Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon

Bu protokolde, uygun genotipe sahip larvaların tüm trans A TR içeren E bazlı besinle beslenmesiyle başlıyoruz. Her larva, normal salin içerisinde sabitlenir ve diseke edilir; ardından normal salin, iki milimolar kalsiyum içeren ringer çözeltisi ile değiştirilir ve LABA preparatı mikroskop tablasına yerleştirilir. Diseke edilmiş LABA'nın hareketi bir CCD kamera ile videoya kaydedilir. Sinir sistemini bölgesel olarak aydınlatarak, aynı intakt preparatın hareketini izlerken belirli bir zamanlamada bir grup nöronun nöral aktivitesini bozabiliriz.

Merhaba, ben Dr. A'nın laboratuvarından Tega. Merhaba, ben de Dr. A'nın laboratuvarından, Oftalmoloji düzeyinden Kosaka.

Lokomosyon, motor devreleri incelemek için kullanışlı bir model sistemdir. Bu protokoldeki gelişmiş genetik teknikler sayesinde, hareket seviyesini izlerken motor nöronların optogenetik manipülasyonunu gerçekleştireceğiz. Konfokal mikroskoptaki lazerler kullanılarak, nöronların bir alt kümesi uyarılabilir ve nöronların uzay-zamansal perturbasyonuna verilen motor yanıtlar analiz edilebilir.

Hadi başlayalım. Standart canlı yem içeren plastik biyoslarda K six G four US CHR two veya K six G four US NPHR sinek hatlarını sürdürün. Uygun konsantrasyonlarda maya bazlı bir TL çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Maya bazlı karışımı bir elma suyu agarı üzerine yayın.

Viyallerden SLA içindeki ikinci veya üçüncü koloniyi alın. Koloniyi, TR içeren maya besiyerli bir plakaya ekleyin. TR'yi karanlıkta tutmak için plağı alüminyum folyo ile örtün. Koloniyi 25 °C'de uygun bir süre boyunca büyütün.

Bu, aynı bozulmamış laboratuvarın görselleştirilmesi için kullanılan bir CCD kameradır. CCD kamerayı bir SEMA ayırıcı ile geleneksel bir konfokal mikroskoba takın. A TRA lobisini alın ve suyla durulayın.

Vücuttaki kalıntı gıdaları temizlemek için, larvayı sırt kısmı yukarı bakacak şekilde C korumalı soğuk tabağa yerleştirin. Baş ve kuyruk kısımlarını entomolojik iğnelerle sabitleyin. Kalsiyumsuz normal salin ekleyin.

Mikro makas kullanarak kuyruğun yakınından küçük bir insizyon yapın. Dorsal orta hat boyunca boyuna bir kesi yapın. Ventral sinir kordonuna ve periferik sinirlere zarar vermemeye dikkat edin.

Disekte edilmiş vücut duvarının her köşesinden baş iğnesini kullanarak küçük bir lateral insizyon yapın. Beyin ve ventral sinir kordonu dışındaki iç organları çıkarın. Normal salini 2 milyon model kalsiyum ringer çözeltisi ile değiştirin.

Konfokal mikroskoba yüksek büyütmeli kuru objektif lens takın ve laboratuvar örneğini mikroskop tablasına yerleştirin. Konfokal mikroskop ile ventral sinir kordonunu bulmak için diseke edilmiş örneğin kırmızı lazerle bir transmisyon görüntüsünü elde edin. Transmisyon görüntüsü üzerinde ilgilenilen bölgeyi belirleyin; spesifik ilgi bölgesini belirlemek için yakınlaştırma kalıbı kullanışlıdır.

Mikroskobun filtre setini 488 nanometre veya 559 nanometre ışıkla aydınlatacak şekilde değiştirin. Halojen lamba ile preparatı aydınlatarak gövde duvarını görüntüleyin. Preparatı konfokal mikroskoba bağlı bir CCD kamera ile izleyin.

Vücut duvarının hareketini hatırlayın ve aynı sağlam preparasyonda peristaltik hareket izlenirken, nöral aktiviteleri geçici olarak manipüle etmek için lazer ışınını yalnızca tümünü değiştirmek üzere kullanın; hareket CCD kamera ile gözlemlenir ve kaydedilir. Bu laboratuvar, modern nöronlarda CHL iki'yi ifade eder. Ventral sinir kordonunun bir veya iki segmentini aydınlatmak, söz konusu segmentlerdeki modern nöronları aktive eder; bu da karşılık gelen vücut duvarı segmentlerinde kas kasılmasını tetikleyerek ventral sinirdeki diğer segmentleri uyarır.

Soğuk, vücudun diğer segmentlerinin kasılmasını tetikler. Ventral sinir kordonunun birkaç segmenti sarı lazerle uyarıldığında motor nöronlarda NPHL eksprese edilmiştir. İletim dalgası, vücut duvarının ilgili segmentinde durdurulmuştur.

Lazer eliminasyonu kapatıldığında dalga, duraklatılan segmentten yeniden başladı. Bu protokol, hareket halindeki aynı inakt dairesel seviyede lazerlerle nöral aktivitenin optogenetik perturbasyonunun gerçekleştirilme prosedürünü açıklamaktadır. Yeterli stimülasyon sağlamak için bu diseksiyon sırasında ventral sinir kodu ve periferik sinir zarar görmemelidir.

Konfokal mikroskoptaki aydınlatma gücü, lazer gücü, tarama hızı veya tekrarlama sayısı değiştirilerek ayarlanmalıdır. Protokolün tamamı bundan ibarettir. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.