Name: Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı 2 + ve sfingomiyelinaz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 25 s
Description: Öğrenin, FM1-43 lipofilik boyası ve canlı hücre görüntüleme kullanarak plazma membranı onarım kinetiğini değerlendirmeyi. Bu hassas yöntem, kalsiyum ve sfingomiyelinazın hücre zarı dinamiklerindeki rollerini niceliksel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Biz SLO ifade plazmid için Oklahoma Üniversitesi&#39;nden Dr R. Tweten teşekkür NWA NIH hibe R37 ve R01 AI34867 GM064625 tarafından desteklenmiştir.

1.. ASM Transkripsiyonal suskunluğu <ol><li> Tohum 1.5 x 10 DMEM büyüme ortamı içinde 2 ml 5 HeLa hücreleri, 35 mm &#39;lik cam taban yemekler (MatTek) (DMEM yüksek,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin,% 1 Penn-Strep ile glikoz) ve % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Ertesi gün, büyüme ortamı aspire ve siRNA transfeksiyon karışımı ilave edilmeden önce 2 ml DMEM düşük serum ortamında (% 4 FBS DMEM), en az 1 saat ile değiştirin. </li><li> SiRNA oligo transfeksiyon karışımı boyunca 4 tüpleri hazırlayın. Tüpler A ve C olarak, transfekte edilecek 35 mm tabak başına 250 ul Optimem indirgenmiş serumu ve 4 ul Lipofektamin RNAiMax ekleyin. Tüp B içinde, Optimem 250 ul transfekte edilecek 35 mm tabak başına, kontrol ortamı GC içeriği oligo (Kontrol siRNA) ve serum ve 8 ul (160 pmol), indirgenmiş ekleyin. Tüp D eklemek Optimem 250 ul 35 mm çanak t başına SMPD1 oligo (siASM) ait serum ve 8 ul (160 pmol) azaldıo transfekte edilebilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon için kontrol siRNA kompleksi ve ASM siRNA tüpler C ve D tüpleri oluşturulması için A ve B bir araya getirin. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe reaksiyonları. </li><li> Ilgili 35 mm cam alt yemekleri içine Kontrol siRNA ve ASM siRNA transfeksiyon reaksiyon yavaş yavaş karışımlarını, damla damla ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe. 24 saat sonrası transfeksiyon, hafifçe medya aspire ve taze DMEM büyüme medya ile değiştirin. Verimli ASM demonte için, yemekleri daha canlı görüntüleme önce yaklaşık 31 saat (toplam 55 saat) için 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe edilmelidir. </li></ol> 2. Canlı Mikroskopi Ayıraçların hazırlanması <ol><li> Ca 2 + ve Mg2 + olmaksızın soğuk 1 x PBS içinde 100 ng / ul &#39;lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici gözenek oluşturucu toksin streptolizin O (SLO) içinde bir çözeltisi hazırlandı. Bu deneylerde kullanılan SLO bir constitutivel olduğukibarca Dr Rod Tweten, Oklahoma Üniversitesi tarafından sunulan aktivitesi için indirgeme maddeleri gerektirmeyen y aktif sistein mutant. Toksin E&#39;de ifade edildi E. coli BL21 DE3 ve daha önce tarif edildiği gibi 16, yerel koşullar altında arıtıldı. </li><li> FM1-43 stok solüsyonu hazırlayın: DMSO içinde süspanse FM1-43 liyofilize toz 25 mM çözüm oluşturmak için. </li><li> Çözelti A hazırlayın: 4 uM (1.5 mi MatTek tabak başına gerekli olan) bir son konsantrasyona kadar Ca 2 + soğuk DMEM FM1-43 stok çözeltisi seyreltilir ve gerektiği kadar buz üzerinde depolanır. </li><li> Çözelti B hazırlayın: 4 uM (MatTek tabak başına gerekli 1.5 mi) bir son konsantrasyona kadar Ca 2 + ve 10 mM EGTA (Ca 2 + içermeyen DMEM) olmadan soğuk DMEM FM1-43 stok çözelti sulandırarak kadar buz üzerinde saklamak gerekli. </li><li> Pre-ılık (37 ° C) Eppendorf tüpleri içinde çözüm A ve Çözelti B&#39;nin 1 ml&#39;lik eş payları. </li><li> Ca 2 + ve C ile DMEM buz çözümler tutun2 + içermeyen DMEM. </li></ol> 3. FM1-43 Tedavi SLO içine Akın ve Tedavi edilmeyen Hücreler Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> , Buz parçaları ile orta boy bir sığ metal kap doldurun buz ile büyük bir cam kap içine ters çevirin ve maruz kalan metal kabın, sadece alt yüzeyini terk ilave buz ilave edin. Hatta termal transfer izin vermek için açıkta kalan metal alt ıslak kağıt havlu yerleştirin. </li><li> Bir kontrol siRNA tedavi MatTek çanak (Numune 1) alın ve soğuk ıslak kağıt havlu yerleştirin. Yavaşça tüm medya aspire ve soğuk Ca 2 + ücretsiz DMEM ile 3x yıkayın. Son yıkamadan sonra, çanak tüm medya aspire. </li><li> To görüntü hücreye birleşik FM1-43 no SLO yaralama Ca 2 mevcudiyetinde (Örnek 1) ile hücrelerde +, 35 mm &#39;lik cam taban çanak merkez cam lamel soğuk Çözelti B&#39;nin 180 ul ekleyin ve 5 için inkübe dakika buz üzerinde (Tablo 1). </li&gt; <li> 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı ve (sıcaklık, nem ve CO2 seviyeleri muhafaza) bir çevre bölmesi ile donatılmış bir konfokal mikroskop sahnede MatTek çanak yerleştirin. 40X NA 1.3 objektif (Nikon) bakarak görüntülenmiş olacak hücre alanını bulun. Varsa, termal sürüklenme düzeltmek için PerfectFocus veya benzer bir cihaz üzerinde açın. </li><li> Yavaşça 35 mm&#39;lik çanak tarafına önceden ısıtılmış Çözüm A 1 ml ilave edilir ve çevre odası (Tablo 1) ve kapağı yerine takın. </li><li> (Ultraview Vox Perkin Elmer dönen disk konfokal mikroskopi sisteminde Volocity) uygun görüntüleme yazılımı kullanarak her 3 saniyede 1 kare 4 dakika boyunca görüntü kazanır. FM1-43 Eksitasyon 488 nm bant geçişi ile, bir dikroik filtre kullanılarak bir 488 nm lazer hattı ile gerçekleştirilir ve emisyon ayrımcılık 527 (W55) emisyon filtre kullanımı yoluyla elde edilir. Lazer güç seviyeleri ve kamera duyarlılık 100 milisaniye görüntü pozlama elde etmek için ayarlanır. </li><li> Tekrar 3,2-3,6 bu adım 3,5 Solution B (Tablo 1) ilave edilmelidir dışında, Ca 2 + yokluğunda hiçbir SLO yaralama (Numune 2) ile kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelerde FM1-43 tespit için yineleyin. </li><li> Mevcudiyetinde (Örnek 3) veya Ca 2 + yokluğu (Örnek 4), merkez cam lamel SLO ihtiva eden soğuk Çözelti B&#39;nin 180 ul ekle ya SLO yaralandı kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelere FM1-43 akını ölçmek 35 mm&#39;lik cam alt çanak ve aşama 3.3 &#39;de olduğu gibi, buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Tekrar 3.6 ile 3.2 adım, basamak 3,5 (Tablo 1) Çözüm A veya B Çözüm ya ekleyerek ayarlayın. </li><li> Plazma zarı tamir ASM rolünü belirlemek için, tekrar tüm koşullar (Örnekler 5-8) (Tablo 1) ASM siRNA&#39;nın muamele hücreleri kullanılarak 3,2-3,6 adımları. </li><li> Üzerinde dışı rekombinant sfingomiyelinaz (SM) rolünü belirlemek için(FM1-43 akını inhibisyonu ile gösterilmiştir), plazma membran onarım kinetiği (Örnekler 9-10), SM ilave aşama 3,5 (0-50 μU) için çözelti A ya da B solüsyonu ve daha sonra canlı hücre sırasında hücrelere ilave edilir 1 ml (Tablo 1) bir toplam hacim içinde görüntüleme. </li></ol> 4. Hücreler içine FM1-43 Akın miktar tayini <ol><li> Filmler elde edilmiştir sonra, görüntü analiz yazılımı (Volocity Suite, PerkinElmer) kullanılarak FM1-43 hücre içi floresan yoğunluğunu ölçmek. Alanında her hücrenin sitozolik bölgede ilgi bir bölgeye çekmek ve video tüm çerçeveler boyunca ortalama FM1-43 floresan yoğunluğunu belirlemek için yazılım araçları geçerlidir. </li><li> Başlangıç ​​FM1-43 boyama farklılaşmaların ayarlamak için, her bir görüntü için veri zaman, flüoresan yoğunluğundaki kat artış olarak ifade edilir ve her biri farklı bir durum için grafiğe geçirilmiştir. Her bir zaman noktasında her bir bölgesinin floresansta kat artışF T hücre spesifik bir zaman noktasında ortalama floresan olan T F / F 0 olarak hesaplanan, F ve 0, t = 0 (Şekiller 1-2) de ortalama floresan olmasıdır. </li></ol>

<ol><li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeilbrunn%2C+L+%22The+dynamics+of+living+protoplasm%22">The dynamics of living protoplasm</a>. , Academic Press. (1956).</li>
<li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChambers%2C+R+%22Explorations+into+the+nature+of+the+living+cell%22">Explorations into the nature of the living cell</a>. , Harvard University Press. (1961).</li>
<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+formation%3A+an+ancient+yet+complex+form+of+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li>
<li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li>
<li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li>
<li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2%2B-dependent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717(2011).</li>
<li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-dependent+cytolysins%2C+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li>
<li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li>
<li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 Forthcoming.</li>
<li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin%2C+lysenin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Mekanik yaralanma ve plazma zarı onarımı ile ilgili önceki çalışmalar, cam boncuklar, micropipetting, kesme, tırmalama ya da kazıma bırakarak kadar, yaralama hücrelerin çeşitli mekanizmaları dayanıyordu. Tüm bu testlerin saati yerine nicel daha nitel olduğunu ve tamir mekanizması kinetikleri üzerinde kesin bir bilgi vermemiştir. Yaralanma bu formları sonra plazma zarı mühürlemek için hücrelerin yeteneği membran geçirgen olmayan boyalar, sitosolik enzim, ATP seviyeleri, ya da uzun vadede kaybı sitoplazma, penetrasyonu hü...

Bu mekanik yaralanma sonrası plazma zarı tamir bir Ca2 +-bağımlı bir işlem 1,2 olduğu yıllardır bilinmektedir. Daha sonraki çalışmalarda yara yoluyla Ca 2 + 3,4 akışı yeniden kapatılması için gerekli olan yaralanma yerinde okuyun, hücre içi veziküller ekzositozu bir güçlü işlemi tetikler gösterdi. Hücrelerin sitoplazması içine yüklenmiş bir floresan boya kaybı oranı tamir hızını değerlendirmek için kullanılır, ve yeniden mühürleme yaralanma sonrası 5 &lt;30 sn içinde tamamlanmıştır sonucuna varılmıştır. İki model başlangıçta plazma zarı tamir ekzositozu için gereksinimi açıklamak için önerilmiştir: lezyonu boyunca Ca 2 + akını geniş bir &quot;yama&quot; oluşturan, hücre içi veziküllerin başlangıçta homotipik füzyon tetikler önerdi 1) &quot;yama&quot; modeli, bu olur daha sonra yara 6 ve zar adde önerilen 2) gerilim azaltma modeli tekrar kapatılması için, plazma zarına uygulanmasıyaranın çevresinde Ca 2 +-bağımlı Ekzositoz tarafından d çift-katlı 7 doğru bağlantı kolaylaştıran, plazma zarı gerilimi azaltacaktır. Plazma membranı tamir Ca 2 + tetiklenen Ekzositoz rolü ayrıca lizozomlar yaralı hücrelerindeki eksositosizini ve plazma membranı onarım kolaylaştıran bir Ca 2 + sensor molekülü, synaptotagmin VII, içerdiğini gösteren çalışmalar ile takviye edilmiş 8,9,10,11 . Ancak, ek delil yalnız ekzositozu plazma zarı tamir teşvik için yeterli olmadığını belirtti. Plazma membranı üzerinde mekanik gözyaşı ek olarak, hücre hasarı sık rastlanan bir şekilde bakteri 12,13 veya 14,15 bağışıklık hücreleri tarafından üretilen gözenek oluşturucu toksinler tarafından permeabilizasyon olduğunu. Mekanik gözyaşı farklı olarak, gözenek oluşturucu proteinler, plazma membranı, bir membran &quot;yama&quot; uygulanarak veya reduc basitçe kapatılmalı edilemez bir kararlı, protein kaplı gözenek oluşturucu kendilerini eklemekmembran gerilimi ing. İlgi çekici çalışmalar memeli hücreleri gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra plazma membran onarım için etkili bir mekanizma var, bu işlem, aynı zamanda, hücre dışı Ca2 +, 12 mevcudiyetini gerektirdiğini gösterdi. Mekanik yaralar 5 ile gözlemlediği gibi, bu bulgu, hücre yüzeyinde zar gözenek kaldırılması da hızlı bir süreç olup olmadığı sorusunu gündeme. Işlem Ca 2 + hücre dışı gerektirir ve ~ 30 saniye içinde tamamlanır: Şaşırtıcı bir şekilde, bizim son çalışmalar, gözenek oluşturucu toksinlerle permeabilize hücrelerin tekrar kapatılmasına mekanik deliklerinin onarımında çok benzer özelliklere sahip olduğunu ortaya koydu. Daha ayrıntılı olarak, bu işlem incelenmesi, son zamanlarda lizozomların Ca2 + ile düzenlenen Ekzositoz ek olarak, plazma zarı tamir asit sfingomiyelinaz (ASM), lisosomal enzim salınması tarafından tetiklenen ve esastır endositoz hızlı bir form içerir öğrendik sadece thzar gözeneklerinin e çıkarılması değil, aynı zamanda mekanik yaralar 16 tamiri için. Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine kinetiklerini belirlemek için laboratuarımızda biz lazer yaralı izole kas liflerinin 17 doğru bağlantı değerlendirmek için daha önce kullanılmış olan bir canlı görüntüleme yöntemi uyarlanmıştır. Bu deney, stabil şekilde floresan yoğunluğunda artan lipid iki katmanlı dış sayfada içine intercalates lipofilik boya FM1-43, özelliklerine dayanır. Plazma membranı iki tabakalı plazma zarı hasarı tespit etmek ve 18,16,19,20 onarmak için hassas bir tahlil sağlayarak, hücre içi membranlara hücre dışı boya erişir bozulduğu zaman. Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine değerlendirilmesi için bu tahlil uyarlamak için, membran kolesterolünün 21 bağlanan bakteriyel toksin streptolizin O (SLO) ile 4 ° C&#39;de hücreler önceden inkübe edilmiştir. Senkron hücrepermeabilizasyon sonra kolayca gözenek oluşumuna neden transmembran konformasyonda oligomerizasyonu ve değişim aktive ısıtılmış bir mikroskop aşamasında, orta ısınmaya buz hücreleri hareket ile elde edilebilir. Bu yaklaşımın bir avantajı, lazer yaralama ile daha önce yayınlanmış çalışmalar boyunca, daha büyük bir hücre sayısı, hücre popülasyonunun daha iyi örnekleme sağlayan, mikroskobik alan eş zamanlı olarak analiz edilebilir olmasıdır. Gözenek oluşturucu toksinler ile mekanik yaralanma ve geçirgenleştirmeden sonra görülen hücre mühürleme işlemi arasındaki mekanik benzerlikler göz önüne alındığında, biz burada açıklamak tahlil plazma zarı onarım temel sürecine dahil faktörleri diseksiyon için çok yönlü ve güçlü bir yöntem sağlar. Bir örnek olarak, bu onarım sürecinin Ca 2 + bağımlı ve bağımsız adımları belirlemek için bu tahlil kullanmak mümkün olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>HeLa 229 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CCL2-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Yüksek Glikoz </td><td>İnvitrojen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Yüksek Glikoz Kalsiyum</td><td>İnvitrojen</td><td>Yok 20168</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Optimem Azaltılmış Serum</td><td>İnvitrojen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Lipofiktamin RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Kontrol ortamı GC içeriği RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td></td></tr><tr><td>SMPD1 RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>HSS143988</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Isıyla İnaktive Edilmiş</td><td>Gemini-Biyoürünler</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus cereusSigma S7651'den Sfingomiyelinaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam alt tabaklar</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu Fotonik</td><td>C9100-50</td><td></td></tr><tr><td>Dönen disk konfokal mikroskop</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraViewVoX</td><td></td></tr><tr><td>Yazılım analizi yazılım</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity Suite</td><td></td></tr><tr><td>Çevre odası</td><td>Patoloji Cihazları</td><td>LiveCell Sistem Odası</td><td></td></tr></tbody></table>

ca rolleri değerlendirilmesi için görüntüleme testi canlı<sup&gt; 2 +</supgözenek oluşturucu toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plazma zarı yaralanması sık görülen bir olaydır, ve yaralar hızla hücresel hayatta kalmasını sağlamak için tamir edilmesi gerekir. Ca 2 + akını ~ 30 saniye içinde, plazma zarı üzerinde mekanik yaraların onarım tetikleyen anahtar bir sinyal bir olaydır. Son çalışmalar, memeli hücreleri aynı zamanda gözenek endositoz ardından lizozomal enzim asit sfingomiyelinaz ekzositozu içeren bir Ca2 +-bağlı işlemde toksinler oluşturan geçirgenleştirmeden sonra plazma zarı kapatın olduğunu ortaya koydu. Burada, söz konusu toksin streptolizin O ile geçirgen hücrelerin tekrar kapatılmasına Ca2 + akışı üzerinde de hızlı ve bağımlı olduğunu göstermek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Deney tasarımı sağlar: yaralanma olayı senkronizasyon ve görüntüleme ile, plazma membran bütünlüğünü ve lipofilik boya FM1-43 hücre zarları ile ulaştığı ölçüde miktarının hücrelerin yeteneği kesin bir kinetik ölçümü. Bu canlı tahlil also Eksojen yeteneği hassas bir değerlendirmesi plazma membran onarım hücrelerinin yeteneğini yansıtan FM1-43 akışını engellemek için bu tür sfingomiyelinaz gibi çözülebilir faktörler ilave sağlar. Bu deney, bize, enzimin eklenmesi hücre dışı Ca2 + yokluğunda permeabilize hücrelerin doğru bağlantı teşvik tarihi sfingomiyelinaz, Ca2 +-bağımlı Ekzositoz aşağı hareket ilk kez göstermektedir bırakıldı.

Lizozomal asit sfingomiyelinaz tükenmiş hücrelerde bakteriyel sfingomiyelinaz (SM) kurtarma plazma zarı onarımı düşük konsantrasyonları. FM1-43 görüntüleme deneyi kullanılarak, daha önce Ca 2 + mevcudiyetinde yaralama lizozomal enzim ASM eksikliği olan ve SLO maruz kalan hücreler, plazma zarı kusur yeniden birleştirici insan enzimi 19 hücre dışı eklenmesiyle kurtarılır sahip olduğunu göstermiştir. İnsan ASM lızozomal düşük bir pH optimumuna sahip olduğu için, biz yeniden m...

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Bu prosedürün genel amacı, plazma membranından düşük performanslı toksin uzaklaştırmasının kesin kinetiğini ölçmek için canlı hücre görüntülemede lipofilik boya FM 1 43'ü kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle toksinin dört derece Celsius'ta ön bağlama yapılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kabın ısıtmalı mikroskop tablasına aktarılması ve hücrelerin görselleştirilebileceği bir odak düzleminin bulunmasıdır.Ardından, uygun ön ısıtılmış medyumu ekleyin ve hemen görüntülemeye başlayın. Son adım, hücre içi FM 1 43 floresansını analiz etmek ve nicelleştirmektir. Sonuç olarak, bu hassas analiz; plazma membranı onarımı için kalsiyum, fingal, miyelin ve diğer faktörlerin gereksinimlerini değerlendirmek amacıyla kullanılabilir.Bu tekniğin lazerle yaralama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu SLL permeasyon analizinin, hücre izasyonu tetiklendikten sonra boyutu oldukça tekdüze olan plazma membranı lezyonlarının senkronize bir şekilde oluşmasını sağlamasıdır. Lipofilik boya girişinin canlı zaman ayarlı görüntülemesi, plazma membranı yeniden kapanma kinetiğinin hassas ve oldukça tekrarlanabilir bir şekilde kesin olarak belirlenmesine olanak tanır. Bu analiz, kalsiyum ve rekombinant F

live-imaging-assay-for-assessing-roles-ca2-sphingomyelinase-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak...

Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Iyileşme yaralı hücrelerinin hücre zarı gibi bir işlem yaralanma siteye özgü protein ve hücre içi bölmeler kaçakçılığı içerir. Bu protokol, bu süreçleri izlemek için deneyleri açıklar.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

Burada, keratinositler üzerinde sterptolisin S, grup A streptococcus tarafından üretilen bir salgılanmış toksin etkilerini incelemek için geçirgen bir membran geçme tabanlı enfeksiyon sistemi kullanılarak bir yöntem tarif edilmektedir. Bu sistem, kolaylıkla enfeksiyon sırasında çeşitli ev sahibi hücre tipleri diğer salgılanan bakteriyel proteinlerin çalışmaya uygulanabilir.

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Biz bir non-invaziv vivo içinde aerodinamik ve maliyet-etkin, protokolü Imaging görselleştirmek ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bir fare excisional yara modelinde oluşturulan ölçmek için L-012, bir chemiluminescent luminol-analog, kullanan açıklar.

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

AlPcS2a aracılı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI), canlı hücrelerde hücre içi veziküllerin (IV'ler) uzaysal zamansal hasarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım

Burada sunulan, gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu bağlanma, sitotoksisite ve sinyalleşmeyi belirlemek için Leishmania majör promastigotlarını kullanan bir protokoldür. Streptolizin O ile bir kavram kanıtı sağlanır. Diğer toksinler, toksin direncinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için L. major'da bulunan genetik mutantlardan yararlanmak için de kullanılabilir.

Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek

Termoplazmonik delme yöntemi, hücrelerde ve dev unilameller veziküllerde plazma membran onarımı sırasında protein tepkilerini incelemek için konfokal mikroskopi, optik cımbız ve altın nanopartikülleri entegre eder. Teknik, hızlı ve lokalize membran delinmesini mümkün kılarak, anahtar proteinlerin ve bunların karmaşık plazma membran onarım mekanizmasındaki fonksiyonel rollerinin tanımlanmasına izin verir.

Canlı Hücrelerde ve Model Membranlarda Plazma Membran Onarımını Araştırmak İçin Termoplazmonik Bir Yaklaşım

Öğrenin, FM1-43 lipofilik boyası ve canlı hücre görüntüleme kullanarak plazma membranı onarım kinetiğini değerlendirmeyi. Bu hassas yöntem, kalsiyum ve sfingomiyelinazın hücre zarı dinamiklerindeki rollerini niceliksel olarak analiz etmenizi sağlar.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı

Daha fazla video keşfet