Ovo CAM-testi

Bu prosedürün genel amacı, sarkom, hücre veya greft davranışını incelemek için bir civciv koal toik membranı veya CAM testi yapmaktır. Bu, ilk olarak kuluçka üçüncü gününde bir yumurtanın kabuğunda bir pencere açılarak gerçekleştirilir. Dokuzuncu kuluçka gününün ikinci adımında tümör materyali hazırlanır.

Daha sonra epitel tabakası çıkarıldıktan sonra, tümör kam'a eklenir Kuluçka gününün 16. gününün son adımında, TAT fotoğraflanır, hasat edilir ve histolojik değerlendirme için formalin içinde sabitlenir. Sonuç olarak, klasik h ve d histolojisi ve immünohistokimya sarkom, hücre proliferasyonu ve invazyon vaskülarizasyonu ve konak reaksiyonlarını göstermek için kullanılır. Bu tekniğin çoğu modelde olduğu gibi mevcut ksenogreft yöntemlerinin en büyük avantajı, öğrenilmesinin basit ve nispeten ucuz olmasıdır.

Ayrıca, çok kısa bir süre içinde metastaz ile ilişkili sayısız aktiviteyi incelemenize olanak tanır ve etik bir kurul gerektirmez. Bu yöntem, tümör konak etkileşimlerinin tümör sağkalımı üzerindeki etkisi, tümör mikroçevresinin yeniden yapılandırılması ve stroma hücrelerinin işe alınması gibi sarkom araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, hastanın kendi materyali incelenebildiği için sarkom için kişiselleştirilmiş tedaviye kadar uzanır.

Bütün bu yeni teknik bize SAR nörojenezi hakkında yeni bilgiler sağlayabilir. Genel olarak onkogenez gibi diğer sistemler için de çok geçerlidir. Tümör örneğini bir milimetreküpten daha büyük olmayan küçük parçalar halinde kesmek için steril bir neşter kullanarak başlayın ve tüm kalsifiye alanları çıkarın.

Daha sonra numuneyi tartın ve dokunun iki ila dört gramını ayrışan bir tüpe aktarın. Dokuyu 2.5 mililitre kollajenaz iki ve 2.5 mililitre DN a solüsyonlarında sindirin. Dokuyu işledikten sonra, ayrışma H tümör protokolüne göre, elde edilen süspansiyonu 150 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün

Şimdi süspansiyonu, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 100 ila 500 kez G gibi uygun bir merkezkaç kuvvetinde santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkardıktan sonra, peleti 10 mililitre eritrosit lizinde inkübe edin, ara sıra tasyon ile oda sıcaklığında tamponlayın. 10 dakika sonra, süspansiyonu tekrar döndürdükten sonra reaksiyonu durdurmak için 25 mililitre kültür ortamı ekleyin, pelet beyaz olmalı, süpernatantı atmalı ve hücrelere beş mililitre ortam eklemeli ve ardından süspansiyonu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün

Gelişimde mililitre başına düşen canlı hücre sayısını belirlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Üçüncü gün, yumurtanın ucuna 18 gauge bir iğne sokun ve OVO chorio all toic membran veya kam seviyesini düşürmek için iki mililitre albümini çıkarın. Şimdi, pencereyi keserken kabuk parçacıklarının kam üzerine dökülmesini önlemek için kabuğun işaretli üst tarafına yarı geçirgen bir yapışkan film uygulayın.

Ardından, yumurtanın yüzeyinde küçük bir delik açarak bir giriş deliği açın. Kabuğun açılması sırasında kamın zarar görmemesi, prosedürün en zor kısmıdır. Keskin makaslar kullanıyoruz, bir elimizde yatay olarak tutarken diğer elimizde yumurtayı tutuyoruz.

Şimdi, kabukta bir santimetre karelik bir pencereyi kesmek için bir çift steril, keskin sivri uçlu cerrahi makas kullanın. Embriyonun nabız atan kalbi ve bitişik damarları artık yumurta sarısının yüzeyinde görünür olmalıdır. Döllenmemiş yumurtaları veya ölü embriyoları çıkarın.

Ardından pencereyi daha yarı geçirgen yapışkan filmle kapatın. Tümör süspansiyonunu tekrar döndürdükten sonra, peleti soğutulmuş hücre dışı matris jel içinde 100 mikrolitre jel başına 10 ila altı hücreye bir kez yeniden süspanse edin. Bu çözeltiyi eriyen buz üzerinde tutun.

Daha sonra, laminer akış altında, yarı geçirgen yapışkan filmin bir kısmını çıkarmak için bir çift steril cerrahi makas kullanın. Steril bir cam çubukla kam'a hafifçe dokunarak epitel hücre tabakasını çıkarın. Daha sonra kam üzerine 4 adet 25 mikrolitrelik hücre ECM jel süspansiyonu damlatın ve ECM jelinin uygulamalar arasında polimerize olmasını sağlayın.

Bu şekilde kanser hücrelerini içeren yapışık bir plak oluşturulur. Ardından kabuk penceresini yarı geçirgen yapışkan film ile tekrar kapatın. Uygun deneysel kuluçka döneminden sonra, kabuk penceresini büyütmek için bir çift cerrahi makas kullanın ve çok düşük kesmemeye dikkat edin.

Daha sonra, aşılanmış materyali içeren CAM bölümüne 300 ila 500 mikrolitre PBS eklemek için bir pipet kullanın. Ardından kamerayı bir stereo floresan mikroskobu ile fotoğraflayın. Daha sonra, kabuğa karşı uzanan kenardaki zarı kesmek için bir çift steril makas kullanın ve hasat edilen kamı PBS veya tamponlu formaldehit ile doldurulmuş steril bir Petri kabına yerleştirin.

Ardından, kameranın hem üst hem de alt taraflarını, görüldüğü gibi filtreli ve filtresiz olarak fotoğraflayın. Bu ilk şekilde, tümör greftleri kam'a yapışık hale gelir. Burada, bu iki görüntüde kurumuş, hafifçe kabarık bir plak gösteren hasta materyalinden tek hücreli bir süspansiyon gözlemlenebilir.

Kamın eksizyonundan sonra meydana gelen zarın belirgin kırışıklığı gösterilir. SAO iki çizgisi, yedinci günden itibaren yüzeyde belirgin bir artışla CAM üzerinde yayılan bir plak oluşturur. Aşılamadan sonra, GFP sinyali güçlü kalır ve canlı hücreleri gösterir.

SW 1 3 53 hücrelerini içeren bu plaklar, yüzeyde bir azalma gösterir ve büzülmüş bir kam olma eğilimindedir, bu da buruşuk bir zar ile sonuçlanır. Yedinci günden itibaren hasattan sonra sıklıkla kanama görülür. Floresan probu birçok hücre bölünmesinden sonra seyreltildikçe ve kanama meydana geldiğinde DSR sinyali azalır.

Çoğu durumda, numuneye yeni kıvrımlı damarlar girerken CAM'ın vasküler reaksiyonu gözlenir. Örneğin, ok uçlarının gösterdiği gibi dallanma ve okların gösterdiği gibi bu noktasal kanamada yıldızlarla gösterildiği gibi anastomoz da plak boyunca gözlenebilir. SAO'ların, kamın damarlarına paralel iki hücrenin göçüne dikkat edin.

Bu vasküler reaksiyon, greft veya plağı çevreleyen kıvrımlı damarları gösteren alt görünümde kamın eksizyonundan sonra görüntülenebilir. CAM'ın vasküler reaksiyonu, tümör greft grubunda ve tek hücreli süspansiyon grubunda gözlenir. Histolojik kanıtlar, SAO'ların iki hücresinin, hücre dışı matris jelinin tüm hacmi boyunca tek bir hücre görünümünü koruduğunu ve plak kalınlığının ve çapının artmasına neden olduğunu göstermektedir.

Tümör hücreleri, burada okla gösterildiği gibi kamın mezodermal tabakasını istila eder, böylece kamın endodermal ve dermal katmanları arasındaki mesafeyi bir açılış fermuarı gibi genişletir. Çift okla gösterildiği gibi, SW 1 3 5 3 hücrelerinin ve bir hastanın bilinçli sarkomunun tek hücreli süspansiyonunun büyüme paterni, hücre dışı matris jelinin genişliğindeki hücre adaları ile daha fazla kümelenir. Okla gösterildiği gibi, ektopik büyüme bölgelerine rağmen, orijinal sarkom tümörlerinin temel özelliklerinin ve immünohistokimyasal özelliklerinin kamda korunduğunu bulduk.

Ek olarak, tümör greftleri, ok uçları ile gösterildiği gibi koyu pembe mavi çekirdekli civciv eritrositlerinin ortaya çıkmasıyla kanıtlandığı gibi revaskülarize hale geldi ve damarlarda bulunan KI 67 pozitif ve KI 67 negatif hücrelerin hücre sayımı, her iki hücre hattı için dördüncü günden itibaren toplam hücre sayısında sabit bir artış olduğunu göstermektedir. Bu günden sonra, toplam hücre sayısı aşılamadan yedi gün sonra sabit kalır, KI 67 pozitif hücre sayısı ve toplam hücre sayısı azalmaya başlar. Kamın yakınında KI 67 pozitif hücrelerin daha büyük bir kısmı gözlenir ve plak yüzeyinde KI 67 negatif hücrelerin daha büyük bir kısmı gözlenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, cam SA tekniği, uygun şekilde gerçekleştirilirse üç güne yayılmış 14 saatlik bir sürede 50 x'i analiz etmek için kullanılabilir. Ek h ve e boyamaları ve değerlendirmesi yapılabilir ve bu prosedürü takiben her 10 koşul için üç saat gerekebilir. Grip etiketli kanser hücrelerinin ekstravazasyonu veya izasyonu gibi ek sorunları ele almak için yaşam tarzı görüntüleme gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir.

Dolayısıyla, bu yeni tekniğin geliştirilmesiyle, klinik öncesi test alanındaki araştırmacıların sarkom hastalarında yeni prognostik ve terapötik faktörleri keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, cmaa'da tümör materyalinin nasıl uygulanacağını ve mikroskobik ve mikroskobik gözlemlerinizi tümör konak etkileşimlerinin daha iyi anlaşılmasına nasıl çevireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.