39;de ısı şok şişeleri inkübe edin. </li></ol> 2. Mozaik Hayvanlar için ekran <ol><li> Ince forseps kullanarak yavaşça flakon taraftan dolaşıp üçüncü evre larvaları almak ve küçük bir plastik plaka soğutulmuş% 100 gliserol içine yerleştirin. </li><li> Floresan optik ile donatılmış yüksek büyütme-diseksiyon mikroskobu kullanılarak larva inceleyin. Floresan etiketli trakeal hücrelerinin mozaik ifade ile larva tanımlayın. Tipik haliyle, bu 10-20X büyütme ile yapılabilir. </li></ol> 3. Isı Fixation <ol><li> Ince forseps kullanarak dikkatli bir 75x25x1 mm beyaz cam mikroskop lamı üzerine taze% 100 gliserol bir damla çanak ve yer mozaik hayvanlar ortaya çıkarmak. Not: birden fazla hayvan damla (Şekil 1A) yerleştirilebilir. Hayvanlar ayrıca, doğrudan doğruya, bir lamel üzerine gliserol bir damla yerleştirilebilirhayvanların çok hızlı bir şekilde ısı ve aşırı sabit olabilir gibi ama bakım, sabitleme (adım 3.2) sırasında alınmalıdır. </li><li> Hayvanlar kadar 70 ° C ısı bloğu üzerine yerleştirin cam slayt sadece bir kapak kayma (Şekil 1B) için bir slayt, ve 10 saniye, en fazla 20 saniye hareket durdurmak. Hayvanlar ilk sıyrılmak olacak ama durdurmak ve sert ve uzun bir kez ölü olmak. Not: ısıya gereğinden fazla maruz kalma hem de GFP sinyal loş ve yaygın yapmak gibi terminali şube ve lümen zarar verir. Optimum verimlilik için bu mikroskoplar aynı odada ısı bloğu olması tavsiye edilir. </li><li> Ince forseps kullanarak dikkatli bir şekilde yönlendirmek slayt tüm larvaları birbirine (Şekil 1C) paralel bulunmaktadır böyle tek yönde açılan tüm larvaları,. </li><li> Yavaşça larva üst (veya bir cam slayt üzerine lamel ters) bir 18x18mm mikro cam kapak yerleştirin ve şekillendirme kabarcıklar (Şekil 1D) kaçının. Not: lamel tam olarak yalan değillarvaları üzerinde olabildiğince düz, bu bir sorun değildir. </li><li> 30 dakika içinde görüntü larvaları. Isı sabit terminal hücreleri düşer ve GFP sinyal çok yaygın olacak. </li></ol> 4. Trakeal Terminal Hücre In vivo Görüntüleme <ol><li> Bir bileşik stereomikroskopta sahnede slayt yerleştirin. 5X amacı hayvanın sırt yüzeyi (Şekil 1F) üzerinde posterior anterior çalışan iki paralel dorsal gövdeleri bulun kullanma. Doğrudan iki dorsal gövdeleri arasındaki iki dorsal terminali hücreleri, bulun. Bu analiz için uygun segmentinde belirlemenize yardımcı olur. </li><li> Bir kez odaklı, görüntü istenen terminali hücrelere hayvanlar döndürün. Bunu yapmak için, dikkatle forseps yavaşça lamel altında larvaları (Şekil 1E ve 1G) haddeleme, larvaların uzun eksenine dik olan kenarında lamel itin. </li><li> Uygun Terminal hücrelerin seçilmesi tutarlı sonuçlar için önemlidirve mutantlar arasında karşılaştırmalar. Vücut yağ dalı (FB) terminali hücreleri kolayca orta hatta lateral dorsal gövde, bitişik bulunmaktadır. Yanal Grup G terminali hücreleri (LG) kolayca bulunabilir ve ventral orta hat (Şekil 1 H) sadece yanal yer almaktadır. Not: En ön (Tr1) ve posterior (TR10) segmentlerinde terminali hücrenin düzenleme diğer kesimlerinden farklı. Biz sadece segmentleri Tr2-TR9 terminal hücreleri analiz. Sırt terminali hücreleri diğer trakea terminali hücreleri daha kalıplaşmış dallanma desen var. Bu ek, olmayan hücre özerk sinyalleri bağlı olabilir ve analiz dahil etmek karar verirken bu düşünülmelidir. </li><li> Ilgi bir terminal hücre tespit edildikten sonra, istenen büyütme kullanarak bir görüntü yakalamak, genellikle 10X veya 20X (Şekil 2A) en iyisidir. Not: Değişken dallanma desen nedeniyle, birçok şube ve mümkün olduğu kadar şube ipuçları içermektedir görüntü yakalamak için deneyin. </li><li> Sahne hareket ettirmeden, floresan kapatın ve aynı hücre ve odak düzlemi (Şekil 2B) bir aydınlık görüntü yakalamak için iletilen ışık açın. Lümen koyu terminal hücre alanı içinde zıt olarak görünür olacaktır. Terminal hücre şube ve lümen ölçmek planlıyor ise, her bir terminal hücrenin birden fazla odak düzlemleri birden fazla resim toplamak. </li></ol> 5. ImageJ kullanarak Terminal Hücre morfolojisi analizi ve miktar tayini <ol><li> ImageJ (kullanarak floresan ve aydınlık görüntüleri açın <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) NeuronJ plug-in ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> &quot;Ekle iz&quot; aracını kullanarak el ile tüm terminali hücrenin şube ve lümen iz. </li><li> &quot;Etiket iz&quot; aracını kullanarak, yeniden adlandırma ve riz belirli bir atama içinde her satırı atamak ecolor. </li><li> &quot;İlgili parametreler&quot; seçeneğini kullanarak, 6-10 piksel Çizgi genişliğini ayarlamak (bileşik mikroskop bağlı dijital kameradan elde edilen 512x512 görüntüler için. Yüksek veya daha düşük çözünürlüklü kameralar için, piksel genişliği uygun ölçeklenebilir olmalıdır), tüm kullanarak diğer varsayılan ayarları, ve &quot;Tamam&quot; seçin. Sonra bir görüntü çekmek için &quot;anlık olun&quot; aracını kullanın. Seçin, orijinal ile yan yana gösterilebilir iz bir anlık almak için &quot;iz çizin&quot;. </li><li> &quot;Ölçü iz&quot; aracını seçin ve izleme tipi (ölçmek için şube adım 5.3 &#39;de atanan belirli belirtme dayalı yani) seçin. Sonra, &quot;RUN&quot; tıklayın ardından &quot;izleme ölçümleri göster&quot; ve &quot;Clear önceki ölçümleri&quot;. Bu ad, etiket, uzunluğu (piksel) ve görüntü için diğer verileri içeren bir tablo üretecek. Bu veriler daha sonra daha ileri istatistiksel bir Microsoft Excel elektronik tablosu olarak kaydedilebiliranalizi. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
<li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li>
<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi olduğunu beyan ederim.

Burada açıklanan ısı sabitleme tekniği görüntüleme Drosophila larva trakeal terminali hücreleri için hızlı ve kullanışlı bir araçtır. Burada, dallanma ve yabani tip hücrelerin lümen desen incelemek için bu tekniği kullanın. Nefes nefese trakeal özel organizatörü tarafından tahrik GFP, ifade Trakeal hücreleri ısı sabitleme sonra larva manikür ile kolayca görüntülenebilir. Hem de hava dolu lümeninin gibi tek tek terminal hücreler, belirli bir desen dallanma hızlı bir şekilde görüntülenmiştir ve bu yöntem...

Hücre şekil bir organizma içinde, tek tek hücrelerin fonksiyonu için kritik yanı sıra hücreler, bir doku ya da organın bir parçası olarak işlev gördüğü. Dallanma ve tüp oluşumu (lumenogenesis): Biz hücresel morfoloji iki korunmuş tür kontrol katılmak moleküler mekanizmalarının araştırılması Drosophila trakeal terminali hücreleri, böcek solunum sisteminin bir bileşeni kullanın. Terminal hücreleri dallı tüpler bir ağın ucunda yer aldığını iç doku 1 oksijen teslim ve hedef dokularda 2 içinde yerel oksijen seviyesi ile kontrol edilir bir FGF sinyal yolu bağlıdır ayrıntılı bir dallı morfolojisi için çalışır. Terminal hücre dalları her şube ile çalışan gaz ile dolu bir hücre içi lümen ile, ince tüpler vardır. Genetik analiz Drosophila yapılabilir hangi kolaylığı ile birlikte terminali hücrelerin farklı hücresel mimarileri, bu hücreler, mükemmel bir model F yapmakya da, hücresel akıbet mekanizmaları araştıran dallanma, ve hücre içi tüp oluşumu. Terminal hücreleri dallı hücre farklılaşması, akıbet ve olgunlaşma 2-4 giden sinyal yollarının bazıları anlamak için yararlı bir model kanıtlamıştır. Bu sistem tarafsız kullanarak, hücre morfolojilerinden mutantlar için ileri genetik ekranlar hücre şekli 5,6 kontrol mekanizmaları içine anlayışlar verimli, yapılmıştır. Integrin-aracılı yapışma şube istikrar 8 için gerekli olduğunu,, örneğin, bu ekranlar belirli bir RabGAP lümen oluşumu ve konumlandırma 7 iskelet kutup ve vezikül ticareti için gerekli olduğunu ortaya koymuştur ve bu epitel PAR-kutup proteinler gerekli polarize membran ticareti düzenleyen dallanma ve lümen oluşumu 9 her ikisi için de. Terminal hücrelerinde Diğer çalışmalar, asimetrik aktin birikimi ve mikrotübül organizasyonu hücre uzaması ve lumenogenesis için gerekli olduğunu göstermiştir <s&gt; 10 kadar. Böylece, farklı, korunmuş hücre biyolojik mekanizmaları terminali hücre morfolojilerinden katkıda bulunur. Burada, biz hızla terminali hücre dallanma ve lümen oluşumu analizi için sağlam üçüncü evre Drosophila larvaları düzeltmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda birinci ve ikinci instar hayvanlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin anahtarı genetik doğrudan sağlam hayvanların larva manikür floresan proteini ifade tarafından etiketli terminali hücreleri görselleştirmek için yeteneğidir. Bu işlem bu antikor boyama gibi sonrası tespit manipülasyonlar,, hücreleri gözlemlemek için gerekli olmadığından, iyi genetik ya da ilaç tarama dahil olmak üzere, yüksek verimlilik analizi için uygundur. Floresan proteini ifade sitoplazma dolu dalların yapı ortaya koymaktadır. Tüp oluşumu paralel çevreleyen sıvı-dolgu ile tezat gazlı lümen, tanımlamak için aydınlık mikroskobu kullanarak izlenebilired dokular. Bu protokole dahil başka etiketlenmemiş hayvanlar floresan ile etiketlenmiş proteinleri homozigoz mutant terminali hücreleri üretmek için MARCM sistemi 11 esas genetik mozaik üretmek için bir yöntemdir. Terminal hücreler sadece nispeten geç gelişiminde onların kompleks yapıların ayrıntılı çünkü bu, gereklidir; genetik mozaikler önceki gelişiminde diğer dokularda gen gereksinimleri bypass için izin verir. . MARCM klon oluşturmak için, trakea burada tanımlanan nefes nefese trakeal-özel bir sürücü (btl) 12 kullanılarak etiketli Drosophila X kromozomu için protokoldür, diğer kromozomlar için, benzer bir prosedür olan kromozom uygun genetik reaktifler ile, kullanılabilir incelenmiştir. Burada, trakea bir sitoplazma lokalize GFP ifade etiketli, ancak prosedür gibi DsRed gibi diğer floresan proteinleri, ifade eşit derecede iyi çalışır. Ayrıca, nöronal şube modelleri 13 tanımlamak için geliştirilen yöntemlere dayalı, Terminal hücrelerde dallanma desen ve lümen oluşumu ölçmek için bir yöntem dahil ettik. Nicel verilerin bu tür seçici kesin dallanma veya lumenogenesis sürecinde genlerin rolü, hem de farklı mutantlar 9 arasında doğrudan karşılaştırmalar için izin kritik olabilir.

<table><tbody><tr><td>Öğrenci Dumont #5 forseps</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 Diseksiyon mikroskobu (veya eşdeğeri)</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 bileşik mikroskop (veya eşdeğeri)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>AxioCam MRm ile donatılmıştır, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filtre Seti 38HE</td></tr><tr><td>%100 Gliserol</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>Sinek stok</td><td></td><td></td><td>Genotipi: w FRT19A küvet: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP ve FRT19A</td></tr><tr><td>Sinek stoğu</td><td></td><td></td><td>Genotip: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

İncelenmesi<em&gt; drosophila</emişık mikroskopi tarafından&gt; larva trakeal terminal hücreleri

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Hücre şekli hücre fonksiyonu için önemlidir. Ancak, hücre morfolojisi önemi rağmen, biraz tek tek hücrelerin belirli şekiller oluşturmak konusunda bilinmektedir. Drosophila trakea terminali hücreleri hücresel morfoloji üretmek için gerekli genlerin rolleri belirlemek ve aydınlatmak için güçlü bir genetik model haline gelmiştir. Terminal hücreleri, kollara ayrılmış boru şebekesinin bir parçası, iç dokulara oksijen sağlamak için işlevler, trakeal sistemi vardır. Terminal hücreler iki ayrı cep mimarileri sahip olarak hücre şekli soruları araştırmak için mükemmel bir model vardır. İlk olarak, Terminal hücreleri karmaşık nöron benzer ayrıntılı bir dallı morfolojisi, var, ikinci terminal hücre dalları ince tüpler olarak oluşan ve bir membrana bağlı hücre içi lümen içerirler. Terminal hücre şube sayısı, şube kuruluş ve bireysel şube şekli, kantitatif analiz belirli genetik mekanizma rolü hakkında bilgi vermek için kullanılabilirDallı bir hücrenin yapımında anisms. Bu hücrelerde tüp oluşumu analizi gibi omurgalı damar gibi diğer boru ağlara ortak tubulogenesis bir korunmuş mekanizmaları, ortaya çıkarabilir. Burada hızlı bir şekilde, görüntü düzeltmek için kullanılabilecek teknikler tarif ve Drosophila larvaları içinde hem dallanma desen ve terminal hücrelerde tüp oluşumu analiz. Bu teknikler, yabani tip ve mutant hayvanlar ya da genetik mozaik terminal hücreleri analiz etmek için kullanılabilir. Bu nedenle protokolün yüksek verimlilik, aynı zamanda iyi genetik, RNAi tabanlı veya Drosophila trakeal sisteminde ilaç ekranlar için uygundur.

Sonuçlar Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Ve şube her geçen gaz ile dolu bir hücre içi lümen (aydınlık mikroskobu ile görüntülendi, B); Tek bir yan grubu (LG) Terminal hücre geniş hücre içi dallanma (A GFP ile görünür) gösterir. Bu görüntüler, bölüm 1 ve 2&#39;de tarif edilen MARCM sistemi kullanılarak oluşturulan bir mozaik L3 larva toplandı ve ısı sabit ve görüntülü olarak bölüm 3 ve 4 &#39;te tarif edilmiştir. Paneller C &amp; D A &amp; B Paneller gösterilen görüntülerin sırasıyla şube olarak bölüm 5&#...

Burada, trakea terminali hücrelerinin ışık mikroskobu analizinde için bir yöntem mevcut<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva. Bu yöntem, bütün hayvanlarda şube ve lümen morfolojisi hızlı incelenmesi için izin verir ve bireysel mutantlar veya terminal hücre gelişimi etkileyen mutasyonlar için ekranlar analizi için yararlı olacaktır.

İncelenmesi<em&gt; Drosophila</emIşık Mikroskopi tarafından&gt; Larva Trakeal Terminal Hücreleri

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Bu prosedürün genel amacı, trake terminal hücrelerindeki dallanmaların ve tüplerin morfolojisini görüntülemek için sağlam drosophila larvalarını hızla tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle genetik olarak mozaik hayvanlarda homozigot floresan protein işaretli terminal hücreler oluşturularak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise mozaik larvaların toplanması ve ısı kullanarak tespit edilmesidir.Üçüncü adım, dalları gözlemlemek için GFP ekspresyonu ve tüpleri gözlemlemek için parlak alan mikroskobisi kullanarak, fikse edilmiş hayvanlardaki işaretli uç hücrelerin görüntülenmesidir. Son adım, uç hücre morfolojilerinin nicelleştirilmesidir. Sonuç olarak, elde edilen veriler vahşi tip ve mutant uç hücrelerin farklı hücresel morfolojilerini ayırt etmek ve kategorize etmek için kullanılabilir.Bu tekniğin kimyasal tespit gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, son derece hızlı olmasıdır; bu sayede trakeal terminal hücrelerin yüksek kapasiteli analizi için kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, L3 larvalarını seçmek ve morfolojilerini korumak için onları hızla tespit etmek dikkat ve özen gerektirdiğinden zorluk yaşayabilirler. Mozaik sinekler yapmak için.İncelenecek mutasyonu taşıyan dişilerle Mark M tekniğini uygulayın. Çaprazlamaları, taze maya ezmesi sürülmüş ön yumurtlama şişelerinde kurun ve sineklerin 25 °C'de bir saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin. Ardından, sinekleri ön yumurtlama şişesinden taze maya ezmesi içeren yeni bir şişeye aktarın ve 25 °C'de altı saat boyunca yumurta bırakmalarını sağlayın.Altı saat sonra, erişkinleri saklama ve sonraki deneylerde hemen kullanmak üzere ön yumurtlama tüplerine geri aktarın. Toplanan yumurtlama tüplerini, tüm embriyoların uygun şekilde ısı şokuna uğramasını sağlamak için besiyeri yüzeyi su seviyesinin altında kalacak şekilde, sirkülasyonlu bir su banyosunda 38 °C'de 45 dakika boyunca ısı şokuna tabi tutun. Ardından, ısı şokuna uğratılmış tüpleri, üçüncü evre larva oluşana kadar 25 °C'de dört ila beş gün inkübe edin.Hassas pensler kullanarak ayıklamaya başlayın. Gezen üçüncü dönem larvaları tüpün kenarlarından nazikçe alın ve küçük bir plastik plakadaki soğutulmuş %100 gliserole yerleştirin. Larvaları, floresan optik donanımlı yüksek büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu ile 10x veya 20x büyütmede inceleyin.Floresanla işaretlenmiş trake hücrelerinin mozaik ekspresyonuna sahip larvaları belirleyin. Ardından ince uçlu pens kullanarak bu hayvanları dikkatlice seçin ve beyaz bir cam mikroskop lam üzerindeki taze %100 gliserol damlasının içine yerleştirin. Mikroskopla aynı odada bulunmak kaydıyla, damlanın içine birden fazla hayvan yerleştirilebilir.Hayvanlar hareket etmeyi bırakana kadar, yaklaşık 20 saniye içerisinde, lamı 70 °C'lik bir ısıtıcı bloğa yerleştirin. Başlangıçta hayvanlar kıvranır, ancak daha sonra sertleşir ve uzarlar. Öldükten sonra uzun süre maruz bırakmak, lümenlerin yanı sıra terminal dalların da ısıya bağlı hasar görmesine yol açar.GFP sinyali sönükleşir ve yayılır. Isı ile sabitleme zamanlaması kritiktir çünkü aşırı sabitleme hücrelere zarar vererek yanıltıcı veya zor analizlere yol açabilir. Bu nedenle numuneler ısı bloğuna yerleştirilmeli ve sadece hareketleri durana kadar sabitlenmeli, ancak bu süre aşılmamalıdır.Şimdi ince uçlu pens kullanarak, fiksasyon yapılmış tüm larvaları dikkatlice birbirine paralel olacak şekilde yönlendirin. Ardından, larvaların üzerine bir mikro lamellek yerleştirin ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Lamellek tamamen düz durmayabilir, ancak bu bir sorun teşkil etmez.Larvaları sonraki 30 dakika içerisinde görüntüleyin. Isı ile tespit edilen terminal hücreler hızla degrade olur ve GFP sinyalleri oldukça yaygınlaşır. Ardından, lamı bir bileşik stereo mikroskobun tablasına yerleştirin.Beş x objektif kullanarak, hayvanın dorsal yüzeyinde anteriordan posteriora doğru uzanan iki paralel dorsal gövdeyi bulun. Ardından, bu iki dorsal gövdenin tam arasında yer alan iki dorsal terminal hücreyi belirleyin. Bu işlem, analiz için uygun segmentin tanımlanmasına yardımcı olur.Yönlendirme işlemi tamamlandıktan sonra, lamelin kenarını pensle dikkatlice iterek hayvanları döndürün ve görüntülemek istediğiniz terminal hücreleri hizalayın. Bu işlemin hayvanın uzun eksenine dik olarak yapılması, larvaların yavaşça yuvarlanmasını sağlar. Tutarlı sonuçlar elde etmek ve mutantlar arasında karşılaştırmalar yapabilmek için uygun terminal hücrelerin seçilmesi kritik öneme sahiptir.Yağ cismi dal uç hücreleri, dorsal gövdenin bitişiğinde, orta hattın lateralinde kolayca bulunur. Lateral grup G uç hücreleri kolayca bulunur ve en anterior ve posterior segmentlerde ventral orta hattın hemen lateralinde yer alır. Uç hücrenin düzeni diğer segmentlerden farklıdır.Bu segmentler incelenmemeli; bunun yerine hücrelere ve segmentlere odaklanılmalıdır. TR iki ile dokuz arasındaki dorsal terminal hücreler, diğer trakeal terminal hücrelere göre daha stereotipik bir dallanma paternine sahiptir. Bu durum, ek hücre dışı (non-cell autonomous) sinyallere bağlı olabilir ve analizlere dahil edilip edilmeyeceklerine karar verilirken bu husus göz önünde bulundurulmalıdır.İlgilenilen bir uç hücre belirlendikten sonra, değişken dallanma modelleri nedeniyle 10x veya 20x büyütme kullanarak bir görüntü yakalayın. Sahneyi hareket ettirmeden, mümkün olduğunca çok dalı ve dal ucunu içeren görüntüler yakalamaya çalışın. Floresansı kapatın ve iletim ışığını açın.Aynı hücrenin ve odak düzleminin brightfield görüntüsünü yakalamak için, lümen terminal hücre alanı içerisinde koyu bir kontrast oluşturacaktır. Terminal hücre dallarını ve lümenleri nicelleştirmek için, her bir terminal hücrenin birden fazla odak düzleminde çok sayıda görüntüsü toplanır. Bazı hücreler yeterli veriyi toplamak için tek bir görüntü gerektirirken, diğerleri farklı odak düzlemlerinde üç ayrı görüntüye kadar gereksinim duyabilir.Tüm dalları yakalamak için, neuron J eklentisi yüklü olan ImageJ programında floresan uç parlak alan görüntülerini açın. "add tracings" aracını kullanarak, tüm terminal hücrenin dallarını ve lümenini manuel olarak çizin; ardından "label tracings" aracını kullanarak 5x12 piksel boyutundaki görüntüler için çizim içindeki her bir hatta belirli bir tanımlama atamak amacıyla bunları yeniden adlandırın ve yeniden renklendirin. Çizgi genişliğini 6'dan 10 piksele ayarlamak için "set parameters" aracını kullanın.Daha yüksek veya daha düşük çözünürlüklü görüntüleri buna göre ölçeklendirin. Diğer ayarları varsayılan değerlerinde bırakın ve tamam'a basın. Ardından anlık görüntü oluşturma aracını kullanın.Görüntü almak için, orijinal görüntüyle yan yana gösterilebilen izlerin bir anlık görüntüsünü elde etmek üzere 'iz çiz' (draw Trace) seçeneğini belirleyin. İz ölçüm aracını seçin ve ilgili izi belirleyin. Belirli tanımlamalara dayanarak ölçülecek dalları girin.Ardından, izleme ölçümlerini görüntüle seçeneğini seçin. Daha sonra önceki ölçümleri temizleyin ve çalıştır düğmesine tıklayın. Bu işlem; istatistiksel analiz için kaydedilecek olan görüntünün adını, etiketini, piksel cinsinden uzunluğunu ve diğer verileri içeren bir hesap tablosu oluşturacaktır.GFP ile görüntülenen Mozaik L3 larva örneklerindeki mutasyona uğramış trake hücrelerini analiz etmek için belirtilen protokol takip edilmiştir. LG olarak etiketlenen tek lateral grup terminal hücresi, parlak alan mikroskobunda geniş sübhücresel dallanmalar göstermektedir; Neuron J kullanılarak her bir dal boyunca uzanan, gazla dolu sübhücresel bir lümen belirgin şekilde görülmektedir. Dalların ve lümenin izleri çıkarılmıştır. Mozaik olmayan bu hayvanda, yağ vücudu terminal hücresi FB tanımlanmıştır.GFP'nin tüm trakeal sistem boyunca eksprese edildiğine dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, gelişimini tamamlamış sağlam hayvanlardaki trakeal terminal hücrelerin görüntülerini nasıl hızlıca sabitleyeceğiniz ve nicel analiz gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, araştırmacıların hücre morfojenezinin yönlerini anlamak için trakeal terminal hücrelerini kritik bir model olarak kullanmalarına yol açmıştır.

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz fiksasyon, gömme, kesit, bir süreç tarif etmek, ve geç dönem...

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Nöron dendritler gibi karmaşık hücre şekilleri, geliştirme sırasında nasıl elde edilir anlamak için, bu, doğru tahlil mikrotübül organizasyonu edebilmek için önemlidir. Burada dendritik arborization duyusal nöron dendritler mikrotübül organizasyonu, trakea, kas incelemek için sağlam bir immünohistolojik bir etiketleme yöntemi açıklamak ve...

Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Bu video, sinek larvasındaki hematopoezin birincil bölgesi olan Drosophila lenf bezini tanımlar ve immünohistokimya ve floresan görüntüleme için organı incelemek ve monte etmek için örnek bir protokol gösterir.

Larva Lenf Bezi Diseksiyonu: Drosophila Hemosit Üreten Organın İzole Edilmesi

Bu video, ekdisteroidlerin ve diğer hormonların biyosentezi ve salgılanması için önemli olan karmaşık bir endokrin yapı olan Drosophila halka bezini tanımlar. Özellikli protokol diseksiyonunu, fiksasyonunu ve immün boyamayı gösterir.

Larva Halka Bezi Diseksiyonu: Gelişimsel Endokrin Organların Drosophila'dan İzolasyonu

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Öğrenin, Drosophila larvalarında trakeal terminal hücrelerinin morfolojisini görüntülemek için hızlı ısı fiksasyonu yöntemini. Bu teknik, genetik analiz ve hücre gelişimi çalışmaları için yüksek verimli tarama olanağı sağlar.

İncelenmesi

Daha fazla video keşfet