Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Bu prosedürün genel amacı, bir kristalizasyon tarama deneyinden elde edilen protein kristallerinin sayısını ve kırınım kalitesini iyileştirmektir. Bunu yapmak için, ilgilenilen bir hedef protein kullanılarak kurulan mevcut bir protein kristalizasyon tarama deneyinden kristalli veya çökeltilmiş bir malzeme tanımlanır, kristalin veya çökeltilmiş malzeme hasat edilir ve daha sonra bir kristal tohum stoğu oluşturmak için kullanılır. Daha sonra, hem ilgilenilen hedef proteini hem de kristal tohumları içeren bir dizi kristalizasyon ekranı kurulur.

Son olarak, tohumlanmış kristalizasyon ekranları kristal oluşumu açısından izlenir ve herhangi bir yeni protein kristali karakterize edilir. Sonuç olarak, bu prosedürün uygulanması, kristalizasyon tarama deneylerinden elde edilen protein kristallerinin sayısının, boyutunun ve kırınım kalitesinin artmasına neden olabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere, örneğin geleneksel mikro tohumlama veya makro tohumlamaya göre temel avantajları, hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmesi, yüksek oranda ölçeklenebilir olması ve diğer tohumlama yöntemlerine göre önemli ölçüde daha fazla kristalleşme alanı örneklemesidir.

Bu tekniğin bir diğer avantajı, tohum stoğu üretimi için yüksek kaliteli kristal başlangıç materyali kullanılmasını gerektirmemesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, kristal toplama ve manipülasyon adımları sırasında önemli derecede el becerisi gerektiğinden mücadele edeceklerdir. Rastgele matris mikro tohumlamanın diğer kristal tohumlama yöntemlerinden önemli ölçüde sapması nedeniyle yöntemin kritik olup olmadığının görsel gösterimi.

Bu yöntemin incelikleri başarının anahtarıdır ve bunların bir kısmı metin biçiminde doğru bir şekilde iletişim kurmak zordur. Bu işleme sadece bir binoküler mikroskop veya kristal görüntüleme sistemi kullanarak oturmuş bir kristalizasyon tepsisi ile başlayın. Tepsiyi ilk hafta boyunca her gün inceleyin.

Daha sonra haftada bir kez kristal boyutunu not edin. Daha fazla büyümeye dair bir kanıt olmadığı anda, kristal malzemenin hasat edileceği tepsiden bir veya daha fazla uygun kuyu seçin. Tohum stoğu üretimi için ince iğneler, spial ışıklar, mikro kristaller ve düzensiz, kötü şekillendirilmiş kristaller dahil olmak üzere herhangi bir malzeme kullanılabilir.

Daha eski materyalin kısmen çapraz bağlı olma olasılığı daha yüksektir ve tohumlama deneylerinde kullanım için daha az uygundur. Hasat gününde, bir cam mera pipetinden yuvarlak bir prob yapmak için iltihaplı bir çörek kullanın. Bunu yapmak için, pipeti yumuşayana kadar ortasına yakın bir yerde ısıtın.

Daha sonra hızlı bir şekilde alevden çıkarın ve uçlarını ayırarak dışarı çekin. Camı yaklaşık 0,25 milimetre olduğu noktada 0,25 milimetreden daha küçük bir çapa kadar çekmeyi hedefleyin. Camı kırın ve kırılan ucu kısa bir süre aleve daldırın.

Sonunda yaklaşık 0,75 milimetre çapında bir yarım küre cam oluşana kadar bu işlemi tekrarlayın. Buz üzerine tohum boncuğu içeren 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpü yerleştirin. Ardından, seçilen kristalizasyon tepsisini açın.

Eh, 24 iyi asılı damla tepsisi için. Kapak fişini çıkarmak için bir cımbız kullanın. Ardından kapak kızağını ters çevirin ve sabit, temiz bir yüzeye yerleştirin.

96 iyi oturan damla tepsisi için. Seçilen kuyunun üstündeki plastik tavan Filminin etrafını kesmek için bir neşter kullanın ve ardından tavan filminin eksize edilen kısmını bir cımbız kullanarak çıkarın. Rezervuar çözeltisinden 50 mikrolitre çıkarın ve bu sıvıyı tohum boncuğunu içeren mikro santrifüj tüpüne aktarın, böylece tüpün buz üzerinde kalmasını sağlayın Bu prosedürün en zor yönü tohum stoğunun hazırlanmasıdır.

Bunu tam olarak açıklandığı gibi ve mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirmek önemlidir. Numuneyi mikroskop altında incelerken tohum materyalini prob ile iyice ezmeye ve mümkün olduğunca geri kazanmaya özen gösterin. Kapaktaki kristalleri iyice ezmek için daha önce hazırlanmış cam probu kullanın.

Kayma damlaları. Küçük kristallerin iyice ezilmesi birkaç dakika sürebilir. Ezilmesi kolay kristaller çapraz bağlı değildir ve tuz kristalleri değildir.

Tuz kristalleri, ezildiklerinde duyulabilen ve hissedilebilen belirgin bir tık sesi üretir. Daha sonra, rezervuar çözeltisinin beş mikrolitresini tohum boncuk tüpünden çıkarın ve bir oturma damlası deneyi için eşdeğer alt kuyuya aktarın veya hasat edilecek kristalli materyali içeren bir asılı damla deneyi için kapak kayması. Alt kuyunun mümkün olduğunca çoğunu yeniden süspanse etmek veya kayma içeriğini kapatmak için bu sıvıyı beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Süspansiyonu tohum boncuk tüpüne geri koyun ve bu adımı iki kez daha tekrarlayın, mümkün olduğunca fazla kristal malzemenin hasat edildiğinden emin olun. Vorteks, tohum boncuğu iki dakika boyunca, tüpü buz üzerinde soğutmak için her 30 saniyede bir durur. 1.5, mililitrelik tüplerde rezervuar çözeltisi içerir.

Rezervuar çözeltisindeki tohum stoğunu her aşamada dört ila 10 kat seyrelterek arşivlemek için bir seyreltme serisi yapın. Tohum, stok ve seyreltmeler hemen kullanılmayacaksa, saklamak için eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derece dondurucuya 10 ila 20 mikrolitre alikot koyun. Dondurulduktan sonra, tohum stokları ihtiyaç duyulana kadar süresiz olarak saklanabilir.

RMMS kristalizasyon taraması, asılı damla buhar difüzyon yöntemini kullanan 24 kuyulu tepsi veya oturan damla buhar difüzyon yöntemini kullanan 96 kuyulu tepsi kullanılarak gerçekleştirilebilir. MMS taramamızı 24 iyi asılı damla tepsisinde gerçekleştirmek için, her koşuldan 300 mikrolitreyi 10 mililitredeki 96 koşuluk kristalizasyon süzgecinden manuel olarak aktarmak için bir pipet kullanın. Her 4 24 kuyucuğuna tek tüp formatı.

Her 300 mikrolitrelik rezervuardan iyi yağlanmış kristalizasyon tepsileri, her kristalleşme koşulundan bir mikrolitreyi, hem ön hem de arka koruyucu destek şeritlerinin çıkarıldığı karşılık gelen bir plastik örtü kızağının yüzeyine aktarır. Kapak fişine bir mikrolitre protein solüsyonu, ardından 0,5 mikrolitre kristal tohum suyu ekleyin. RMMS'nin ilk turunda, seyreltilmiş tohum stoğu çözeltisinin kullanılmaması önemlidir.

Tohum konsantrasyonu ne kadar büyük olursa, o kadar fazla kristalleşme isabeti elde edilir. Her bir kapak kızağını, sıvı damlası aşağı bakacak şekilde ters çevirin ve uygun olanın üzerine yerleştirin. Kapak kızağı üzerine aşağı doğru bastırın, tavan yağını sıkıştırın ve güvenli bir sızdırmazlık oluşturun.

96 damlanın tümü oluşturulduktan sonra, tepsiyi saklama için dört ila 18 santigrat derece arasında bir inkübatöre veya sabit sıcaklıktaki odaya aktarın. MMS taramamızı 96'da gerçekleştirmek için, iyi oturan damla tepsileri. Bir kristalizasyon robotu veya sekiz kanallı bir pipet kullanarak, her koşuldan 20 ila 50 mikrolitreyi derin kuyu bloğu formatındaki 96 koşulu kristalizasyon süzgecinden kristalizasyon tepsisinin karşılık gelen her bir kuyucuğuna aktarın.

Daha sonra, 1.0 mikrolitre protein çözeltisi, 1.0 mikrolitre kristalleşme koşulu ve 0.5 mikrolitre tohum stoğunu damlalara aktarın. Tepsiyi şeffaf bir tavan tabakası kullanarak kapatın ve dört ila 18 santigrat derece veya sabit sıcaklıkta bir inkübatöre aktarın Depolama deneyleri için oda, kuruluşu takip eden beş gün boyunca her 24 saatte bir ve daha sonra her yedi günde bir dürbün mikroskobu veya kristal görüntüleme sistemi kullanılarak dört haftaya kadar kontrol edilmelidir. Her bir alt kuyuyu veya kapak kızağını sırayla inceleyin ve kristal oluşumuna dair herhangi bir kanıt kaydedin.

MMS tarama deneylerimizden elde edilen sonuçları ED olmayan ekranlardan elde edilen sonuçlarla karşılaştırın ve farklılıkları kaydedin. Gözlemlenen birden fazla RMMS döngüsü gerekebilir. Optimum kırınımdan önce, ek döngüler için kaliteli kristaller üretilir.

Kuyu başına kristal sayısını kontrol etmek için arşivlenmiş seyreltilmiş tohum stoklarını gerektiği gibi kullanın. RMMS'nin etkinliğini göstermek. Her protein 3 96 koşulu için kına, beyaz lizozim ve sığır karaciğeri katalizörünün kristalizasyonuna tarama yöntemleri uygulandı.

Kristalizasyon ekranları J-C-S-G-P-A-C-T ve Morpheus kullanıldı. Daha sonra beş gün sonra, kristalin materyalin büyümesini desteklediği bulunan her tepsiden tek bir koşul seçildi ve tohum stoğu üretimi için kullanıldı. Beş gün sonra, kristalizasyon tepsileri incelendi ve kristalli damla sayısı kaydedildi.

Bu şekil, bu deneyden elde edilen sonuçları özetlemekte ve tavuk yumurtası akı lizozimi için kantitatif analiz sağlamaktadır. Bu proteine RMMS uygulandığında, ED olmayan tepsilere kıyasla kristalleşme başarı oranında dört ila on kat artış gözlendi. Özellikle, sığır karaciğeri katalazı için, Morpheus ekranındaki sadece tek bir koşulun, RMMS kullanımını takiben tanımlanan 55 koşulla karşılaştırıldığında kristaller verdiği bulundu.

Ayrıca, tüm vakalarda sırasıyla JCSG ve PACT ekranları kullanılarak sığır karaciğer kutuları kristalizasyonunun başarı oranında üç ve iki kat artış olmuştur ve kullanılan kristalizasyon süzgecinden bağımsız olarak, MMS taramamız, RMMS olmayan taramadan önemli ölçüde daha fazla toplam kristal sayısı vermiştir. MMS'imizin, protein kristalizasyon tarama deneylerinin başarı oranını önemli ölçüde artırabilecek basit ama güçlü bir yaklaşım olduğu sonucuna vardık. Bu videoyu izledikten sonra, kristalin materyalin tanımlanması ve hasat edilmesinden kristal tohum stoğunun hazırlanmasına ve son olarak tohumlanmış kristalizasyonun kurulmasına kadar rastgele bir mikro tohumlu matris tarama deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Sıvı işleme robotu kullanılarak veya elle yapılan deneyler için yaklaşık üç saat içinde gerçekleştirilen rastgele matris mikro tohumlama tarama deneyleri için. Bu prosedürü denerken, tohumlanmış tüm kristalizasyon eleklerinin depolamadan önce iyi bir şekilde kapatıldığından emin olmak önemlidir.