Name: Ovo CAM-testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Keşfedin tavuk koryoallantoik membran (CAM) testi ile sarkom davranışlarını ve tümör-konak etkileşimlerini inceleme yöntemini. Bu teknik, tümör mikroçevresi ve stroma hücre rekrütmanı üzerine değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW1353 kondrosarkom hücre hattı hücreleri nazikçe Dr PCW Hogendoorn ve Leiden Üniversitesi, Hollanda Dr J. Bovee tarafından sağlandı. Biz protokol genel profesyonel çizim için J. Mestach ve G. Wagemans mükemmel teknik yardım için, ve G. De Bruyne teşekkür ederim.

Genel bir bakış için Şekil 1&#39;e bakınız Tümör malzeme 1. Tümör Örnekleri elde ve hazırlanması Hasta malzeme kullanımı için, Etik Kurul onayı gereklidir ve aydınlatılmış onam hasta elde edilecek vardır. <ol><li> Müdahale sırasında hasat temsilcisi malzeme (en az 1 cm 3), biyopsi veya sarkom bir rezeksiyon ya. Biyopsi uygun sitesi dinamik kontrastlı MR kullanılarak tanımlanır. </li><li> DMEM 1,000 ünite penisilin ve 1 mg / ml streptomisin ile takviye içeren steril bir cam şişe içinde hemen malzeme yerleştirin. </li><li> Laboratuara - hemen flakon (90 dakika 30) taşıyın. </li></ol> Tüm aşağıdaki işlemleri laminer akış altında yapılmaktadır. <ol start="4"><li> Steril bir Petri kabı içine flakon içeriğini dökün. </li><li> Maksimum 1 m küçük parçalar halinde tümör örnek koymakm 3 steril bir neşter kullanılarak. Bu doku daha fazla işlem zarar eğilimi gibi tüm kalsifiye parçaları çıkarın. </li><li> Rasgele CAM uygulama için 10 tümör greft almak. </li></ol> 2. Tümör türetilmiş tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması Yaklaşık süresi: 3 saat <ol><li> Numunenin geri kalan doku tartılır. </li><li> 2 - dissociator bir tüp içinde doku, 4 g, birden fazla boru, kalan tüm tümör dokusu sindirimi için gerekli olabilir. </li><li> 2 sindirimi için, - doku, 4 g, 2.5 ml kollajenaz 2 çözeltisi (500 U / ml RPMI 1640) içinde ve 2.5 ml DNase çözeltisi (22 KU / ml RPMI 1640) ekleyin. </li><li> Dissociator h_tumor protokolüne göre doku işlem. Tüp 30 dakika hafifçe sarsıldı ise bu 37 inkübasyon 2 kür ° CO 2 inkübatör C içerir. </li><li> 150 mikron hücre süzgecinden kalan süspansiyon filtre. </li><li> 5 mi için 1000 rpm&#39;de lizat santrifüjn. </li><li> Süpernatantı. </li><li> Normal süspansiyonu ile inkübasyon 10 dakika sağlayan, eritrosit lizis tamponu (Elb) 10 ml pelletini. </li></ol> Not: eritrosit lizis tamponu ile aşağıda belirtildiği gibi imal edilmiştir: 0.037 g EDTA, 0.99 g K 2 HPO 4, 1000 ml su ile 8.29 g NH4CI ekleme, bir 0.22 mikron filtre basınç altında, 7.3 pH değerini ayarlamak için 10 N NaOH kullanmak filtre. 4 ° C&#39;de saklayın <ol start="9"><li> , Reaksiyonu durdurmak için kültür ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş) 25 ml ilave edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de süspansiyon santrifüj. Pelet rengi hemen beyaz olmalıdır. </li><li> Süpernatantı. </li><li> Pelet orta 5 ml ilave edilir. 70 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre. </li><li> Otomatik bir hücre sayacı vasıtasıyla canlı hücre / ml sayısını. </li></ol> 3. Cancer Hücre Hatları SAOS2 osteosarkom hücreleri (ATCC numarası: HTB-85) gelişmiş yeşil floresan proteini ifade üreticinin protokolüne uygun olarak Hücre Hattı Nucleofector Seti V kullanılarak pEGFP-C1 vektörü ile elektroporasyon işleminden geçirildi. Stabil hücre hatları oluşturmak için, transfekte edilmiş hücreler önceki oluşturulmuş protokol 20 paralel olarak 4 hafta boyunca G418 (1 mg / ml) içinde seçildi. Buna ek olarak ayırma, üreticinin talimatlarına göre, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) ile gerçekleştirildi. SW1353 kondrosarkom hücre hattı (ATCC numarası: HTB-94) alınan hücreler veya yeni hazırlanmış bir tümör tek hücre süspansiyonları, kırmızı bir floresan lipofilik membran lekesi kullanılarak etiketlenmiştir. <ol><li> Çözeltisi; Tripsin (% 0.5 ağırlık / hacim) etilendiamintetraasetik asit (% 0.2 ağırlık / hacim EDTA) kullanılarak klasik bir şekilde kültür şişelerinde hücreleri çıkarmak. </li><li> 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj edilir. </li><li> Supern çıkarınatant. </li><li> Serumsuz ortamda ve 5 ul DiI (Vybrant Kırmızı) / 10 6 hücre 1 ml ilave edilir. </li><li> Alüminyum folyo ile şişe sarın ve 37 10 dakika ° C için CO 2 inkübatör koydu </li><li> 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca tekrar santrifüje ve supernatant çıkarın. </li></ol> Chorioallantoic membran tahlilinde 1. Yumurta Kuluçka <ol><li> Yumurta% 95 döllenme garanti altına alan bir yerel ticari kuluçkahane gelen döllenmiş yumurta gereklidir. </li><li> Döllenmiş yumurta 10 gün oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> Not: kuluçka başlamadan önce, kir, tüy ve dışkı dikkatle yerine yumuşak bir yüzey yapısı daha kaba var kağıt havlu ile kuru silme ile mekanik olarak yumurta kabuğu kaldırılır. % 70 denatüre etanol ya da başka herhangi bir temizlik maddesi ile yumurta silme önemli piliç embriyoları hayatta kalma oranını azaltır. <ol start="3"><li> Incub içinde yumurta koymakBir tarafta ator, üst yüzey işaretleme. Yumurta inkübatör koymak edildiği gün embriyonik gelişim gün 0 belirlenmiştir. </li><li> 37.8 ° C&#39;de inkübasyon sıcaklığı, ve% 47 nem ayarlayın. Otomatik döndürme seçeneği kapalı olduğundan emin olun. </li></ol> 2. Yumurta Açılışı Süre: 25 yumurta ± 60 dk Geliştirme 3. günde, yumurta laminer hava akımı altında açılır. Membran kabuk sopa eğilimi, CAM zarar daha da gelişim aşamasında sonuçlara yumurta açılması. Bir kızılötesi lamba işlem sırasında yumurta sıcak tutmak için kullanılır. Kısırlık geliştirmek için, el eldiven kullanılmasını tavsiye ederiz. <ol><li> Yukarı bakacak şekilde belirgin yüzü, eggcup içinde yumurta yerleştirin. </li><li> Yumurta ucunda takılı bir 18 G iğne ile albümin iki ml kaldırarak CAM seviyesini indirin. Iğne birkaç perfore sonra künt iseyumurta kabuğu, iğne değiştirin. Eğer değilse, çok fazla kuvvet yumurta sarısı veya kabuğun kırık hasar ile sonuçlanan, sarf edilmesi gerekir. Bazen iğne chalazae, ak en sarısı askıya 2 spiral gruplarından biri tarafından engellendi. Bu blok çözülene kadar yavaşça geri pistonu iterek çözülebilir. Yumurta sarısı şırınga içine çekilir, iğne gibi şırınga değiştirin. Bazen embriyo bu olaydan sonra ölür. Albümin miktarı yetersiz çıkarılırsa kabuk kaldırıldığında, CAM zarar görür. </li><li> Pencere kesim sırasında CAM üzerine kabuk parçacıkları dökülmesini önlemek için, kabuk kısmının belirgin üst tarafında bir yarı-geçirgen bir yapışkan film uygulanır. </li><li> Yumurta yüzeyinde küçük bir bız ile bir giriş deliği olun. </li><li> Steril sivri uçlu cerrahi bir makas kullanarak, kabuk 1 cm 2 bir pencere kesin. </li><li> Embriyonun titreşimli kalp ve bitişik damarları inci de görülebiliryumurta sarısı e yüzey. Olmayan döllenmiş yumurta veya ölü embriyolar kaldırmak. Kan damarlarının bir kesintiye yönü ölü embriyo karakterize etmektedir. </li><li> Yarı geçirgen bir yapışkan film ile pencere mühür. Kabuk iğnenin sokulması esnasında çatlamaya sürece, ponksiyon karşılamak için gerekli değildir. </li></ol> 3. Aşılama Prosedürü Süre: hücre hattı başına ± 1 saat Civciv embriyonik gelişim günde 9, yumurta laminer hava akımı altında aşılanır. CAM yayılan kanser hücresi değerlendirilmesi inokülasyon esnasında sınırlı bir yüzey için hücrelerin muhafaza gerektirir. Matrigel çok deneysel hücre kültürü koşullarında kullanılan Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom bir hücre dışı matris (ECM), jel. Bu, soğutuldu, bir akışkan, ancak 20 ila getirdiği zaman termal aktif polimerizasyon doyurmaya - 40 ° C, böylece sabit bir jel meydana getirir. SırasındaDeneylerde, Matrigel erime buz içeren bir kutu tutulur. Not: delikli lamelleri kullanmamayı ısrar ediyorlar. Böylece zar kendisinde hücrelerinin büyümesini potansiyel eğimlendirme plastik disk üzerine bağlanma ve aşılı kanser hücrelerinin büyümesini görülmektedir. <ol><li> 10 6 cells/100 ul ECM jel konsantrasyonunda soğutulmuş ECM jel bir hücre pelletini. Erime buz üzerinde bu çözüm tutun. </li><li> Laminer hava akımı altında steril cerrahi bir çift ile yarı geçirgen zar Tüketim parçası. Yapışkan film tamamen kaldırılır, bu kirlenme nedeniyle embriyonik ölüm daha büyük bir oran ile sonuçlanacaktır. </li><li> Epitel hücre tabakası kaldırmak için, steril bir cam çubuk ile hafifçe kabuk penceresinin altındaki CAM doğru dokunun. Steril bir cam çubuk ile CAM dokunmak bir neşter n ° 11, daha beceriklilik ve deneyim gerektirir kullanarak daha az travmatik olduğunu kanıtlamaktadır. Küçük kanamalar oluşabilir. </li><li> Birtümör malzeme dding. </li><li> Tümör greftler için: bu sıkmadan steril forseps bir çift ile CAM üzerine doku hafifçe düşük tek parça,. </li><li> ECM jel işlem için: ECM jel uygulamalar arasında polimerize etmek için, birbirleriyle üstüne, CAM için hücre-ECM jel süspansiyonu 4x 25 ul ekle. Bu şekilde, kanser hücrelerini içeren bir yapışkan plak oluşturulur. </li><li> Yarı geçirgen bir yapışkan film ile tekrar kabuk penceresini kapatın. </li></ol> 4. Görüntüleme ve CAM Hasat Süre: 25 yumurta 2 saat Civciv embriyonik gelişim günde 16, CAM&#39;lar hasat edilir. Laminer hava akımı altında çalışan gerekli değildir. <ol><li> Cerrahi bir makas ile pencere büyütmek. Yaralı gemilerin kanama ile sonuçlanan, aksi CAM hasar görür, çok düşük kesmek için emin olun. </li><li> Ekle 300 - PBS D 500 ul CAM mezhep üzerine bir pipet ileinoküle malzeme içeren iyon. Herhangi bir flüoresan prob kullanıldığında, bu, membranın sertleştirir olarak, tamponlu formaldehid zarın kesimi kolaylaştıracak, kullanılabilir. </li><li> GFP veya DSR filtre ve hiçbir filtre her ikisini de kullanarak bir dijital renkli kamera ile donatılmış bir stereo floresan mikroskop,, ile yumurta CAM bir fotoğrafı olun. Tümör greftler, tüm fotoğrafları filtreleri olmadan yapılır. LED ışıklarla yukarıdan aydınlatma güçlü (Şekil 2) fotoğraf sırasında önerilir. </li><li> Etiketli hücreler için kayıt tümör hücre migrasyonu. Tümörlerin sınırları düzensiz ve yıpranmış olabilir. Dağınık hücreler tümör sınırları yakınında mevcut olabilir. Bazı örneklerde, tümör hücrelerinin satır (Şekil 3) gözlenebilir. </li><li> Kabuk karşı yalan sınırda steril bir makas ile membran kesin. </li><li> PBS D dolu ya da için tamponlu steril bir Petri kabındaki hasat CAM yerleştirinmaldehyde. </li><li> Üst yan ve ve filtre olmadan hem CAM alt tarafında, hem de bir fotoğrafı olun. </li><li> En az 72 saat boyunca tamponlu formaldehid ile etiketli bir kap içinde membran koyun. </li><li> Parafin CAM&#39;lar Embed ve histolojik inceleme için onları hazırlamak. Kesim yüzeyi kasetin alt paralel olmasına dikkat ederek, nodül merkezinde tümör greft kesmek için dikkat edin. Değilse, CAM ve tümör greft arasındaki etkileşimi görünmeyecektir. Aynı strateji ECM jel plaklar için geçerlidir: kesme bıçağı bakan yüzey plak dik olmalıdır. </li></ol> 5. Histolojik Değerlendirme Gerekirse Hematoksilen-Eozin boyama ve Ki-67 immünhistokimya, daha fazla açıklama için yapıldı. İmmünohistokimya göre otomatik bir slayt yapıcısı kullanılarak, kalınlığı 3.5 mikron arasında, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştirüreticinin talimatlarına. Ki-67 (klon MIB-1, seyreltme 1/100) bir primer fare monoklonal antikor kullanılmıştır. Isı kaynaklı epitop alma Hücre Klima 1 kullanılarak yapıldı ve görselleştirme Evrensel DAB Algılama Kiti ile sağlandı, üreticinin talimatlarına göre. Doku bölümlerinin Dehidratasyon otomatik bir coverslipper kullanılarak gerçekleştirilmiştir. SAOS2 ve SW1353 hücre hatları için, Ki67 pozitif ve Ki67-negatif hücre nuclei/100 mikron 2 sayısının üç bölgelerde sayıldı: bir yakın CAM sınırına, birinin merkezinde yüzey ve bir yakın ECM jel plak. Bu işlem her Ki-67 lekeli slayt için 6x tekrarlandı. Çoğalma endeksi sayılan toplam hücre sayısına göre Ki67-pozitif hücrelerin sayısına bölünmesi ile her bir slayt için belirlenmiştir. Nekroz fadi eşliğinde hücre çekirdeğinde kromatin ince dağılım kaybı, ile tanımlanırfarklı hücre marjlarının ng. Xenografts için, nekroz tam, (genellikle yüzeyde) kısmi veya eksik olarak puanlanır. CAM içine tümör hücrelerinin Sızma CAM mezoderm içinde tümör hücrelerinin gözlem ile tanımlanır ve mevcut veya yok olarak puanlanır. Üç öğe ana davranış puanlanır. Fibroblast infiltrasyonu uzun hücreleri CAM bırakarak ve tümör greft / plak işgalci olarak tanımlanır ve mevcut veya yok olarak puanlanır. Damar büyümesi çekirdekli civciv eritrositlerin varlığı ile karakterize civciv gemilerin, çoğalan gelişmesini olarak görülebilir.

<ol><li>Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+data+for+648+patients+with+osteosarcoma+treated+at+one+institution%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).</li>
<li>Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+drug+sensitivity+and+expression+of+multidrug+resistance+markers+in+early+passage+human+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).</li>
<li>Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22CA+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2001.</a> CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).</li>
<li>Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterisation+of+a+continuous+human+chondrosarcoma+cell+line%2C+ch-2879%3A+Comparative+histologic+and+genetic+studies+with+its+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigations%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin.</a> Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).</li>
<li>Taylor, B. S., Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+sarcoma+genomics+and+new+therpeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).</li>
<li>Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Sarcoma.</a> Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).</li>
<li>Nielsen, T. O., West, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+gene+expression+into+clinical+cara%3A+sarcomas+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm.</a> Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).</li>
<li>Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).</li>
<li>DeRose, Y. S., Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).</li>
<li>Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).</li>
<li>Bertotti, A., Migliardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecularly+annotated+platform+of+patient-derived+xenografts+%28%22xenopatients%22%29+identifies+HER2+as+an+effective+therapeutic+target+in+cetuximab-resistant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer.</a> Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).</li>
<li>Decaudin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+tumor+xenografted+models+%28%27tumorgrafts%27%29+for+good+management+of+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer.</a> Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Sys, G., Van Bockstal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+sarcoma+patients+tumor+morphology%2C+viability%2C+and+invasion+potential+and+indicate+disease+outcomes+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model.</a> Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).</li>
<li>Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+invasion+and+intramesenchymal+infiltration+of+the+chick+embryo+chorioallantois+by+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines.</a> Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).</li>
<li>Deryugina, E., Quigly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).</li>
<li>Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avascular+and+vascular+phases+of+tumor+growth+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo.</a> British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).</li>
<li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J. Vis. Exp. (33), e1620(2009).</li>
<li>Balke, M., Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Research Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Hendrix, A., Maynard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+secretory+small+GTPase+Rab27B+on+breast+cancer+growth%2C+invasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).</li>
<li>Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+normal+and+neoplastic+tissues+grafted+to+the+chick+chorioallantois%3A+role+of+host+and+preexisting+graft+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels.</a> American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).</li>
<li>Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li>
<li>Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li>
<li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li>
<li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li>
<li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemoinvasion+assay%3A+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Aşılama ve hasat zamanı Aşılama yapıldığı gün ECM jel (36 CAM&#39;lar) içinde SAOS2 kullanılarak yapılan ve embriyonik gelişim gün 5 ile 10 arasında değişiyordu zamanlama. Kuluçka gün önce 9, CAM sürekli biz uygulanan ECM jel destekleyecek kadar büyük değildi. Hasat, tümör hücreleri bazen derin CAM alınan gerekiyordu ve bazı ECM jel örnekleri albümin ya da CAM gevşek yatıyorlardı. Gün 5 ve 6, bu civciv malformasyonlar veya ölümle sonuçlanan, civciv embriyo üzerindek...

Sarkomu tedavisi direnci 1,2 nedeniyle yüksek mortalite ile bağ dokularının bir nadir bir tümördür. Hasta hayatta ilerleme, düşük yıllık insidansı, onların geniş çeşitlilik ve sarkom hücreleri in vitro 3,4 kültür zor olduğu bildirilmektedir gerçeği ile engellenmektedir. Klinik öncesi tedavi değerlendirmesi için kültür hücrelerinin kullanılması in vitro yeni, görünüşte aktif molekülleri her zaman klinik ortamda sonuçları yansıtmamaktadır ortaya koymuştur. Ayrıca, gen ifadesi diziler ortaya genom sapmaları her zaman 5-7 hasta tümör davranış özellikleri ile ilişkili değildir. Bu sorunları denemek ve çözmek için, kişiye özel tıp ksenogreft modelleri 8-12 için artan arama yansıtılır önem, kazanmıştır. In vivo deney, bir C arasındaki karmaşık etkileşimi yansıtan avantajına sahiptirkanser proliferasyonu ve invazyonu 13 için gerekli ancer hücreleri ve solid tümörlerde konak doku ortamında,. Şu anda sarkomu 14,15 için bir tekrarlanabilir xenograft model olarak Chorio-alantoik Membran testi (CAM-testi) kullanımını incelemek. Bu deney, yaygın tümör anjiyojenezi 16,17 çalışma için kullanılmıştır. Diğer çalışmalarda farklı protokoller 18,19 göre büyüme ya da anjiyogenez belirgin bir fark gözlenmiştir ise literatürde, ancak biz, bu tahlil için farklı protokoller bulduk. Bu yazıda tümör greft, tümör kaynaklı tek hücre süspansiyonları ve köklü sarkomu hücre kültürleri kullanarak hücre davranışı üzerindeki CAM-testinin koşulları değişen etkisini araştırmak.

<table><tbody><tr><td>Hücre Hattı Nükleofektör Kiti V</td><td>Amaxa</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>kollajenaz 2 çözeltisi (500 U / ml RPMI 1640)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dnase çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td></td></tr><tr><td>fare birincil monoklonal antikoru Ki67</td><td>Dako Danimarka</td><td>MIB-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fluka</td><td>D76240</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012019</td><td></td></tr><tr><td>PBSD</td><td>Invitrogen</td><td>14040083</td><td></td></tr><tr><td>peGFP-C1 vektör</td><td>Clontech</td><td>632470</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>İnvitrojen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant hücre etiketleme DiI</td><td>Lifetechnologies</td><td>22885</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>dijital renkli kamera</td><td>Leica</td><td>DFC 340 FX</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Yumurta Kuluçka Makinesi</td><td>Otomatik Elex Co</td><td>R-COM 50</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAriaIII</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs Ayrıştırıcı</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs Ayrıştırıcı Kullanım Kılavuzu h_tumor protokolünü içeren</td><td>Miltenyi Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>yarı geçirgen yapışkan film (Suprasorb F)</td><td>Lohmann& Rauscher</td><td>20468</td><td></td></tr><tr><td>stereo floresan mikroskobu</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Film otomatik Vestfalya</td><td>Sakura</td><td>6400</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Evrensel DAB Tespit Kiti</td><td>Ventana Medical Systems Inc</td><td>760-500</td><td></td></tr><tr><td>Ventana Otomatik Slayt Boyayıcı</td><td>Ventana Medical Systems</td><td>Benchmark XT</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; ovo</emsarkoma için bir xenograftmodel olarak&gt; cam-testi

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarkoma tüm yeni tedavilerin geliştirilmesi engel, doğada heterojen bir çok nadir görülen bir hastalıktır. Sarkom hasta bu hastalık için bir tekrarlanabilir ve düşük maliyetli kısenotransplant modeli gelişmekte olan cari faiz açıklayan, tabakalaşma sonra kişiselleştirilmiş tıp için ideal adaylardır. Civciv chorioallantoic membran türe özgü kısıtlama olmaksızın aşılı doku ve hücrelerin sürdürülmesi yeteneğine sahip doğal bir bağışıklık sistemi zayıf ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, kolayca, erişilebilir manipüle ve optik ve floresan stereomikroskobi kullanarak görüntülü. Histoloji daha heterotipik hücresel etkileşimlerin detaylı analiz sağlar. Bu protokol, detaylı şekilde açıklanmaktadır taze sarkomu türevli tümör dokuları, bunların tek hücre süspansiyonları, ve kalıcı ve geçici floresan etiketli Kurulan sarkoma hücre çizgileri (Saos-2 ve SW1353) ile korioallantoik membran aşılama ovo. Civciv hayatta kalma sıçanes% 75 kadar vardır. Modeli greft-(canlılığı, Ki67 proliferasyon indeksi, nekroz, infiltrasyon) ve ev sahibi (fibroblast infiltrasyonu, vasküler yapıdaki) davranışlarını incelemek için kullanılır. Tek hücre süspansiyonları aşılama lokalize için, ECM jel etkisiz altına malzemelere göre önemli avantajlar sağlamaktadır. Ki67 proliferasyon CAM yüzeyinden hücre mesafe ve CAM, terapötik ürünlerin eklenmesi için bir zaman dilimi belirlenmesi ikincisi uygulama süresi ile ilgilidir.

CAM değerlendirilmesi Tümör greft CAM (Şekil 2A) yapışık olur. Hasta malzemeden tek hücre süspansiyonları sık sık kuru, hafif kabarık plak (Şekil 2D) görüntüler. CAM eksizyonu sonra, membran kırışıklıklar (2E ve 2F Şekiller) oluşur oldu. Ticari bir hücre hattı için plak hücre çoğalması gösteren, zaman içinde daha opak hale gelir. ECM jel farklı hücre hatları CAM üzerinde belirgin bir büyüme paterni ...

<em&gt; Ovo</em&gt; Chorioallantoic membran (CAM), taze sarkomu türevli tümör dokuları, bunların tek hücre süspansiyonları, ve kalıcı ve geçici floresan etiketli Kurulan sarkoma hücre hatları ile aşılanır. Modeli greft-(canlılığı, Ki67 proliferasyon indeksi, nekroz, infiltrasyon) ve ev sahibi (fibroblast infiltrasyonu, vasküler yapıdaki) davranışlarını incelemek için kullanılır.

<em&gt; Ovo</emSarkoma için bir Xenograftmodel olarak&gt; CAM-testi

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bu prosedürün genel amacı, sarkom, hücre veya greft davranışını incelemek için civciv koryoallantoik membran veya CAM testi gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle inkübasyonun üçüncü gününde yumurta kabuğunda bir pencere açılarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, inkübasyonun dokuzuncu gününde tümör materyali hazırlanır.Ardından epitel tabakası kaldırıldıktan sonra, tümör CAM'e eklenir. İnkübasyonun 16. günündeki son adımda, CAM fotoğraflanır, hasat edilir ve histolojik değerlendirme için formalinde fikse edilir. Nihayetinde; sarkom, hücre proliferasyonu ve invazyonu, vaskülarizasyon ve konakçı reaksiyonlarını göstermek için klasik H&amp;E histolojisi ve immünohistokimya kullanılır. Bu tekniğin ksenogreft gibi mevcut modellerin çoğuna göre temel avantajı, öğrenilmesinin basit ve nispeten ucuz olmasıdır.Ayrıca, çok kısa bir zaman diliminde çok sayıda metastaz ilişkili aktiviteyi incelemenize olanak tanır ve etik kurul onayı gerektirmez. Bu yöntem; tümör-konak etkileşimlerinin tümör sağkalımı üzerindeki etkisi, tümör mikroçevresinin yeniden oluşumu ve stroma hücrelerinin katılımı gibi sarkom araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hastanın kendi materyaller

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Immünkompetan Fare Seröz Yumurtalık Kanseri bir Ortotopik Model In vivo</emTümör Bağışıklık Yanıtları> Tümör Görüntüleme ve İzleme

Civciv koryoallantoik membran (CAM) immün yetmezliklidir ve oldukça vaskülarizedir, bu da onu doğal bir in vivo tümör büyümesi ve anjiyogenez modeli yapar. Bu protokolde, CAM testi kullanılarak üç boyutlu, vaskülarize hepatosellüler karsinom (HCC) tümörlerinin büyütülmesi için güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

<em&gt; Ovo</emHepatosellüler karsinom Verimli Xenograftlarında Modeli olarak&gt; Piliç Chorioallantoic Membran (CAM) Deneyi

İnsan multipl miyeloma (MM) hücreler, mezenkimal hücreler ve hayatta kalma ve proliferasyon için hücre dışı matris bileşenlerinin destek mikro-gerektirir. Biz tümör büyümesi, işgali ve anjiyogenez üzerine kanser ilaçlarının etkilerini incelemek için engrafted insan miyelom ve mezenkimal hücreler ile in vivo tavuk embriyo modelini kurdu.

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Burada, biyolojik ilgili sitelerdeki kanser için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için bir protokol ultrason destekli enjeksiyon Nöroblastom (NB) ve Ewing sarkomu (ES) hücre yararlanmak için (hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri kurulu) mevcut araştırma.

Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Tavuk koryoallantoik membran modelini jinekolojik ve ürolojik kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı tümörlerin engraftment için alternatif, nakledilebilir, in vivo modeli olarak sıyoruz.

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Bu protokol, ortopik osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturmak için intratibia osteosarkom hücre enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Burada, insan yumurtalık dokusu için bir civciv koryoallantoik membran (CAM) ksenogreftleme modeli geliştirmek için bir protokol açıklıyoruz ve tekniğin etkinliğini, greft revaskülarizasyon zaman çerçevesini ve 6 günlük bir greftleme süresi boyunca doku canlılığını gösteriyoruz.

Yumurtalık Dokusu Transplantasyonunu İncelemek İçin Bir Araç Olarak Civciv Korioallantoik Membran (CAM) Modeli

Mevcut protokol, insan osteosarkom dokusu kullanılarak hasta kaynaklı bir ksenogreft (PDX) fare modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır.

İnsan Osteosarkom Dokuları ile Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modelinin Kurulması

Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.

Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)

Keşfedin tavuk koryoallantoik membran (CAM) testi ile sarkom davranışlarını ve tümör-konak etkileşimlerini inceleme yöntemini. Bu teknik, tümör mikroçevresi ve stroma hücre rekrütmanı üzerine değerli bilgiler sunar.

Daha fazla video keşfet