Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme

Bu prosedürün genel amacı, üstün kalitede bir kuvars lam yüzeyi elde etmektir. Bu işlem, önce delikli kuvars lamların ve lamelllerin su ve aseton ile temizlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, yüzey kalitesini artırmak için lam, potasyum hidroksit ve piranha çözeltisi ile aşındırılır.

Ardından, lamlar ve lameller amin grupları ile fonksiyonelleştirilir ve cam yüzeyi inert hale getirmek için bir polimer kullanılarak iki tur yüzey kaplama işlemi uygulanır. Son adım, mikroakışkan odağın, polietilen glikol kaplı veya pegyllenmiş yüzeyler birbirine bakacak şekilde lam ve lamelden monte edilmesidir. Nihayetinde, yüzeyin iki tur boyunca peg molekülleri ile işlenmesine dayalı yeni bir strateji, tek molekül floresan mikroskopisi ile gözlemlendiği üzere pasivasyon kalitesini önemli ölçüde artırmaktadır.

Bu tekniğin veya potasyum oksit aşındırması sonrası polimer kaplama gibi mevcut tekniklerin temel avantajı, bu tekniğin üstün kalite garanti etmesidir. Bu yöntemde yeni olan kişiler, çok sayıda işlem uygulanması gerektiğinden zorluk yaşayacaklardır. Başlangıç için kuvars lamlar, metin protokolünde ayrıntılı anlatıldığı şekilde hazırlanır.

Slaytları cam bir boyama kavanozuna yerleştirerek temizleyin. Genellikle tek bir kavanoza beş ila 15 slayt yerleştirilebilir. Ardından slaytları UE water ile durulayın; bu durulama işlemini üç kez tekrarladıktan sonra, kirleri temizlemek için slaytları beş dakika boyunca UE water ile sonikasyon işlemine tabi tutun, suyu boşaltın ve slaytları UE water ile üç kez daha durulayın.

Ardından, UE suyunu asetonla değiştirin ve lamları asetonla 20 dakika veya daha uzun süre sonikasyona tabi tutun, asetonu dökün ve herhangi bir aseton kalıntısını gidermek için lamları Milli Q suyu ile durulayın. Sonra, suyu bir molar potasyum hidroksit ile değiştirin ve lamları 20 dakika veya daha uzun süre sonikasyona tabi tutun. Aşırı aşındırma yüzey kalitesini artıracaktır ancak floresan görüntülemeyi etkileyebilecek çiziklere yol açacaktır.

Piranha aşındırması gerçekleştirmek için potasyum hidroksit kalıntılarını temizlemek amacıyla lamları üç kez Milli Q suyu ile durulayın. Lamları bir Duran lam tutucuya veya özel yapım bir Teflon tutucuya aktarın ve kimyasal çeker ocak içerisinde bulunan bir litrelik bir behere yerleştirin. Beheri 450 mililitre sülfürik asit ile doldurun.

Ardından, sülfürik asit ve hidrojen peroksit arasında üçe bir oran sağlamak için 150 mililitre hidrojen peroksit ekleyin. Çözeltiyi uygun şekilde karıştırmak için karıştırın ve beheri 20 dakika boyunca rahatsız etmeden bekletin. Lamları piranha çözeltisinden çıkarın ve millieu suyu içeren bir lam tutucuya yerleştirin.

Bu sırada, piranha çözeltisini belirlenmiş bir atık şişesine boşaltın. Oda sıcaklığına ulaştığında, lamları cover slip temizliğinde olduğu gibi üç kez UE water ile durulayın. Boyama kaplarındaki UE water'ı metanol ile değiştirin. Lamları ve cover slip'leri metanol içerisinde bekletin.

Bu sırada, balona 100 mililitre metanol dökerek amino silanizasyon çözeltisini hazırlayın. Ardından beş mililitre asetik asit ve üç mililitre üç amino propil trimetilsilan ekleyip sallayarak nazikçe karıştırın. Lam ve lamel içeren boyama kaplarındaki metanolü, amino silanizasyon reaksiyon karışımı ile değiştirin.

20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sırasında bir kez bir dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Ardından, amino adalaşma reaksiyonunu metanol ile değiştirin. Son olarak metanolü dökün ve taze bir metanol çözeltisi ekleyin.

Yüzey fonksiyonelleştirmenin ilk turu için bu prosedürü, önce polimer kullanarak üç kez tekrarlayın; lamları ve lamelleri nitrojen gazı kullanarak kurutun. Ardından, pegillenecek tarafı yukarı bakacak şekilde, kısmen milli Q su ile doldurulmuş temiz pipet kutularına yerleştirin. Sonrasında, önceden hazırlanmış peg solüsyonuna, yeni hazırlanmış reaksiyon tamponundan 64 µL ekleyin.

Tamamen çözünmesi için karışımı pipetle yukarı aşağı çekip bırakın. Ardından 16.100 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Hava kabarcıklarını gidermek için, pegilasyon karışımından 70 µL'yi kurutulmuş bir kuvars lam üzerine damlatın.

Çözeltinin üzerine nazikçe kurutulmuş bir lamella yerleştirin; pegillenmiş lam ve lamellaları saklamak için slaytları karanlık ve nemli bir ortamda iki saatten gece boyuna kadar inkübe edin. Lamellayı yana doğru kaydırarak lam ve lamellayı dikkatlice birbirinden ayırın ve nitrojen gazı ile kurutmadan önce UE suyu ile durulayın. Bir çift lam ve lamellayı, pegillenmiş yüzeyler birbirine bakmayacak şekilde 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Tüpü kısmen kapatın ve nitrojen gazı ile doldurup kapağını sıkıca vidalamadan önce vakumlayın. -20 °C'de saklayın. Bu adımlar, pegillenmiş yüzeyin uzun süre korunmasına yardımcı olur.

Slaytı bir mikroakışkan oda oluşturmak için kullanmadan hemen önce, metin protokolünde açıklandığı şekilde ikinci bir pegilasyon işlemi gerçekleştirin. Pegillenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde bir kuvars slaytı düz bir yüzeye yerleştirin. Slayt üzerine çift taraflı yapışkan bant yapıştırarak, pegillenmiş yüzeyde çapraz bir kanal oluşturun.

Deliklerin kanalın merkezinde konumlandığından emin olun. Ardından, kanalı tamamlamak için pegyllenmiş bir kapatma lamini nazikçe üzerine yerleştirin. Pegyllenmiş taraf aşağı bakmalıdır.

Kapak camını çift taraflı bandın yerleştirildiği alanların üzerine bastırarak hazneyi mühürleyin. Haznenin su sızdırmaz şekilde mühürlenmesi için bu işlemi nazikçe ancak eksiksiz bir şekilde yapın. Son olarak, haznenin kenarlarını epoksi yapıştırıcı ile kapatın.

Metin protokolünde açıklandığı üzere, streptavidin veya nötr avidin immobilizasyonunu gerçekleştirin ve tek molekül görüntüleme için biyotinlenmiş biyolojik molekülleri ekleyin; yüzey işlemleri başarıyla tamamlandığında, gözlemlenen görüntüleme alanı başına non-spesifik olarak adsorbe olan protein sayısı 10'dan azdır. Kamaraya 1 ila 10 nanomolar floresan işaretli protein eklendiğinde, temizleme veya reaksiyon adımlarından herhangi biri uygun şekilde yürütülmemişse, non-spesifik olarak adsorbe olan protein sayısı önemli ölçüde artar. Örneğin, piranha aşındırma adımı atlanırsa, 100 kat daha fazla non-spesifik adsorpsiyon gözlemlenir.

Çift pegilasyonun üstün doğası burada belirgin bir şekilde gösterilmektedir. Sol panelde gösterildiği üzere, çift pegilasyon kullanıldığında floresan moleküllerden ve solüsyondan gelen arka plan sinyallerinin çok daha zayıf olduğu gözlemlenmiştir. Bu durum, proteinlerin çift pegile edilmiş tabaka tarafından daha etkili bir şekilde itildiğini göstermektedir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde dört saatte tamamlanabilir. AYA ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken uygun eldiven, koruyucu gözlük ve önlük gibi önlemler her zaman alınmalıdır.