Name: Duyusal nöronlar izolasyonu Aplysia californica Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin Aplysia duyusal nöron izolasyonu için enzimatik sindirme ve patch clamp tekniklerini kullanarak. Bu yöntem, nöronal sinyal mekanizmalarını ve iyon akımlarını incelemek için değerli veriler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH P40 OD010952, Korein Vakfı, SLC Miami Arkadaş Grubu bir üniversite ve ATK bir Maytag burs tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar minnetle Aplysia yanı sıra Lauren Simonitis ve bir rakam için mikroskop sağlanan Hannah Peck, için Ulusal Kaynak personeli kabul.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Gün 1, tartmak ve hayvan uyutmak. <ol><li> Bir 30 g kg-1 hayvan tartılır. Izotonik MgCl: 1:1 Uygulama deniz suyu 5-10 hayvan hacimlerde anestezisi. Bu ekli airstone ile elektrikli akvaryum hava pompası gibi havalandırma ile 1 saat 6H 2 0. </li></ol></li><li> Diseksiyon malzemeleri hazırlayın. <ol><li> Bu kumaş işaretçilerine olarak paslanmaz çelik düz iğne, temiz diseksiyon tepsi birleştirin. + Penisilin / streptomisin (P / S).; Birkaç Petri yapay deniz suyu içeren yemekler (Tablo 1 ve 3&#39;e bakınız ASW) monte </li><li> Hazır bir düşük güç mikroskop var. Temiz diseksiyon aletleri gibi nervürlü burun ve ince cerrahi forseps gibi, hazır, ve ince ve büyük cerrahi makas var. Kullanmadan önce% 70 isopropol alkol ile araçlar Sprey ve kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Diseksiyon tepsi konumu hayvan. <ol><li> Diseksiyon tepsiye pozisyonu hayvan ventral tarafı. Pin hayvangövde duvarı ve parapodial sınırları, ancak dorsal yüzeyini ortaya çıkaracak şekilde, yükleme ve baş önlemek ve genital oluğun kenarları boyunca </li><li> Yavaş dönen soğuk musluk suyunda dorsal yüzeyi durulayın. Genital kanal boyunca bir sıkmak şişe ve başın üstünden 70% isopropol alkol hafif akışı uygulayın. </li></ol></li><li> Ilk kesi yapmak. <ol><li> Sığ bir kırpma sırasında düşük güç mikroskop kullanarak (bkz. Tablo 2) ve genital oluk ön kabuk marjı kaynaklanan noktaya gözlemlemek için yansıyan ışık, gerili, yivli-burun forseps Bu kökenli solunda doku kat ile tutun sadece iyi açılı makas ile genital oluk sağındaki vücut duvarının düzgün, düzlük tüm yol boyunca delik. </li><li> Hemolimf bazen ile karın ganglion ve mide taşıyan, delikten dökmek için dikkat edilmelidir. </li></ol></li><li> Kesi genişletin. <ol><li> Inci genişletmek için büyük makas kullanınöne rhinophores arasında bir noktaya e kesi, alt bıçak ile yukarı çekerken bağırsak nicklemek önlemek için. Iç organların kesi dışarı dökmek için gözlenecektir. </li></ol></li><li> Ganglionlar çıkarın. <ol><li> Tepsiyi yeniden konumlandırmak ve baş bölgeye mikroskop yönlendirmesi. </li><li> Temiz forseps ve ince makas kullanarak, bir noktada bir grup olarak plevra-pedalı ve serebral ganglionlar kaldırmak için yemek borusu etrafında bir halka içine baş ganglionlar oluşturan sinirler kesilmesinin tarafından baş ganglionlar çıkarın. </li><li> Yemek borusu ventral tarafına yapışır yanak ganglion çıkarın. </li><li> Bu ganglion gelen 4 büyük sinir bağlaçlar bu konuda keserek karın ganglion çıkarın. </li></ol></li><li> Ilgi ganglion izole edin. <ol><li> Ganglion en az çapına eşit olan her bir ilgi gangliyon bağlanmış bağlayıcılar arasında bir uzunluğa bırakarak, ayrı baş ganglion Trim; bu enzim geciktirir aşırı sindirimBir sonraki adım, ilgi hücre. </li><li> ASW 2 durulama + temiz forseps ile durulama arasında hareket P / S, ile her hedef ganglion koyun. </li><li> PVC hücreleri hedef, doğru pedal hemiganglion bağlı sağ plevral hemiganglion bırakın ve benzer şekilde sol pedal hemiganglion bağlı sol plevral hemiganglion bırakın. </li><li> Istenmeyen ganglionlar ve kabul edilen araştırma uygulama göre hayvanın geri kalanını atın. </li></ol></li><li> Enzimatik ganglionlar sindirmek. <ol><li> Her gangliyon için, 3.75 mg dispaz, 1 mg hiyaluronidaz ve DSH ml&#39;si başına 0.3 gr kollajenaz tip XI oluşan enzim çözeltisi, 1 ml hazırlanması 15 ml polipropilen konik tüpe +, P / S. </li><li> Yeri enzim çözüm ganglionlar durulanır ve kapağını sıkıca takın. Yaklaşık 23 saat boyunca 13-5 gece boyunca yavaş bir hızda döner çalkalayıcı üzerinde (bakınız Tablo 2) üzerinde yan tüp yerleştirin ° C (oda sıcaklığı). </li></ol></li><li> Hazırlayınkültür kaplarına. <ol><li> Mikrodiseksiyon önce (Gün 2), poli-D-lisin (PDL) kaplı bir doku kültürü kaputu kültür yemekleri hazırlamak. ~ 25 dakika süre ile, 35 mm tabağın merkezine ~ 0.5 ml PDL (0.2 mg / ml &#39;lik steril su) ilave edilir. </li><li> Steril su ile 3x PDL durulayın. Kurumasını bekleyin. Kalıpları UV-sterilize. </li></ol></li><li> 2. Gün nöronlar izole edin. <ol><li> PDL kaplı ve başka kuru bir tabak içinde medya bir ada oluşturmak için ASW + P / S yaklaşık 0.5 ml steril UV vardı 35 mm yemekleri ortasına doldurun. Bu doku kültürü kaputu dışında, bankta yapılabilir. Bir çanak hemiganglion kaynaklanan her hücre küme için hazırlanmalıdır. </li><li> Sylgard kaplama tarafından yapılan ve (bkz. Tablo 3) işaretçilerine ve sondalar olarak kullanılmak üzere çeşitli boyutlarda ince diseksiyon işaretçilerine ile donatılmış bir 5 mm derin diseksiyon yüzey, kür hazır bir 100 mm çapında diseksiyon çanak var. ASW ile + P / S, ve son olarak fi sonra,% 70 isopropol alkol ile bu çanak durulayınbu ASW + P / S ile ll </li></ol></li><li> Sindirilmiş gangliyon mikrodiseksiyon hazırlayın. <ol><li> Diseksiyon çanak içine sindirmek plevra-pedalı ve yanak ganglion içeren enzim çözeltisi dökün. </li><li> Yansıyan ışık altında siyah bir yüzeye karşı mikroskop sahnede çanak yerleştirin. </li><li> Ekli bağ dokusu kullanarak, her plevra-pedal hemiganglion sırt tarafında yukarı aşağı pin. Yumuşak doku ve germe hoşgörüsüz olacaktır. </li></ol></li><li> PVC nöronlar Microdissect. <ol><li> Temiz ince forseps 2 çift kullanarak ve bir prob olarak forseps bir çift bir ince diseksiyon iğne tutan, bir plevral hemiganglion gelen PVC hücreleri izole. Enzim sindirim kaldırıldı veya PVC küme kapsayan bağ dokusu kılıf dağıldığına, henüz hücreleri birbirine yapışır olacak. </li><li> Pedal-plevral bağ 18 bu hücreleri ayırmak için prob kullanın, sonra diseksiyon altına hücre küme düşmesine izinçanak. </li></ol></li><li> Kültür çanak nöronlar aktarın. <ol><li> Yavaşça hava kabarcıkları tanıtan önlemek için dikkatli olmak, sonra bir kültür çanak medya ada haline yavaş yavaş dağıtım, biraz yangın cilalı tek cam Pasteur pipet ucu içine küme emerek hazırlanmış bir 35 mm kültür çanak hücre küme aktarın pipet içine. Ayrı bir kültür çanak içine diğer hemiganglion ve yerin PVC küme izolasyonu tekrarlayın. </li></ol></li><li> BSC nöronlar Microdissect ve transfer. <ol><li> Ilgi hücreleri yedek dikkatle, kadar yanak ganglion ventral yan Pin. Yanak ganglion 10 2 BSC hücre kümeleri ile adım 1.12 tekrarlayın. </li><li> PVC kümeleri içeren BSC kümeleri ve 2 yemekleri içeren 2 yemekler: PVC ve BSC nöronların izolasyonu nöron kümeleri içeren 4 kültür kaplarına üretecek. Ganglion geri kalanı atın ve 100 mm diseksiyon çanak kenara koyun. </li></ol></li><li> Dissochücre kümeleri iate. <ol><li> Düşük güç mikroskop sahnede hücreleri içeren bir kültür çanak yerleştirin ve kapağı çıkarın. </li><li> Hafifçe forseps düzenlenen bir ince diseksiyon iğne ile hücre küme bitişik kültür çanak alt getirerek PVC küme ayırmak. Flicking rağmen plastik bir nokta kazmak için çalışıyor gibi çanak alt plastik içine iğne ucu kazma olduğunu. Plastik sürtünme pin nokta serbest bıraktığında, bir perküsyon dalga ayrı hücrelerin yakındaki yığın tatili vasıtasıyla üretilmektedir. </li><li> 5-10 sinema neredeyse tamamen hücreleri ayırmak için gerekli, ancak hücreleri mekanik sırf tarafından yok edilmesi diye çok fazla fiske yerine hücre küçük kümeler bırakmak daha iyidir olabilir. </li><li> Kapak ve diğer kültür yemekleri ile tekrar değiştirin. </li></ol></li><li> Hücre kültürleri saklayın. <ol><li> Ayrışmış hücreleri ile merkezlerinde medya adaları içeren kültür kaplarına yerleştirinBöyle bir 150 x 25 mm yuvarlak plastik Petri kabı gibi hava sirkülasyonu, izin verir, ve 17 ° C bir kuluçka set Bu yemeğin yer geniş bir kap </li><li> Odasında nem kaynağı olarak su açık bir tabak yükleyin. Gece rahatsız bırakın. Hücreler çanak merkezinde poli-D-lizin kaplama uyacaktır. </li></ol></li><li> Sel kültür kaplarına. <ol><li> Gün 3, yavaşça ASW 2.5 ml yemekleri sel + P / S Incelemek ve ters bir hücre kültürü mikroskop kullanarak hücreleri saymak. 17 ° C inkübatör saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Elektrofizyoloji Yöntemi (örnein, Sakmann ve Neher, 1995), pek çok metinde 16 tarif edilmiştir sıkıştırma standardı yamadır. Bu protokol hücreleri üzerinde ≤ 100 pF kapasitans, ya da hücreler &lt;Protokolün gün 3 ve 4 sırasında 60 mikron çapında çalışacaktır. Süreçleri olmadan Hücreler kayıt için uygun olan. Aşağıdaki özel de İngiltere&#39;deiyonları geçerlidir: <ol><li> Büyük hücreleri β = 0.1 olarak ayarlanmış Axopatch 200B amplifikatör yapılandırma ayarı ile yerleştirilebilir. Çok büyük akımlar aktivasyonu hücre gerilim kelepçe kaçmaya neden olabilir. ASW çözümleri (geçirimsiz bir N-metil-D-glukamin klorid ile ikame edilmiş NaCl örneğin bir kısmı) tuz içeriğinden ikame edilen bütün bir hücre akım genliği azaltmak için kullanılabilir. </li><li> Bir pipet çekici üzerine çekilir ve KCl ve diğer tuzlar 450 mm (bkz. Tablo 1) oluşan hücre içi çözelti (ICS) ile yarım toprakla fiber dolgulu borosilikat yama pipetler uygundur ve yaklaşık 0.5-1 Mohms bir dirence sahip olmalıdır. Belirli iyonik akımların izolasyonu isteniyorsa, örneğin, Na + K akımları, K +, bu çözüm yokluğunda akımları gibi Cs + gibi diğer iyonlar ile değiştirilebilir. Cl - daha doğal bir ICS isteniyorsa geçirgen olmayan anyon ile ICS değiştirilmesi de garanti edilir9. </li><li> Hücreler oda sıcaklığında mümkün&gt; 1 saat süren kayıtları ile sağlamdır. Kayıt kültüründe 24-48 saat için gelen, gün 3 ve protokolün 4 en uygunudur. 48 saat sonra, güçlük, hücre yüzeyi üzerinde bir glikokaliksin hazırlanması belki de, gigaohm conta oluşturan, ve proses sonucudur neden olduğu alan kıskaç sorunlar vardır. Hücreler &lt;14 d içinde tamamlanabilir gibi toksikoloji olmayan yama kelepçe çalışmalar, için, yararlı, ancak vardır. </li><li> ASW ve diğer çözümler ağırlık beslenen çözüm cihaz vasıtasıyla dağıtılabilmesidir için, hem de hücre içi çözelti süzülür gereken bir gigaohm conta oluşumuna müdahale ince parçacıkların ortadan kaldırmak için 0.2 mikron Acrodisk filtre (Tablo 3), bir şırınga monte edilebilir. </li><li> Örneğin, D-aspartat (D-Asp) agonist kullanıldığında Duyarsızlaştırma oluşur, bu nedenle agonist, uygulamalar arasında, 1-2 dakika ~ tavsiye edilir. Tersine, Potentiation genellikle hızlı tekrar başvurunun ile görülmektedirL-glutamat (L-Glu), agonist katyon. </li><li> L-Glu gibi agonist aktif akımları Picospritzer pipet ile agonistleri uygulayarak incelenebilir. Bu pipet yama pipet ile aynı çekilir ve ASW agonisti içerir. Bu pipet ucu yerçekimi beslenen çözüm cihaz çıkışı boru altında konumlandırılmış ve çıkış boru (Şekil 2F) bir 45 ° açıyla, agonist hızla hücreden kalmamis olur ve duyarsızlaştırma en aza inecektir zaman. Agonist pipet 90 ° &#39;lik ya da daha fazla yama pipet&#39; lik bir açı oluşturması gerekir. </li></ol>

<ol><li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl%28-%29+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP%28B%29+and+FMRFamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li>
<li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li>
<li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Behav%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li>
<li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2B+and+Ca2%2B+currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li>
<li>Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li>
<li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+in+Aplysia%3A+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li>
<li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia%3A+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%2C+New%22%5BJournal%5D)">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li>
<li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Cellular+basis+of+behavior%22">Cellular basis of behavior</a>. , W.H. Freeman. New York. (1976).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+nerves+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li>
<li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li>
<li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transcriptome+of+Aplysia%3A+neuronal+compartments+and+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li>
<li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).</li>
<li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+Ca2%2B+current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li>
<li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture%3A+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li>
<li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li>
<li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Ca%282%2B%29-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li>
<li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li>
<li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355(2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Ayrışma teknikleri glia ve diğer tanımlanamayan hücrelerin az sayıda serpiştirilmiş 50-100 izole nöron içeren duyusal nöron kültürleri verim burada açıklanan. Protokolde en kritik adımlar ganglionlar enzim çözeltisi kalır zaman vardır, ve, tek tek hücrelere küme bozmaya sindirilmiş hücre kümeleri ayrışma Flicking. Enzim sindirimi (adım 1.8) mevcut sıcaklığında optimize edilmesi gerekmektedir. 23 yavaş sallayarak ° C, 13 saat BSC kümeleri while15 saat PVC kümeleri için optimum sonucu sindirim için yeterlidir. Kültür çana...

Deniz opistobranch yumuşakça, Aplysia, onlarca yıl için yararlı bir nörobiyolojik model olmuştur. Bu iyi alışkanlık ve klasik koşullanma 7, 8 modeli olarak bilinir. Bu modelde öğrenme ve hafıza ile ilgili çalışmalar o Arvid Carlsson ve Paul Greengard 10 ile paylaşılan bir ödül, Eric R. Kandel için 2000 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandı. Düşük hazırlıkları elektrik kayıtları içeren çalışmalar, hangi bu omurgasız ve sinir sisteminin unsurları sinirleri ile hayvan disseke ve kasların tutunduğu, Aplysia bireysel nöronların rollerini aydınlatmak yardımcı olmuştur bıraktı. Aplysia öğrenme teşkil hassas moleküler mekanizmaların belirlenmesi Ancak, çoğu zaman bireysel donör hayvanlardan tek tek elde edilen başka bir teknik, uzun vadeli bir duyusal nöron eş-kültür ve bir motonöron, istihdam ve kültür çanak 21 bir sinaps oluşturmak için izin . Biz ve diğerleri 1, 3, 6, 14, 15, 16 nöronlar sözde homojen nöron kümeleri ayrışmış kısa vadeli kültürleri yapmak için uzun vadeli deneylerde de kendi dayanıklılık gibi bu modelde hedeflenebilir tespit hangi ile kolaylığı istismar var hangi biz yama kelepçe yapılandırmasında gerilim kelepçe altında iyonik akımların çalışma. Birçok Aplysia nöronlar uzun süreli deneysel manipülasyonlar için zaman tanımak için sıkma yama tekrar mermi stand up. Bu teknik, örneğin, karın ganglion Nörosekretor torba hücreleri ve ayrışma burada açıklandığı plevral ve yanak ganglion sensor nöronları olarak nöronlar için yararlıdır, fakat çok büyük nöronlar&gt; 60 mikron gibi L7 gibi çapı ya da R2 karın ganglion. Biz başka bir yerde tanımlanan duyusal-motor nöron ko-kültür aksine, bizim kültürlerde Aplysia serum istihdam yok. Bu işlem kullanılarak elde edilen en nöronlar t işlemleri olmadan olacako tüm hücre voltajı kayıt kolaylaştırmak kültüründe ilk 48 saat,, ama sonra filiz ve besin ve / veya büyüme faktörlerinin eksikliği nedeniyle ölme önce yaklaşık 14 gün boyunca akson ve diğer işlemler ayrıntılı olacaktır. Bu teknik, bukkal ve plevral gangliyon fizyolojik olarak belgelenmiş bölgelerinden tabak başına 50-100 nöronlarının birincil kültürleri üretir. Bu protokol, araştırmacılar, çeşitli deneysel hayvan başına çoğaltır gerektiren deneylerde tek hücre fizyolojisinin açıdan araştırılması için de faydalıdıdr. Bu eşleştirilmiş tedavi ve kontrol kültürlerinden çalışmalar yarar izin, sol ve sağ hemiganglia içine hedef hücrelerin anatomik ayrılması nedeniyle kültürlerin bir eş üretir. Protokol yanak ganglion yanak S kümesi (BSC) nöronlar ve plevral ganglion plevral ventrocaudal (PVC) nöronlar hedefliyor. Bu hücreler, tüm hücre voltaj kayıtları ve görüntüleme Robus için uygun bir boyuttadırt glutamaterjik yanıtları. Açıklanan metodoloji Aplysia&#39;nın sinir sisteminde en gangliyonların birleşmeleri için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Yapay deniz suyu ASW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli(</td><td>mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl<alt>2</alt> (2 H<alt>2</alt>O), 5MgCl<alt>2</alt> (6H<alt>2</alt>O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td></tr><tr><td>Hücre içi çözelti</td><td>Sigma</td><td>çeşitli(</td><td>mM): 450 KCl, 2.9 CaCl<alt>2</alt> (2 H<alt>2</alt>O), 2.5 MgCl<alt>2</alt> (6 H<alt>2</alt>O), 5 Na<alt>2</alt>ATP, 10 EGTA ve 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin 1: 100</td><td>Lonzo Walkersville, Inc.</td>'de ASW'ye eklendi.<td>17-603E</td><td>5.000 Ünite/ml penisilin artı 5.000 mg/ml streptomisin</td></tr><tr><td>Nötral dispas II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10165859001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>hyaluronidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>kollajenaz tipi XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamat (L-Glu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>49601-100G</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Aspartat (D-ASP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11200-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N-metil-D-aspartat (NMDA)</td> <td>Biomol</td><td>100002-268</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ASP</td><td>Sigma</td><td>A6683-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>alfa-amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol-propiyonik asit (AMPA)</td> <td>Sigma</td><td>A6816-5MG</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glu R antagonistleri</td><td>çeşitli</td><td>çeşitli</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ağar</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>kynurenate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-fosfonopentanoik asit (NMDAR antagonisti)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Klorlama çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>çeşitli</td><td>25 g FeCl3 + 25 ml konsantre HCl + 50 ml H2O</td></tr><tr><td>Sylgard silikon 2 parçalı polimer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>Küçük diseksiyon tabakları için pin çıkış yüzeyi sağlar</td></tr><tr><td>Diseksiyonlar için 0-40x zoom büyütme mikroskobu</td><td>Wild</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 Watt Fiber Optik Aydınlatıcı</td> Florida <td>TQ FOI-150</td> <td>Mikrooptikleri&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RotoMix 50800 orbital karıştırıcı</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4x, 20x (isteğe bağlı) ve 40x objektifli Nikon Diaphot ters faz kontrast mikroskobu</td><td>SR Research Ltd.</td><td>Eyelink II</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tektronix dijital osiloskop</td><td>SR Araştırma Ltd.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pClamp 10 veri toplama ve analiz yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Windows XP veya üzeri işletim sistemine sahip PC</td><td>Çözümleri</td><td></td><td>Katı hal sabit diskli (80 GB) ve düşük gürültülü monitörlere sahip Thinkserver</td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi P87 mikropipet çektirme</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1-1000 pF kapasitans kompanzasyon aralığına sahip Axon Instruments Axopatch 200B kelepçe amplifikatörü; ön yükseltici</td><td>Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Axopatch 200B preamplifikatör Moleküler Cihazlar için Axon aletleri elektrot tutucu tertibatı</td><td>, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1200 A/D dönüştürücü</td><td>Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CAnbsp</td><td></td><td>;</td></tr><tr><td>Picospritzer, N2 tarafından desteklenmektedir basınç ve süre için ayarlanabilir</td><td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TMC Micro-G Titreşim izolasyon tablası</td><td>Ametek</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td></td><td></td><td>özel üretim</td></tr><tr><td>Burleigh Piezoelektrik Kapaklı Mikromanipülatörler</td><td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td><td></td><td>şu anda PCS-5000; -6000 serisi +</td></tr><tr><td>Narishige M-152 manuel manipülatörleri monte eder (perfüzyon sistemi ve picospritzer için)</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filament pipet camı, 1,5 mm OD, 0,84 mm İç Çap -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3 inç uzunluk</td><td></td><td></td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>Ag / AgCl yarım hücre</td><td>WPI</td><td>EP4</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpleri, 35-2097 BD Falcon* Santrifüj Tüpleri</td><td>VWRSP</td><td>21008-918&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Açılı Makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15006-09</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumostar İnce forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Falcon Doku Kültürü Kapları</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 150 x 25 mm doku kültürü kapları; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td><td>ayrıca sylgard</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>WPI</td><td>SYL184</td> <td>ile</td></tr> küçük diseksiyon kapları haline getirilebilir;<tr><td>hayvan diseksiyon tepsisi</td><td>çeşitli</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpleri, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>6 delikli yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemi için</td></tr><tr><td>Vida deliği uçlu alüminyum klipsler</td><td>Hırdavatçı</td><td></td><td>Perfüzyon sistemi için</td></tr><tr><td>23 gauge iğneler (manuel olarak törpüleme noktaları)</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Perfüzyon sistemi için</td></tr><tr><td>Polietilen boru 0.022 "ID x 0.042" OD; 427411</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>İçin perfüzyon sistemi</td></tr><tr><td>H-7 pipet standı/tutucusu microcap perfüzyon dizisi için</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>Perfüzyon sistemi için</td></tr><tr><td>tek yönlü valfler</td><td></td><td></td><td>Perfüzyon sistemi için</td></tr><tr><td>Drummond Microcaps 1 & mu; l</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Perfüzyon sistemi için</td></tr><tr><td>emme için 18 gauge iğne (dosyalanmış noktalar)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>Cole Parmer</td><td>4.27436E + 11</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>ince diseksiyon pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-20&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>kılcal borular</td><td>Kimble 71900-100</td><td></td><td>ateşle cilalanmış ve Bunsen brülör alevinde U şeklinde ve ECS modelleme kil el sanatları mağazasında %3 agar ile doldurulmuş</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzole zemin banyolu</td><td></td><td></td> mikroskop aşaması için çanak tutucu <td>Özel üretim</td></tr><tr><td>pastör pipetleri</td><td>VWRSP</td><td>14672-412&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>pipet ampulleri</td><td>VWRSP</td><td>53283-911&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Acrodisk Şırınga Filtreleri</td><td>VWRSP</td><td>28144-040&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>kalın cidarlı 1,5 mm çaplı borosilikat filament cam</td><td>WPI</td><td>1B150F-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Yüksek saflıkta nitrojen silindiri ve çatallanma regülatörü</td><td></td><td></td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tablolar 1-3. Reaktif, Malzeme ve Ekipman Listeleri.</td></tr></tbody></table>

duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; aplysia californica</em&gt; glutamaterjik akımlar patch kelepçe kayıtlar için

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Deniz gastropod yumuşakça Aplysia californica öğrenme ve hafıza çalışmaları özellikle öneme sahip, sinir sistemi fonksiyonu bir model olarak bir saygıdeğer bir geçmişi vardır. Bu tür çalışmalar için tipik hazırlıkları duyusal ve motor nöronlar minimal disseke hayvan değişmeden kalır, ya da bireysel duyusal ve motor nöronlar bir teknik olarak nöronal ko-kültür edildiği olanlardır. Daha az görülen sözde homojen nöronların küçük kümeler kısa vadeli kültüründe tek hücrelere ayrışmış olduğu izole nöronal hazırlıktır. Bu tür izole edilmiş hücreler yama kıskaç teknikleri ve bu iletkenlikleri hedef modülasyonu kullanılarak iyon akımlarının biyofiziksel karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür kültürlerde hazırlanması için bir protokol açıklanmıştır. Protokol plevra ve yanak ganglion kolayca tanımlanabilir glutamaterjik duyu nöronlarının yararlanır ve bunların ayrışma ve minimum bakım açıklar iserumsuz birkaç gün boyunca N kültürü.

Bu protokolde hedeflenen gangliyon içindeki duyu nöronlarının yerle BSC ile PVC nöronlar Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. BSC nöronlar bukkal gangliyonu, sağlam ganglion (Şekil 1A) &#39;de bukkal kütle uzağa dönük yüzeyinin ventral tarafta simetrik 2 oval kümeler halinde bulunmaktadır. PVC nöronlar merkez ekseni (Şekil 1B) doğru plevral ganglion dorsal yüzeyi etrafında saran ikili, V şeklinde kümeler oluştururlar. Sağ veya sol küme olaylar yaklaşık 1% bireysel hayvanlard...

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif<em&gt; Aplysia</em&gt; Anestezi sonrası, kısa süreli doku kültürü için nöronlar, ve yama kelepçe tekniği ile tek bir hücre iyon akımlarının kayıtların izolasyon.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Bu prosedürün genel amacı, kısa süreli kültürde plegianın münferit duyusal nöronlarını izole etmektir. Patch clamp çalışmaları için bu işlem, öncelikle anestezi uygulanmış bir hayvandan duyusal hücreleri içeren gangliyonların diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, gangliyonların bir enzim solüsyonunda gece boyunca sindirilmesidir.Ardından, sindirilmiş ganglionlardan ilgili duyusal nöronlar disseke edilir. Son adım, hazırlanan kültür kaplarının gece boyunca kültür substratına tutunması için ayrıştırılmasıdır. Nihayetinde, bu nöronlarda eksprese edilen voltaj ve agonist kapılı iyon akımlarını incelemek için voltaj klempleme kullanılır.Bu tekniğin in situ hücre kaydı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronların izole edilmesinin tek elektrotlu voltaj klemp tekniğinin kullanımına olanak tanımasıdır. Bu yöntem, öğrenme ve hafıza ile ilişkili nörotransmitterler tarafından aktive edilen iyon akımlarının kimliği gibi, elma nörobiyolojisi alanındaki temel bilinmezliklerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, nöronların enzimatik sindirime ve kültür kaplarına yayılmaya karşı duyarlılığı nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, öğrenme ve hafıza için önemli olan belirli glutamaterjik akımların, bu yöntemin sağladığı hücre izolasyonundan fayda sağlayacağını fark ettiğimizde edindik. Prosedürü uygulamalı olarak gösterecek olanlar lisansüstü öğrenciler Andy Kesel ve Justin Greer'dır. Bu prosedüre, anestezi uygulanmış bir hayvanı diseksiyon tepsisine ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirerek başlayın.Hayvanı, genital oluğun dorsal yüzeyini açığa çıkarmak için kuyruk ve baş bölgesinden kaçınarak, vücut duvarının kenarlarından ve para-poal sınırlardan iğneleyin. Ardından, dorsal yüzeyi yavaş akan soğuk musluk suyuyla durulayın. Daha sonra, bir sıkma şişesi yardımıyla genital oluk boyunca ve başın üst kısmına hafif bir 70% isopropyl alkol akımı uygulayın.İlk kesiyi yapmak için, genital oluğun tabanının solundaki bir doku kıvrımını rib burun pensiyle sıkıca tutarken, genital oluğun hemen sağındaki vücut duvarının düz ve pürüzsüz alanında ince açılı makaslarla tamamen içinden geçecek şekilde sığ bir delik açın. Ardından, bağırsaklara zarar vermemek için alt bıçağı yukarı doğru çekerek kesiyi anterior yönde ROF dördüncüleri arasındaki bir noktaya kadar genişletin. Daha sonra, pleural petal ve serebral gangilyumları bir grup halinde çıkarmak için, baş gangilyumlarını oluşturan sinirlerin özofagus etrafında bir halka oluşturduğu noktayı keserek temiz pens ve ince makas yardımıyla baş gangilyumlarını çıkarın.Ardından, özofagusun ventral tarafına yapışık olan bukkal ganglionu çıkarın. İlgilenilen ganglionları izole etmek için, her bir hedef gangliona, ganglion çapına eşit veya ondan daha uzun bir bağ dokusu parçası kalacak şekilde baş ganglionlarını birbirinden ayırın. Bu işlem, bir sonraki adımda enzimin hedef hücreleri aşırı sindirmesini engelleyecektir.Ardından, her bir hedef ganglionu, penisilin streptomisin içeren yapay deniz suyu kaplarında iki kez yıkayın. PVC hücrelerini hedefliyorsanız, sağ pleural hemi ganglionu sağ petal hemi ganglionuna bağlı bırakın ve benzer şekilde, sol plural hemi ganglionu sol petal hemi ganglionuna bağlı bırakın. Daha sonra yıkanmış ganglionları enzim çözeltisine yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatın.Ardından, tüpü bir döner çalkalayıcıya yan şekilde yerleştirin ve yaklaşık 23 °C'de, gece boyunca 13 ila 15 saat süreyle düşük hıza ayarlayın. Bu prosedürde, iç kısımda bir medya adası oluşturmak için PDL kaplı ve UV sterilizasyonlu 35 mm'lik kapların merkezini yaklaşık 0,5 mm yapay deniz suyu ve penisilin streptomisin ile doldurun. Sindirilmiş gangliyonların mikrodiseksiyonunu hazırlamak için, sindirilmiş pleural, pedal ve bukkal gangliyonları içeren enzim çözeltisini diseksiyon kabına dökün.Ardından, kabı mikroskobun tablasına, yansımalı ışık altında siyah bir yüzeye gelecek şekilde yerleştirin. Daha sonra, ekli bağ dokusunu kullanarak her bir plevral petal hemi ganglionu, dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde iğneyle sabitleyin; dokular yumuşak olacaktır ve gerilmeye karşı hassastır. Ardından, bir çift pensle ince bir diseksiyon iğnesini prob olarak tutarken, diğer pens çiftini kullanarak bir plevral hemi gangliondan PVC hücrelerini izole edin.Bu hücreleri taç yaprak bağ dokusundan ayırmak için probu kullanın. Ardından hücre kümesinin diseksiyon kabının dibine düşmesini sağlayın. Hücre kümesini, hafifçe ateşle pürüzsüzleştirilmiş tek kullanımlık cam pastör pipetinin ucuna nazikçe çekerek hazırlanmış 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın.Ardından, pipete hava kabarcığı kaçırmamaya dikkat ederek, karışımı bir kültür kabındaki besiyeri adacığına yavaşça dağıtın. Diğer hemi ganglionun PVC kümesinin izolasyon işlemini tekrarlayın ve bunu ayrı bir kültür kabına yerleştirin. Burada, sağ plevral hemi ganglionun V şeklindeki koyu turuncu PVC hücre kümesinin bir fotomikrografı yer almaktadır.BSC nöronlarını diseke etmek için, öncelikle bukkal ganglionu ventral tarafı yukarı gelecek şekilde, ilgili hücrelere zarar vermemeye dikkat ederek iğneleyin. Ardından, ince bir diseksiyon iğnesini problardan biri olarak kullanırken, iki çift pens yardımıyla BSC hücrelerini izole edin.Ardından, bu hücreleri bukkal gangliondan ayırmak için probu kullanın. Daha sonra hücrelerin diseksiyon kabının dibine çökmesini bekleyin. Bu fotomikrograf, bukkal ganglionun glutamaterjik hücrelerinin konumunu göstermektedir.BSC nöronları, koyu turuncu renklerinden ayırt edilebilir. PVC ve BSC nöronlarının izolasyonu, nöron kümeleri içeren dört kültür kabı üretir. Bunların ikisi BSC kümelerini, diğer ikisi ise PVC kümelerini içerir.Ganglionların geri kalanını atın ve hücre kümelerini ayrıştırmak için 100 milimetrelik diseksiyon kabını kenara ayırın. Hücre içeren bir kültür kabını düşük büyütmeli mikroskobun tablasına yerleştirin ve kapağını çıkarın. Kültür kabının hücre kümesinin komşuluğundaki alt kısmına hafifçe vurun.Pensle tutulan ince bir diseksiyon iğnesiyle, hücrelerin tamamen ayrıştırılması için beş ila 10 kez hafifçe vurmak gerekebilir. Ardından aynı işlemi diğer kültür kapları için tekrarlayın. Sonrasında, ayrıştırılmış hücrelerin bulunduğu medya adacıklarını içeren kültür kaplarını, 150 x 25 mm'lik yuvarlak plastik bir Petri kabı gibi hava sirkülasyonuna izin veren geniş bir kaba yerleştirin.Ve bu kabı 17 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, nem kaynağı olarak hazneye açık bir kap su koyun ve hücrelerin kabın merkezindeki polilizin kaplamaya tutunmalarını sağlamak için onları gece boyunca rahatsız etmeden bırakın. Ertesi gün, kapları nazikçe 2,5 mL yapay deniz suyu ve penisilin streptomisin ile doldurun; hücreleri ters hücre kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin ve sayın.Kültürde bir gün geçirdikten sonraki canlı BSC nöronları buradadır; BSC hücreleri genellikle 40 mikron ile PVC hücrelerinden daha büyüktür. Burada, bir haftalık kültür sonrası uzantı büyümesi gösteren canlı bir PVC nöronu görülmektedir. Burada, AL glutamat pulsuna yanıt olarak sodyum iyonları tarafından taşınan bir eksitatuar akım ve burada da D aspartata yanıt olarak oluşan bir akım yer almaktadır.NMDA tarafından aktive edilen akımlar, genellikle diğer agonistler tarafından aktive edilenlerden daha düşük genliktedir. Bu prosedürü uygularken, disosiasyon sırasında nöronlara zarar vermemeye dikkat etmek önemlidir. Bu tekniğin bir avantajı, her gangliondan iki kültür oluşturmasıdır; böylece bunlardan biri, deneysel kültür için eşleşmiş kontrol olarak kullanılabilir.Bu teknik, plegia veya diğer deniz omurgasızlarından primer nöron kültürleri oluşturmak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ganglionların enzimatik sindirimi ve ardından ilgili hücrelerin dikkatli bir şekilde disosiyasyonu yoluyla plegia duyusal nöronlarının nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

Elektrot İmalat ve İmplantasyon Aplysia californica Bozulmamış, Serbestçe Behaving Hayvanlar Çok kanallı Sinir ve Kas Kayıtlar

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini...

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

Biz ekstraselüler kayıt ve sinirler, kaslar ve bireysel tespit nöronlardan uyarmak için bir teknik...

An<em&gt; In Vitro</emFizyolojik Hareketleri Besleme Motor Programlar ortaya çıkartılması ve kayıt için&gt; Hazırlık<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu video, bir beyin dilimini sabitleyerek, pipetleri tüm hücre konfigürasyonlarını elde etmek için konumlandırarak ve postsinaptik yanıtları kaydetmek için presinaptik nöronları uyararak sinaptik bağlantıları haritalama prosedürünü gösterir, böylece nöronal bağlantıyı aydınlatır.

Akut Beyin Dilimlerinde Nöronal Bağlantıların Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kaydı

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

Presinaptik salım yüz zarında Ca2+ akımlarının kaydedilmesi, Ca2+ girişinin ve nörotransmitter salınımının kesin olarak anlaşılmasının anahtarıdır. Fonksiyonel izole retikülospinal aksonlar veren lamprey omuriliğinin akut bir ayrışmasını sunuyoruz ve bu da bireysel presinaptik terminallerin serbest bırakma yüz zarından doğrudan kayda izin veriyor.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Akut beyin dilimlerinde sinaptik olarak eşleşmiş nöronların yama-kelepçe kayıtları ve eş zamanlı hücre içi biyosit dolumu, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili bir analizine izin verir. Bu protokolün amacı, nöronal mikro devrelerden elektrofizyolojik kaydın temel teknik adımlarını ve bunların müteakip morfolojik analizlerini tanımlamaktır.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Öğrenin Aplysia duyusal nöron izolasyonu için enzimatik sindirme ve patch clamp tekniklerini kullanarak. Bu yöntem, nöronal sinyal mekanizmalarını ve iyon akımlarını incelemek için değerli veriler sağlar.

Duyusal nöronlar izolasyonu

Daha fazla video keşfet