Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Bu prosedürün genel amacı, akut ve kronik kas rejenerasyonunun fare modellerinde indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli kas progenitörlerinin miyojenik potansiyelini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak hücrelerin miyojenik potansiyelinin in vitro olarak değerlendirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücrelerin kas içi enjeksiyon yoluyla nakledilmesidir.

Alternatif olarak, hücreler mikrocerrahi bir prosedürle femoral artere enjekte edilir. Son adım, tedavi edilen hayvanların distrofik fenotipinin fonksiyonel iyileşmesini değerlendirmektir. Sonuç olarak, immünofloresan ve histoloji testleri, donör hücrelerin konak kaslara aşılama ve fonksiyonel katkısını göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, hücre tedavisi yaklaşımlarının araştırılması gibi iskelet kası rejenerasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, IPS hücreleri DER progenitörleri kullanılarak otolog hücre tedavisi stratejilerinin yolunu açabileceğinden, kas distrofilerinin tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem kök hücre bazlı tedaviler hakkında bilgi sağlayabilse de, moleküllerin intramüsküler veya intra artily olarak verilmesi ve daha sonra kas fonksiyonu ve morfolojisi üzerindeki etkinin analizi gibi diğer sistemlere uygulanabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, IPSL kültürünün, doku biyopsilerinden elde edilebilirlik ve genişleme potansiyelleri gibi yetişkin kök hücrelerin bazı sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem sağlayabileceğini fark ettiğimizde aklımıza geldi. Miyogenez düzenleyici myo D'yi aşırı eksprese eden tamoksifen ile indüklenebilir bir vektör ile dönüştürülen kararlı bir hücre hattı oluşturarak başlayın.% 1 matri jel ile kapladıktan ve orta tohumla yıkadıktan sonra, dönüştürülmüş hücrelerle bir plaka ve büyüme ortamında 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler bir veya iki gün içinde birleşmelidir.

Hazır olduklarında, büyüme ortamına hidroksi tamoksifen için bir mikromolar ekleyin. 24 saat sonra, büyüme ortamını farklılaşma ile değiştirin. Hidroksi tamoksifen için bir mikromolar ile desteklenmiş ortam.

Kültürleri miyotüp oluşumu açısından günlük olarak inceleyin ve ortamın yarısını taze farklılaşma ile değiştirin. Kültürler hazır olduğunda her geçen gün orta. Transplantasyon tahlillerinde kullanılırlar.

Burada, intramüsküler transplantasyon için aşılama derecesini belirlemek için distrofik ve immün yetmezlikli fareler kullanılmaktadır. Hayvanları transplantasyondan 24 saat önce tamoksifen enjeksiyonu ile ön işlemden geçirin. Hücreler ayrıca bir gece önce büyüme ortamına eklenen tamoksifen ile ön işleme tabi tutulmalıdır.

Transplantasyon gününde, tripsin, sayım ve santrifüj ile ayrılan hücreler, hücreleri Resus'tan önce PBS'de bir kez yıkar, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'yi 30 mikrolitre başına altı hücreye eğilimli bir konsantrasyona kadar askıya alır. Hayvanı uyuşturduktan ve cildi sterilize ettikten sonra, tibialis ön kasını bulun. Proksimal tendonun giriş noktasını belirleyin ve iğneyi yerleştirin.

Bu noktanın iki milimetre altına koyun. İğnenin beş milimetresini tibiaya göre 15 derecelik bir eğimle sokun ve iğneyi geri çekerken hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin. Şırıngayı, iğnenin iki milimetresi hala kasın içindeyken boşaltın.

Hücre süspansiyonunun iğne izinden dökülmesini önlemek için iğneyi kastan çıkarırken dikkatli olun. Aynı prosedürleri takiben, gastro anemi enjeksiyonları, Aşil tendonu ve kuadrisepsin miyotendonöz bileşkesinin iki milimetre yukarısına gerçekleştirilir. Femme enjeksiyonları, intra arteriyel transplantasyon için distal tendonun iki milimetre yukarısından yapılır.

Hayvanları ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi tamoksifen ile ön işlemden geçirin. Transplantasyon için hazır olduğunda, hücreler santrifüjlemeden önce filtrelenmeleri dışında daha önce gösterildiği gibi hazırlanır. Peletleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyon dağılımının görselleştirilmesine izin vermek için %10 patent mavisi boya ekleyin.

Şırıngadaki hücreleri dikkatlice yeniden askıya alın ve enjeksiyondan önce tüm hava kabarcıklarını çıkarın, anesteziden sonra alanı gösterildiği gibi tıraş edin ve dezenfekte edin, beş ila yedi milimetrelik bir kesi yapın ve femur demeti lokalize edin. Demetleri forseps ile kaplayan bağ fasyasını nazikçe çıkarın. Daha sonra, aralarına bir forseps ucunu nazikçe sokarak ve deliği kademeli olarak genişleterek femoral ven ve siniri arterden dikkatlice ayırın.

Femoral ven kırılgandır. Femoral arterden ayrılması sırasında sıkıştırmamaya dikkat edin. Ayrıldıktan sonra, forsepsin bir ucuyla arteri kaldırın ve diğer ucuyla arteri sıkıştırın.

30 G'lik bir iğne ile arteri delin ve saniyede yaklaşık beş mikrolitrelik bir infüzyon hızında klemplenmiş alanın aşağısına 50 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. Uzuvdaki kan akışını yeniden sağlamak için iğneyi ve forsepsleri arterden yavaşça çıkarın. Kanamayı önlemek için steril gazlı bezle baskı uygulayın ve/veya gerektiği gibi koterize edin.

Patent mavisi boya, doğru yerleştirilmiş bir enjeksiyonun anında tanınmasını sağlar, doğru şekilde enjekte edilirse tüm uzuv hızla açık maviye döner, yarayı diker ve hayvanları iyileşene kadar izler. Üç gün boyunca analjezi uygulayın ve yarayı inceleyin Tedavi edilen farelerin motor kapasitesindeki günlük değişiklikler koşu bandı testi ile değerlendirilir. Temel ölçümler tedaviden yaklaşık bir ay önce başlar ve test edilen her hayvanın iyileşmesini değerlendirmek için kullanılır.

İlk adım, testten önce hayvanları egzersize alıştırmaktır. Bunu yapmak için, koşu bandını 10 dakika boyunca dakikada altı metre hıza ayarlayın. Bu işlemi bir hafta boyunca her gün tekrarlayın.

Cihaza aşina olduklarında, eğimi 10 dereceye ayarlayın ve hayvanları koşu bandı şeritlerine yerleştirin. Koşu bandını dakikada altı metrelik bir başlangıç hızıyla açın. Egzersize başlamak istemeyen herhangi bir hayvanı nazikçe dürtün.

Ardından, zamanlayıcıyı başlatın ve bir hayvan dinlenme alanında beş saniyeden fazla yatarken hızı her iki dakikada bir dakikada iki metre artırın. Koşu bandını yeniden takmaya çalışmadan, egzersizin yeniden başlatılmasını teşvik etmek için bir çubukla hafifçe dokunun. Bir fare, koşu bandını yeniden çalıştırmaya çalışmadan dinlenme alanında beş saniyeden fazla yattığında yorgun olarak kabul edilir.

Her beş saniyede bir, art arda üç mekanik uyaran dizisinden sonra, her bir hayvanın performansını kaydedin ve ölçümleri haftada bir veya her 10 günde bir en az üç kez tekrarlayın. Hücre naklinden iki hafta sonra başlar. Testten sonra tedavi edilen farelerde aynı işlemi tekrarlayın.

Performanstaki değişiklikleri değerlendirmek için taban çizgisiyle karşılaştırmaları kullanın. Dört hidroksi tamoksifen uygulamasından 48 saat sonra, kültürde miyo DER ile transdüksiyona uğrayan maddeler içinde miyo de pozitif çekirdekler tanımlanabilir. Burada görüldüğü gibi.

Bir hafta sonra, hücreler birleşir ve çok çekirdekli miyo tüplerine farklılaşır. Akut kas yaralanmasının aynalama modeline kas içi olarak nakledildiğinde, öğeler koşu bandından elde edilen doku rejenerasyon sonuçlarına katkıda bulunur. Egzersiz tolerans testi, transplantasyondan sonra tedavi edilen farelerin motor kapasitesinde iyileşmeyi göstermektedir.

Nakledilen kasların ex vivo analizleri, IMS'nin konakçı dokuya kolonizasyon derecesini temsil eden GFP pozitif alanları gösterir, böylece donör hücrelerin distrofik kas içine greftlendiğini gösterir. Daha da önemlisi, nakledilen hücreler in vivo olarak yeni iskelet myo lifleri oluşturarak farklılaşabilir. Bu örnek, genetik olarak düzeltilmiş ims'den alfa Sarco glikan boş kayma bej farelerine alfa Sarco glikan ekspresyonunu göstermektedir.

Massen tri krom boyama, tedavi edilen kasta fibrotik doku miktarında bir azalma olduğunu ortaya çıkardı. Bu prosedürü takiben, FreeWheel testi gibi yöntemlerde, istemli motor kapasite, lif kırılganlığı ve özgül kuvvetteki iyileşme ile ilgili ek soruları yanıtlamak için Evan Blue Diop testi ve tek lif veya tüm kas mekaniği gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro, in vivo ve ex vivo testler kullanılarak IPS hücre kaynaklı miyojenik progenitörlerin kas farklılaşma yeteneğini ve greftman potansiyelini ve fonksiyonel etkinliğini nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.