Name: Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Öğrenin, rastgele mikrotohum matris taraması ile protein kristalleşme başarı oranını artırma yöntemini. Bu teknik, kristal kalitesini ve difraksiyon verimini iyileştirirken optimizasyon ihtiyacını azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma BBSRC (BB/1006478/1) tarafından kısmen finanse edildi. PRR Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu almıştır.

1.. Stratejik Düşünceler <ol><li> Mikro-deney için kullanılan tohum kristallerinin seçimi deney nesnesine bağlı olarak değişecektir. Bir projenin başında o kristal optimizasyonu için alternatif başlangıç ​​noktaları sağlayabilir çeşitli kristalleşme hit bulmak için yararlı olur. iyi kalitede kristaller rahatsızlık ya da aşağıdaki sistem denge döner nükleasyon burada bölgede yani faz şeması, metastabl bölgede büyümeye daha muhtemel olduğu için RMMler büyük ölçüde kristal optimizasyonu için olan ihtiyacı azaltır. Bu nedenle ilk kristalleri kısa sürede (ilk kristaller büyüyen durdurmak gibi, daha doğru, ya da) elde edilir gibi rutin kısa sürede RMMler kullanmanızı öneririz. </li><li> RMMler ilk tur için, tohum stok mümkün olduğu kadar çok kristalli bir malzeme ile yapılmalıdır. Sadece bir iyi varsa o kristalleri içeren veya kristaller küçük, eğer birden fazla tekrarlar kurmak yararlı olabilirkristallerin arzını artırmak için (tohumlama olmadan) orijinal hit. Bununla birlikte, pek çok farklı isabet elde edilir ise, tohum kristalleri çeşitli koşullarda hasat edilir ve bir arada karıştırılabilir. </li><li> Faz ayrılmasını önlemek için, yüksek tuz koşullarında yetiştirilen kristalleri yüksek PEG koşullarında yetiştirilen kristallerinden ayrı hasat edilmelidir. Birkaç kuyulardan kristaller karıştırılır ise, tuz kristalleri vermek üzere daha az olasıdır bir çözelti, tohum süspansiyonu için seçilmelidir. Örneğin, fosfat, sülfat, kalsiyum ve magnezyum, yüksek dozlarda kaçınılmalıdır. </li><li> Daha sonra bir projede bu kırınım geliştirmek çiftli kristaller önlemek ve ligandları bağlamak için uygun olan kristaller elde etmek için farklı bir birim hücre kristaller aramak için önemli olabilir. Bu aşamada (örneğin, en iyi kırılmaktadırlar olanlar) sadece en uygun tohum kristalleri stok yapmak için kullanılmalıdır. Mikro-Bazen tekrarlanan mermi nerede sadece &quot;iyi, gerekli&quot;Kristalleri, bir sonraki tur için ekim stok yapmak için kullanılır. Mümkünse,&quot; PEG 3000 gibi nötr &quot;yeni bir kristal çökelti temas teşvik etmek ve yüksek olarak kararsız olabilir kompleksleri kristalize için tohum kristalleri askıya almak için kullanılmalıdır -tuz çözeltileri 12. </li><li> Tek bir kristalleşme durumdur kullanılan klasik mikro-deneyleri, umut verici bir durum ve sonraki optimizasyonu sırasında kimlik aşağıdaki sıklıkla faydalıdır. Bu damla başına kristallerinin istenen sayısını elde etmek için tohum stok sulandırmak için genellikle gereklidir. (Artan seyreltme tohum stoklarının bir dizi bir kristalizasyon eklenir) bir &quot;birleştirici&quot; mikro-deney tohum stoku optimum seyreltme oranını bulmak için hızlı bir yöntemdir. Bu yaklaşım, aşağıda tarif edilmektedir. </li></ol> 2. Tohum Stok hazırlanması <ol><li> Bir Bunsen alev kullanarak cam Pasteur pipeti bir yuvarlak cam soruşturma yapmak. <ol><li> Yumuşak hale gelinceye kadar ortasına yakın pipet ısıtın, sonra hızla alev çıkarın ve uçlarını ayrı çekerek dışarı çizin. Aşağı 0.25 mm altında bir çapa cam çekmek için hedefliyoruz. </li><li> Bu yaklaşık 0.25 mm olan ve kısa bir süre alev içine kırık ucu dalma noktasında cam kırın. ~ 0.75 mm&#39;lik bir çapa ucunda oluşturulur ile cam bir hemisfer kadar bu işlemi tekrar edin. Uygun şekilde 0.01-1.0 mm ölçekte katı nesnelerin çarpıcı için boyutlandırılır ve bir kristalizasyon tepsi alt oyuk ya da lamel plastik yüzeyine zarar vermez gibi bu prob, kristal halinde malzemeyi kırmak için yararlıdır. Kristalleri, cam ve plastik arasında sıkışıp çünkü büyük sondalar (~ 1.0 mm) daha etkili küçük kristaller ezmek olabilir. </li></ol></li><li> Buz üzerinde tohum Boncuk ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> Binoküler mikroskop veya kristal görüntüleme sistemi kullanılarak önceden belirlenmiş kristalleşme tepsisini kontrol edin ve bir veya daha fazla ap seçintohum stok üretimi için kristal malzeme hasat için hangi tepsiden kuyuları propriate. Herhangi bir malzeme ince iğneler, kürecikler, mikro kristalleri ve düzensiz, kötü biçimli kristallerden de dahil olmak üzere kullanılabilir. Büyük malzeme, kısmen çapraz bağlanmış olması daha muhtemel olduğu gibi tohum stoku, böylece tohum deneylerde kullanım için uygunluğu azaltarak, en kısa sürede mümkün olan en kristaller artan durdurduktan sonra yapılmalıdır. Herhangi bir şüphe hasat edilecek olan kristal malzeme iyi bir UV floresan mikroskop ya da görüntüleme sistemi, açılmadan önceki kullanılarak görüntülenebilir, veya, kristalin malzemenin bir in-situ X-ışını kırınım analizi için tabi tutulabilir bir tuzu ya da protein olup olmadığı konusunda varsa Tepsiye. UV ışınlaması altında floresan olacak eski yaklaşım protein kristalleri kullanırken, tuz kristalleri renksiz görünür. </li><li> Iyi seçilmiş kristalleşme tepsisini açın. 96-çevresinde de üst plastik sızdırmazlık levha kesti damla tepsilerini oturan için usi iyi seçilmişBir neşter bıçak ng. 24-iyi asılı damla tepsiler için bir cımbız kullanarak lamel kaldırmak. Lamel ters çevirin ve istikrarlı temiz bir yüzey üzerine koyun. Rezervuar çözeltisi 50 ul çıkarın ve boru boyunca buz üzerinde kalmasını sağlamak tohum boncuk içeren mikrosantrifüj tüpüne bu sıvıyı transfer. </li><li> İyice mikroskop altında sonuçlarını görüntüleme, bölüm 2.1 &#39;de hazırlanan cam sonda kullanılarak, subwell (96 oyuklu tepsi), lamel (24-çukurlu tabla) damla olarak kristaller ezmek. Küçük kristaller iyice ezmek için birkaç dakika sürebilir. Bu adım, deneyci kristaller tuz kristalleri olduğu da ezmek için kolaydır ve bu yüzden, çapraz bağlantılı değildir, ve bu kontrol sağlar. Tuz kristalleri duydum ve onlar ezilmiş zaman hissedilebilir bir ayırt edici tıklayın üretirler. Kristaller taze malzeme elde edilir ve kullanılır denemek ezmek için sert ve zor ise. </li><li> Tohum Boncuk tüp ve t rezervuar çözeltisi 5 ul kaldırransfer eşdeğer alt oyuk (damla deneyi oturma) ya da lamel (asılı damla deneyi) hasat edilecek olan, kristal halinde malzemeyi ihtiva eden için. Mümkün olan en alt iyi ya da lamel içindekiler kadar yeniden askıya almak için, bu sıvı yukarı ve aşağı 5-6 kez Pipet. Tohum Boncuk tüp süspansiyon dönmek ve çok kristalli malzeme mümkün olduğunca hasat sağlayarak, iki kez daha bu adımı tekrarlayın. </li><li> Buz üzerinde tüp soğutmak için her 30 saniye durma, iki dakika için tohum boncuk vorteksleyin. </li><li> 4, her bir aşamada 10 kadar bir faktör ile çözeltide tohum stok seyreltilmesi, bir seyreltme serisi yapın. Tipik olarak, çok fazla kristal seyreltilmemiş tohum stokları kullanılıyorsa elde edilen, yani oyuk başına kristallerinin sayısını kontrol etmek için seyreltilmiş tohum stokları kullanmak olacaktır. Tohumların konsantrasyonu daha fazla kristalleşme vurur elde edilecek beri RMMler ilk turda, o tohum stok solüsyonu sulandırmak için önemli değildir. </li><li> Bu derhal kullanılmak üzere değilserilmesi, bir -20 ° C tohum stok süspansiyonu ile sulandırılmış tohum stokları transferi, ya da depolama için -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya. Küçük hacimli alikotları örneğin, 10-20 ul, bu malzemeyi depolamak, tohum stoku etkinliğini azaltabilir ki, tekrarlanan donma-erime döngülerinden önlemek. Dondurulmuş kez ihtiyaç kadar, tohum stoklarının süresiz muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Kristalizasyon Tepsi kurulması <ol><li> Kristalleşme tesisleri ve deneyci tercihleri ​​mevcudiyetine bağlı olarak, RMMler kristalleşme tarama oturan damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak asılı damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak 24-kuyu tepsileri, veya 96-kuyu tepsileri kullanarak yapılabilir. RMMler için kristalizasyon tepsiler robotik işleme bir sıvı dağıtıcı ya da ikisinin bir kombinasyonu kullanılarak, elle ya da kurulabilir. </li><li> Elle kurulmuş tipik bir RMMler deney, 1.0 ul protein çözeltisi, 1.0 ul kristalleşme durumu ihtiva edecek ve0.5 ul tohum stok. Bir kristalleşme robot kullanarak kurmak tipik bir deney, 0.3 ul protein çözeltisi, 0.2 ul kristalleşme durumu ve 0.1 ul tohum stok içerecektir. </li><li> 24-çukurlu damla tepsiler askıdaki RMMler tarama gerçekleştirmek için, ilk olarak, bir el pipet kullanılarak, 4 x 24 oyuklu pregreased kristalleştirme her kuyuya, 10 ml bir tüp biçiminde bir 96 oyuklu durum kristalleşme ekranından her bir durum içinde 300 ul transfer tepsiler. <ol><li> Her ikisi de ön ve arka koruyucu alt şeritler çıkarılınca edilmiş olan karşılık gelen bir plastik lamel yüzeyi üzerine her bir 300 ul her bir hazneden kristalizasyon transferi 1 ul. </li><li> Her bir kristalizasyon durumunun 1 ul için kristal tohum stoklar 0.5 ul ve ardından protein çözeltisi 1 ul ekle. Sıvı damla aşağı doğru bakan ve de uygun yukarıdaki pozisyonu olduğu gibi her lamel ters çevirin. </li><li> Aşağıya lamel basın, seali sıkıştırılmasıyağ ng güvenli bir yalıtım oluşturur. Bir kere 96 damla kurulmuş, tepsi genellikle depolama için yaş aralığı 4-18 ° C, bir inkübatör veya sabit sıcaklık odasında transfer edilmelidir. </li></ol></li><li> 96 oyuklu damla tepsisi ilk olarak her bir kristalleşme tepsinin de karşılık gelen derin kuyu blok biçiminde, 96 oyuklu bir durum kristalleşme ekranından her bir durum 20-50 ul transfer oturma RMMler tarama yapmak için. Bu transfer adımı, 8 kanallı pipet kullanarak, bir kristalizasyon robot ya da manuel transferi kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> Elle veya 3.1 ayrıntılı hacimleri kullanarak bir robot ile damla transfer rezervuar, protein ve tohum stok çözümleri. Bazı ticari kristalleşme robotlar kesiciyi temas etmezler ve böyle bir sistemi kullanarak bir performans tohum hisse devir ipuçlarını veya ilgili boruları dağıtım tıkanmasına neden olabilir. Dağıtma sırası değişkendir: Bazı robotlar aynı anda tüm çözümleri dağıtmak. Eğersonra stok tohum, rezervuar sonra, ilk protein dağıtmak, bu, mümkün değildir. </li><li> Robot tevzi bir temas, kör bir iğne ile donatılmış bir düşük hacimli bir cam şırınga kullanılarak tohum mevcut transfer değilse. Daha sonra her bir damla halinde, tohum dağıtım stok rezervuar çözelti içinden geçirilerek iğne durulayın. </li><li> Şeffaf sızdırmazlık sayfasını kullanarak tepsiyi Seal ve bir inkübatör veya depolama için sabit sıcaklık odasında transfer. </li></ol></li></ol> 4. Kristalizasyon Tepsi Muayene <ol><li> Binoküler mikroskop ya da bir kristal görüntüleme sistemi kullanılarak tüm kristalizasyon deneyleri gözünüzde canlandırın. İlk madde genel görünüşüdür derinliği boyunca, kullanıcı daha fazla kontrol ve ikinci daha büyütme derecesini elde edilir, ancak daha fazla zaman alır. </li><li> Sırayla her sub-well/coverslip incelemek ve kristal oluşumu herhangi bir kanıt kaydedin. Deneyler her 24 kurulmasını takiben 5 gün boyunca saat ve kontrol edilmelidirn daha sonra bir kez kadar 4 hafta boyunca her 7 gün. </li><li> Optimum kırılma kaliteli kristaller üretilmektedir önce RMMler birden döngüleri genellikle gereklidir. </li></ol>

<ol><li>Bergfors, T. Protein Crystallization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+T+%22IUL+Biotechnology+Series%22">IUL Biotechnology Series</a>. , 2nd, (2009).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Priciples%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li>
<li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li>
<li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li>
<li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+Sect.+F.+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li>
<li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol+.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li>
<li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li>
<li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+Microseeding%3A+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li>
<li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li>
<li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+matrix+microseeding%3A+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li>
<li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme%3A+a+model+enzyme+in+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li>
<li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda RMMler protein kristalleşme taraması için genel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntemi kullanarak, iki test proteinleri kristalleşme başarı oranında önemli bir artış ile göstermiştir. RMMler olmayan RMMler yöntemlerle üretilen kristaller bir alt kümesi senkrotron radyasyonu kullanılarak kırınım analizi, önceki yazarlar iyi kalitede kristaller RMMler deneylerde 11 büyümeye daha fazla olduğunu rapor olmasına rağmen, her iki yöntemi kullanılarak yetiştirilir kristalleri arasında difraksiyon k...

Perutz, Kendrew ve yapısal genomik konsorsiyumların, modern yüksek kapasiteli otomatik boru hatları, hemoglobin ve miyoglobin yapılarını belirlemede işçiler ile ilk uygulamadan, makromoleküler X-ışını kristalografisi bize protein dünyasına görülmemiş bir yapısal bir bakış tanınan vardır . Bu teknik, atom at protein yapısının doğrudan görselleştirme izin en yaygın uygulanan deneysel yöntem kalır, ya da (yani 1-3 Å aralığında) atomik çözünürlükte yakın. Bir proteine ​​uygulanacak X-ışını difraksiyonu için bir ön gereklilik, ilk kristalize olması gerektiğini, ve bu kırınım yöntem 1, 2 ile yapı belirlenmesinde büyük tek oran-sınırlayıcı aşama kaldığı işlemin bu aşamasıdır. Bizim protein kristalleştirme sürecinin anlaşılması ve kristalizasyon ekranlarının kalitesi ve kullanılabilirliği önemli gelişmeler önemli gelişmelere rağmen,tepsiler ve ilgili teknolojiler, güvenilir kristalleşme başarının 3 olasılığını tahmin etmek imkansız kalır. Biyokimyasal ve Biyofiziksel yöntemler ilgi görüntüler bir kristal protein çekirdeklenme ve büyüme için elverişli özellikleri, yani iyi katlanmış, homojen, tek dağılımlı, vs olup olmadığını değerlendirmek için uygulanabilir, ancak, hiçbir şekilde bu anlayış kristalleşme kesin bir belirleyici sağlamak eğilimi. Tohum uzun mevcut kristal veya kristal malzemenin 4-7 sayısı, boyutu ve kaliteyi artırmak için uygun bir yöntem olduğu iddia edilmiştir. Bu yaklaşım kristal çekirdeklenmesini destekleyen bir durumdur sonraki kristal büyümesi ve tersi için optimal olmayabilir önermesine dayanır. Başka bir durum nucleatedi malzemeyi aktararak, kimse, bu süreçlerin etkin ayrılabilmesi için yeni, henüz keşfedilmemiş kristalleşme alanı böylece veren erişimi deneyebilirve bunun sonucu olarak bir tarama deneyinin genel başarı oranı artmaktadır. Kurulan yöntemleri, genellikle, örneğin kullanılarak yönlü basınç uygulaması ile elde edilen (i) macroseeding, bir 8 bir durum bütünüyle tek bir kristalin transferi, (ii) bir çizgi ekim, çekirdekli malzeme transferi için belgelenmiştir Yeni bir kristalizasyon damla 9, ve (iii) &quot;klasik&quot; mikro-ile bıyık sonraki geçişi ve ardından var olan bir kristal, yüzeyine bir kedi bıyık, hasat tarafından üretilen kristal &quot;tohum&quot;, transfer kristaller (ya da kristal halinde ezilmiş Tohumlar 10 vermiştir benzer koşullar malzemesi). Özellikle bu yöntemlerin her üç örneği, modern sıvı kullanım kristalleştirme ile elde robotik ne göre, zaman alıcı ve kötü ölçeklenebilir. Bu faktörler algı, en azından belli bir düzeyde, katkıda bu tohuming diğer yaklaşımlar meyvelerini başarısız olduğunda, yalnızca ziyaret edilecek bir yöntemdir. Rasgele matris mikro-(RMMler) yüksek verimli tarama ve ölçeklenebilirlik 11-13 olanlar ile geleneksel mikro-avantajlarını birleştiren yeni bir metodolojik bir yeniliktir. Bu yaklaşım, bir standart 96-durum kristalleşme ekran içinde her sub-well/coverslip üzerine / içine örnek edilebilir çekirdekli kristal bir malzemeden üretilen bir tohum stoku nesil dayanır. Bu yöntem, her iki el ile ya da 24-kuyu veya 96-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla buharı difüzyon deneyleri, oturma ya da asılı için de geçerlidir. RMMler önemli ölçüde kristalleşme başarı oranını artırmak ve daha fazla kırınım kalite ve miktar 11, 13, 14 kristallerini üretmek için deneysel olarak gösterdi, ve o de yaklaşımların crystallographers &#39;cephanelik yeni bir araç temsil edilmiştirkristalleşme başarı yolunda çaba ngoing. Burada RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır ve bu tekniğin etkinliğini gösteren örnek veriler sağlar.

<table><tbody><tr><td>MRC 96 kuyu kristalizasyon tepsileri</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD11-00-100</td><td>UV uyumlu olmayan, robot tarafından kurulan ekranlar için</td></tr><tr><td>ClearView sızdırmazlık levhaları</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD6-01S</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk yumurta akı lizozim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td> <td>~% 95 saflık</td></tr><tr><td>Sığır karaciğeri katilaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td> % 95 saflık</td></tr><tr><td>Ksilanaz</td><td>Hampton Research</td><td>HR7-104</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatococcus daniellii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7630'dan</td><td></td>Taumatin</tr><tr><td>Bacillus thermoproteolyticus rokko'dan termolizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1512</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus HT-96 ekran</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-40</td> Robot PACT premier HT-96 <td>tarafından kurulan ekranlar için</td></tr><tr><td> ekran</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-36</td> Robot Morpheus HT-96 <td>tarafından kurulan ekranlar için</td></tr><tr><td>ekran</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-47</td> Robot Crystal Ph & # 8211 <td>tarafından kurulan ekranlar için</td></tr><tr><td>; nix sıvı taşıma sistemi</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>602-0001-10</td><td></td></tr><tr><td>Tohum boncuk kiti</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçakları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2646-100EA</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu; l pipet</td><td>Starlab</td><td>S7100-0125</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 2-20 &mu; l pipet</td><td>Starlab</td><td>S7100-0221</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 100-1000 &mu; l pipet</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus ekran</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-37</td><td>El ile kurulan ekranlar için</td></tr><tr><td>PACT premier ekran</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-29</td><td>El ile kurulan ekranlar için</td></tr><tr><td>Morpheus ekran</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-46</td><td>El ile kurulan ekranlar için</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5415-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CrystalClene lameller 18 mm</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD4-17</td><td></td></tr><tr><td>2 ml cam Pasteur pipetleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z722669</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu XRL kristalizasyon tepsisi</td><td>Moleküler Boyutlar Sınırlı</td><td>MD3-11</td><td>Elle</td></tr> <tr><td>kurulan ekranlar için%30 (a/h) PEG 8000, 0,2 M amonyum sülfat, 0,1 M sodyum kakodilat pH 6,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%20 (a/h) PEG 8000, 0,2 M magnezyum asetat, 0,1 M sodyum kakodilat pH 6,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%20 (a/h) PEG 6000, 100 mM sitrik asit pH 5,0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rastgele microseed matrix eleme protein belirginleşmesine başarı oranı artırma

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Rasgele microseed matris taraması (RMMler) tohum kristalleri rasgele ekranlar ilave edildiği bir protein kristalleştirme tekniktir. Kristaller, bir protein faz diyagramının metastabl bölgede büyüyecek olasılığını artırarak, ilave kristalizasyon yol genellikle üretilen kristallerin kalitesi artırılabilir, elde edilir ve veri toplama ve ıslatma deneyler için kristallerinin iyi bir besleme sağlanır. Burada el ile ya da 96-kuyu veya 24-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla oturma veya asılı damla buharı difüzyon deneyleri, ya da uygulanabilir RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır.

Bir RMMler deney (A) Örnek RMMler tarama etkinliğini göstermek için, biz tavuk yumurtası beyaz lisozim (HEWL) ve sığır karaciğer katalaz (BLC) kristalizasyonuna için bu yöntemi uygulanır. Bu enzimler fazlasıyla kristalize olan ve yapısal olarak iyi hedefleri 15, 16 karakterize edilir hem de. Böyle iki RMMler ile elde geliştirilmiş kristalleşme başarı oranını göstermek için mükemmel denekler sağlamak gibi. Kristalizasyon deneyleri 96-sıra sıvı taşıma robotik kullanarak açılan tepsi bi...

Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Bu prosedürün genel amacı, bir kristalizasyon tarama deneyinden elde edilen protein kristallerinin sayısını ve difraksiyon kalitesini artırmaktır. Bunu yapmak için, ilgilenilen bir hedef protein kullanılarak oluşturulmuş mevcut bir protein kristalizasyon tarama deneyinden kristal veya çökmüş malzeme tanımlanır, bu kristal veya çökmüş malzeme toplanır ve ardından bir kristal tohum stoku oluşturmak için kullanılır. Sonrasında, hem ilgilenilen hedef proteini hem de kristal tohumlarını içeren bir dizi kristalizasyon taraması kurulur.Son olarak, tohumlanmış kristalizasyon taramaları kristal oluşumu açısından izlenir ve oluşan yeni protein kristalleri karakterize edilir. Nihayetinde, bu prosedürün uygulanması, kristalizasyon tarama deneylerinden elde edilen protein kristallerinin sayıca artmasına, boyutlarının büyümesine ve difraksiyon kalitelerinin iyileşmesine yol açabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere, örneğin geleneksel mikro tohumlama veya makro tohumlamaya göre temel avantajları; hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmesi, yüksek düzeyde ölçeklenebilir olması ve diğer tohumlama yöntemlerinden önemli ölçüde daha fazla kristalizasyon alanını örnekleyebilmesidir.Bu tekniğin bir diğer a

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

3-D bir molekül yapısı molekül fonksiyonları nasıl eşsiz bir anlayış sağlar. Yakın atomik çözünürlükte yapı tespiti için temel yöntem, X-ışını kristalografisi. Burada, X-ışını kristalografisi yapı tayini için uygun olan herhangi bir makromolekül üç boyutlu kristaller elde etmek için mevcut yöntemler göstermektedir.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç ​​koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Biyomacrooleküllerin kristalografi ile yapısal çalışmaları yüksek kaliteli kristaller gerektirir. Burada OptiCrys (laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir cihaz) ve/veya mikrodiyaliz düğmeleri tarafından kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanılabilecek bir protokol gösteriyoruz.

Nötron Makromoleküler Kristalografi için Kristal Büyümesinin Optimizasyonu

Bu makalede, seyrek matris ekranlarda yeni kristalleşme koşulları oluşturmak için mikrotohumlama kullanarak I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) ile türemiş protein kristalleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Tepsiler sıvı dağıtım robotları kullanılarak veya elle kurulabilir.

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Bu makalenin amacı, izleyiciye, büyük, tek protein kristallerini büyütmek için küçük hacimli, buhar-difüzyon protokollerini seri kristalografi için büyük hacimli bir toplu mikro-kristalizasyon yöntemine nasıl dönüştürecekleri konusunda sağlam bir anlayış kazandırmaktır.

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Sunulan protokol, 96 kuyucuklu yüksek verimli bir diyaliz plakası kullanarak protein kristalleşme koşullarını ve kristal büyümesini taramak için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır. Mikrokristallerin büyük ölçekli büyümesi için diyalizör tüplerinin kullanımı, seri kristalografi ve MicroED uygulamaları için de gösterilmiştir.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Bu protokol, 1.536 mikrotahlil plakası hazırlığından 6 haftalık deneysel zaman penceresinin sonuna kadar değişen yüksek verimli kristalizasyon taramasını detaylandırır. Örnek kurulumu, elde edilen görüntüleme ve kullanıcıların makromoleküler kristalleşme koşullarını hızlı ve verimli bir şekilde tanımlamak için yapay zeka özellikli bir grafik kullanıcı arabirimi kullanarak analizleri nasıl gerçekleştirebilecekleri hakkında ayrıntılar dahil edilmiştir.

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Öğrenin, rastgele mikrotohum matris taraması ile protein kristalleşme başarı oranını artırma yöntemini. Bu teknik, kristal kalitesini ve difraksiyon verimini iyileştirirken optimizasyon ihtiyacını azaltır.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Daha fazla video keşfet