Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı membran alt bölmelerini ayırmak ve bunların farklı protein kompozisyonlarını incelemektir. Bu işlem, uygulamaların ayırt edilebilmesini sağlamak amacıyla hücrelerin farklı koşullar altında stabil izotoplarla işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olan kütle spektrometrik analizde, iki farklı uygulamadan gelen hücre materyalleri karıştırılır; bu sayede ortak işlemleme sağlanır ve örnekler arası varyasyon azaltılır.

Ardından, plazma membranı alt bölmeleri sükroz gradyan santrifüjle saflaştırılır ve steril zengin ve steril fakir alt bölmelere ayrılır. Kantitatif kütle spektrometresi verilerine dayanarak, farklı uygulamalar altında alt bölmelerdeki farklı protein bolluklarını gösteren gradyan santrifüj sonuçları elde edilir. Bu protokolün Western blotting gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, binlerce proteinin alt bölme dağılımını kantitatif olarak kaydedebilmemiz ve böylece sinyal süreçleri için yeni adaylar keşfedebilmemizdir.

İki fazlı bir sistemin saflaştırılması öğrenilmesi zor bir işlem olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bunun nedeni, işlemin çok sayıda adım içermesi ve hassas kontrol ile titiz bir uygulama gerektirmesidir. Bu yöntem, membran süreçlerinin düzenleyicileri olarak yeni protein adaylarını keşfederek sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Metin protokolünde açıklandığı şekilde, işaretlenmiş ve işaretlenmemiş arabidopsis ana hücre süspansiyon kültürlerini büyüterek başlayın.

Sıvı azot içindeki yaklaşık bir litrelik yedi günlük hücre süspansiyon kültürlerinden elde edilen homojenize hücreler, taze ağırlığa göre eşit miktarlarda işaretli ve işaretlenmemiş dondurulmuş hücre kültürleri ile bir beherde karıştırılır ve iki hacim tampon H eklenir; ardından beher hemen bir çalkalayıcıya yerleştirilerek materyal eriyene ve buz kristalleri kaybolana kadar çalkalanır. Homojenat, tek katmanlı bir ayna bezinden süzülerek 250 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarılır; numuneler tampon H ile dengelendikten sonra 10.000 G'de sekiz dakika boyunca santrifüjlenir. Santrifüj işleminin ardından, süpernatan yaklaşık 32 mililitre hacmindeki önceden soğutulmuş ultrasantrifüj tüplerine yüklenir.

Numuneleri tampon çözelti ile dengeledikten sonra, mikrozomları 100, 000 Gs'de ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Santrifüj işleminden sonra, çözünür proteinler içeren üst fazı (süpernatant) uzaklaştırın. Bu fraksiyonun küçük bir miktarı, daha sonraki protein çöktürme işlemleri ve çözünür proteinlerin analizi için saklanabilir. Her numunenin membran peletini, metin protokolünde açıklandığı şekilde ilgili miktardaki tampon R içinde yeniden süspande edin ve U bir iki faz sisteminin üzerine yükleyin.

Altı gramlık iki fazlı sistem kullanılıyorsa, yeniden süspanse edilmiş membran peletinden tam olarak iki gramı U2 tüpüne yükleyin ve örnek süspansiyonu için kullanılanla aynı hacimde saf tampon R ekleyin. U1 ve U2 tüplerini, saniyede yaklaşık bir kez olacak şekilde 30 kez ters yüz ederek yavaşça karıştırın; ardından örnekleri 1500 Gs'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, U2'deki üst fazı uzaklaştırın. Aynı parametreleri kullanarak santrifüj işlemini tekrarlamadan önce, U1'deki üst fazı U2'ye aktarın. Sonrasında, U2'deki üst fazı ultrasantrifüj tüplerine aktarın, beş hacim tampon R ile seyreltip iyice karıştırın ve örnekleri 200.000 Gs'de ve 4 °C'de bir saat boyunca santrifüjleyin.

Son olarak, yeniden kullanma aşamasına geçin. Deterjan dirençli membranların izolasyonu için membran peletini az miktarda T ve E tamponu içerisinde süspande edin. Plazma membran fraksiyonunun konsantrasyonunu Bradford testi ile kontrol ettikten sonra, plazma membran fraksiyonuna, ağırlıkça deterjan-protein oranı 13 ile 15 arasında ve nihai deterjan konsantrasyonu %0,5 ile %1 arasında olacak şekilde Triton X 100 ekleyin. Örnekleri yaklaşık 100 RPM'de ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca çalkalayın.

Ardından, 1,8 molar nihai sakkaroz konsantrasyonu elde etmek için, işlem görmüş plazma membranının bir hacmine üç hacim 2,4 molar sakkaroz ekleyin. İlgili sakkaroz çözeltilerini 1,8 molar fraksiyonun üzerine yükleyerek ultrasantrifüj tüplerinde sakkaroz gradyanını hazırlayın. Örnekleri 250.000 ×g'de ve 4 °C'de 18 saat boyunca santrifüjleyin. 0,15 molar ve 1,4 molar sakkaroz arayüzeyinde sütlü bir halka şeklinde görülebilen düşük yoğunluklu bandın bozulmasını önlemek için ultrasantrifüj tüplerini rotordan dikkatlice çıkarın.

Bazen hiçbir şey görülmeyebilir, ancak deterjanla dirençli protein fraksiyonu hala oradadır. Gradyanın üst kısmından 0,75 mililitre hacminde bir fraksiyon; interfaz halkasının üzerindeki yaklaşık 1,5 mililitrelik hacimleri kapsayan iki ve üç numaralı fraksiyonları ve interfaz halkasının altındaki 0,5 mililitreyi uzaklaştırın.

Deterjan dirençli membran fraksiyonunu temsil eder. Bu fraksiyonları 15 mililitrelik Falcon tüplerine toplayın. Dokuz ve 10 numaralı fraksiyonlar deterjan çözünür membran fraksiyonunu içerir ve karşılaştırma amacıyla bunlar da toplanabilir.

Deterjana dirençli fraksiyondan protein ekstraksiyonuna başlamak için, toplanan fraksiyonlara dört hacim metanol ekleyin ve iyice vorteksleyin. Ardından, tekrar iyice vortekslemeden önce bir hacim kloroform ekleyin. Son olarak, üç hacim su ekleyip iyice vorteksleyin ve örnekleri 2000 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Bir masaüstü santrifüj kullanarak, ara fazdaki protein tabakasının üzerindeki sulu fazı uzaklaştırın. Ardından, üç hacim metanol ekleyin ve vorteksleyin. Çözeltide sindirime hazırlık yapmak için peleti çekmeden önce S süpernatanını tamamen uzaklaştırın.

Örneği, altı molar üre ve iki molar tiyol pH sekiz (kısaltılmış adıyla UTU) içeren küçük bir hacimde çözerek in-solüsyon sindirime başlayın. Örnekle uyumlu olan mümkün olan en düşük hacmi kullanın. Örnekler santrifüj edildikten ve metin protokolünde açıklandığı şekilde sindirim işlemi gerçekleştirildikten sonra, örneği dört hacim 10 milimolar tris HCL pH sekiz ile seyreltin.

Ardından, örnek proteininin her 50 µg'ı için bir µL tripsin ekleyin, oda sıcaklığında 700 RPM'de sürekli çalkalayarak gece boyunca inkübe edin ve örnekleri 4.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, yaklaşık 1/10 hacminde %2 trifloroasetik asit ekleyerek örnekleri pH 2'ye ulaşacak şekilde %0,2 TFA nihai konsantrasyonuna asitlendirin. C18 stage tip'leri hazırlamak için, bir mour disc C18'i tek kullanımlık plastik Petri kabı gibi düz ve temiz bir yüzeye yerleştirin.

1,5 milimetre çapında küt uçlu bir hipodermik iğne kullanarak küçük bir disk çıkartın. Disk iğneye yapışır ve bir pipet ucuna aktarılabilir. Diski iğneden dışarı itin ve iğnenin iç kısmına uygun bir eritilmiş silika parçası veya boru uydurması kullanarak pipet ucunun daralan kısmına sabitleyin; hazırlanan sahne ucunun üzerine 50 µL çözelti B yerleştirerek bir C 18 sahne ucunu koşullandırın.

Ucu santrifüjde 2000 RPM hızında iki dakika boyunca döndürün. Bir masaüstü santrifüjde, sahne ucunu 100 µL çözelti a kullanarak dengeleyin. Ucu masaüstü santrifüjde 5,000 ×g hızında döndürün. Dengeleme ve döndürme işlemlerini tekrarlayın.

Örneği, diskin bulunduğu pipet ucuna dikkatlice pipetleyerek diske yükleyin. Örnek hacminin tamamı C 18 diskten geçene kadar uçları santrifüjde döndürün. Aşama uçlarını 100 µL çözelti A ile iki kez yıkayın. Uçları santrifüjde döndürdükten sonra, EIT'yi 40 µL çözelti B içeren taze bir 1,5 mL reaksiyon tüpüne toplayın ve santrifüjleyin.

Örneği ideal koşullar altında speed vac cihazında tekrar konsantre edin. Dehidrasyon işlemini, geriye yaklaşık bir veya iki µL sıvı kaldığında durdurun. Son adım olarak, örneğe dokuz µL Resus süspansiyon çözeltisi ekleyerek nihai hacmi tamamlayın ve kütle spektrometrisi analizi için mikrotitrasyon plağına aktarın.

Plazma membran proteinlerinin zenginleşmesi; plazma membranın küçük elokalarının, fraksiyonların ve iki fazlı sistemin alt fazındaki proteinlerin proteomik analizi ile gösterilebilir. Alt faz, hücrenin iç membranlarını içerir. Örneğin, reseptör kinaz proteinleri gibi tipik olarak bilinen plazma membran proteinleri, plazma membran fraksiyonunda yüksek bolluk, iç membranları içeren alt faz fraksiyonunda ise düşük bolluk göstermiştir.

Buna karşılık, endoplazmik retikulumun bilinen proteinleri iç membran fraksiyonunda yüksek bollukta görülmüş ve plazma membran fraksiyonunda gözlemlenmemiştir. Deterjana dirençli membran fraksiyonlarının müteakip zenginleştirilmesi, ideal durumlarda, düşük yoğunluklu membran veziküllerinden oluşan süt rengi bir halkanın oluşmasıyla sonuçlanacaktır. Beklendiği üzere, remn proteininin en yüksek bolluğu, tüp yüksekliğinin yaklaşık beşte birinde, deterjan dirençli membran veya DRM fraksiyonlarında bulunmuştur.

Aksine, membran mikro alanlarında bulunmayan proteinler, örneğin ABC taşıyıcıları, DRM fraksiyonunda artmış bir bolluk göstermezler. Ayrıca, ATP sentaz F₀ kompleksinden gelen bir mitokondriyal protein ve 60S ribozomundan gelen bir ribozomal protein gibi tipik kontaminanlar da DRM fraksiyonunda zenginleşmiş bir bolluk sergilemezler. Kütle spektrometrik analiz sonrası hala minimal miktarlar tespit edilebilse de, işaretli ve işaretlenmemiş hücre kültürlerinin plazma membran fraksiyonlarındaki protein fosforilasyon durumlarına ait protein bolluk oranları kantitatif olarak ayırt edilebilmektedir.

MS nicelik belirleme penceresinden elde edilen tipik sonuçlar, tanımlanan peptidlerin çoğu için bire bir iyon yoğunluk oranı göstermelidir. İyon yoğunluk oranı bire birden önemli ölçüde sapan peptidlerin, işaretli ve işaretlenmemiş hücre kültürü arasında farklı şekilde regüle olduğu kabul edilir ve bunlar uygulanan tedaviden etkilenen proteinlerle eşleştirilmek üzere aday olarak belirlenir. Başarılı metabolik işaretlemenin iyi bir kalite kontrolü, burada gösterildiği gibi, hem işaretli hem de işaretlenmemiş peptid versiyonlarının nano HPLC ayrımında tek bir pik olarak birleşmesidir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, ekstraksiyonun başlangıcından numunelerin kütle spektrometresine yüklenmesine kadar olan süreç üç günde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, spesifik hedef proteinlerin bolluğuyla ilgili ek soruları yanıtlamak için Western Belt gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu nedenle, bu videoyu izledikten sonra, stabil izotopla işaretlenmiş bitki hücre kültürlerinin nasıl karıştırılacağı, iki fazlı sistem üzerinden plazma membran saflaştırmasının nasıl gerçekleştirileceği ve steril zengin membran alt bölmelerinin steril fakir olanlardan nasıl ayrılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalıyız.