Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme

Bu prosedürün genel amacı, üstün kalitede bir kuvars slayt yüzeyi elde etmektir. Bu, önce delinmiş kuvars slaytların ve kapak kızaklarının su ve aseton ile temizlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra slayt, yüzeyin kalitesini arttırmak için potasyum hidroksit ve piranha çözeltisi ile kazınır.

Daha sonra, kızaklar ve kapak kızakları, amin grupları ile işlevselleştirilir ve ardından cam yüzeyi inert hale getirmek için bir polimer kullanılarak iki tur yüzey asyonu yapılır. Son adım, mikroakışkan odayı, polietilen glikol kaplı veya pegile yüzeyler birbirine bakacak şekilde sürgüden ve kapak kızağından monte etmektir. Sonuç olarak, yüzeyi iki tur boyunca peg molekülleri ile işlemeye yönelik yeni bir strateji, tek moleküllü floresan mikroskobu ile gözlemlendiği gibi pasivasyon kalitesini önemli ölçüde artırır.

Bu tekniğin veya potasyum oksit aşındırma sonrası polimer kaplama gibi mevcut tekniklerin temel avantajı, bu tekniğin üstün kaliteyi garanti etmesidir. Bu yönteme yeni başlayan kişiler, birden fazla servis tedavisinin yapılması gerektiğinden mücadele edeceklerdir. Delmeye başlamak için kuvars, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kayar.

Slaytları bir cam boyama kavanozuna yerleştirerek slaytları temizleyin. Tipik olarak, tek bir kavanoza beş ila 15 slayt yerleştirilebilir. Ardından, durulamayı üç kez tekrarladıktan sonra slaytları UE suyla durulayın, kiri temizlemek için slaytları beş dakika boyunca UE suyuyla sonikleştirin, suyu atın ve slaytları UE suyuyla üç kez daha durulayın.

Daha sonra, UE suyunu asetonla değiştirin ve slaytları 20 dakika veya daha uzun süre asetonla sonikleştirin, asetonu atın ve herhangi bir aseton kalıntısını gidermek için slaytları Milli Q suyuyla durulayın. Daha sonra, suyu bir molar potasyum hidroksit ile değiştirin ve slaytları 20 dakika veya daha uzun süre sonikleştirin. Aşırı aşındırma, yüzeyin kalitesini artıracak, ancak floresan görüntülemeyi engelleyebilecek çiziklere neden olacaktır.

Piranha aşındırma işlemini gerçekleştirmek için potasyum hidroksit izlerini gidermek için slaytları Milli Q suyuyla üç kez durulayın. Slaytları bir Duran sürgü tutucuya veya özel yapım bir Teflon tutucuya aktarın ve bunları kimyasal bir davlumbazda bulunan bir litrelik bir behere yerleştirin. Beheri 450 mililitre sülfürik asitle doldurun.

Ardından, sülfürik asit ve hidrojen peroksit arasında üçe bir oran için 150 mililitre hidrojen peroksit ekleyin. Uygun karıştırma için çözeltiyi karıştırın ve kabı 20 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Slaytları piranha solüsyonundan çıkarın ve milieu su içeren bir slayt tutucusuna koyun.

Bu arada, piranha solüsyonunu belirlenmiş bir atık şişesine atın. Oda sıcaklığına ulaştığında, kapak kayma temizliğinin ardından slaytları UE suyuyla üç kez durulayın. Boyama kaplarındaki UE suyunu metanol ile değiştirin. Slaytları ve kapak fişlerini metanolde tutun.

Bu arada, şişeye 100 mililitre metanol dökerek amino adalama çözeltisini hazırlayın. Daha sonra beş mililitre asetik asit ve üç mililitre üç amino propil, trimetil ekleyin ve çalkalayarak hafifçe karıştırın. Slaytları ve kapak fişlerini içeren boyama kaplarındaki metanolü amino siloizasyon reaksiyon karışımı ile değiştirin.

Kuluçka sırasında 20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin, bir dakika boyunca bir kez sonikat yapın. Ardından, amino adalaşma reaksiyonunu metanol ile değiştirin. Ardından metanolü atın ve taze bir metanol çözeltisi ekleyin.

İlk yüzey işleme turu için bu prosedürü üç kez tekrarlayın Önce polimer kullanarak, slaytları ve kapak kızaklarını nitrojen gazı kullanarak kurutun. Daha sonra bunları, pegile edilmesi gereken taraf yukarı bakacak şekilde kısmen milli Q su ile doldurulmuş temiz pipet kutularına yerleştirin. Daha sonra, hazırlanmış bir peg çözeltisine 64 mikrolitre taze hazırlanmış reaksiyon tamponu ekleyin.

Tamamen çözünmesi için karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra bir dakika boyunca 16, 100 G'de santrifüjleyin. Hava kabarcıklarını çıkarmak için, 70 mikrolitre pegilasyon karışımını kurutulmuş bir kuvars lam üzerine bırakın.

Solüsyonun üzerine nazikçe kurutulmuş bir örtü fişi yerleştirin, pegile edilmiş slaytları ve kapak fişlerini saklamak için slaytları karanlık ve nemli bir ortamda iki saat ila gece boyunca inkübe edin. Kapak kızağını ve kapak kızağını, kapak kızağını yana kaydırarak ve nitrojen gazı ile kurutmadan önce UE suyu ile durulayarak dikkatlice sökün. 50 mililitrelik bir tüpe, pegile yüzeyler birbirinden uzağa bakacak şekilde bir çift sürgü ve kapak sürgüsü yerleştirin.

Tüpü kısmen kapatın ve nitrojen gazı ile doldurmadan ve kapağı sıkıca vidalamadan önce vakumlayın. Eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu adımlar, pegile yüzeyin uzun süre korunmasına yardımcı olur.

Bir mikroakışkan odayı monte etmek için sürgüyü kullanmadan hemen önce metin protokolünde açıklandığı gibi ikinci bir pegilasyon turu gerçekleştirin. Pegile tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye bir kuvars slayt yerleştirin. Slaytın üzerine çift taraflı yapışkan bant koyarak pegile edilmiş yüzey üzerinde çapraz olarak bir kanal oluşturun.

Deliklerin kanalın ortasına yerleştirildiğinden emin olun. Ardından, hazneyi tamamlamak için yavaşça üstüne pegile bir kapak fişi yerleştirin. Pegile tarafı aşağı bakacak şekilde.

Çift taraflı bandın yerleştirildiği alanların üzerine kapak sürgüsüne bastırarak hazneyi kapatın. Nazikçe ama iyice yapın, böylece hazne su geçirmez hale gelir. Son olarak, haznenin kenarlarını epoksi yapıştırıcı ile kapatın.

Streptavidin veya nötrantayı hareketsiz hale getirmeye devam edin ve metin protokolünde açıklandığı gibi tek moleküllü görüntüleme için biyotinile biyolojik moleküller ekleyin, eğer yüzey asyonu başarılı bir şekilde yapıldıysa, gözlemlenen görüntüleme alanı başına 10'dan az spesifik olarak emilmeyen protein vardır. Hazneye bir ila 10 nanomolar floresan etiketli protein eklendiğinde, temizleme veya reaksiyon adımlarından herhangi biri uygun şekilde gerçekleştirilmediğinde, spesifik olarak emilmeyen proteinlerin sayısı önemli ölçüde artar. Örneğin, piranha aşındırması atlanırsa, 100 kat daha fazla spesifik olmayan absorpsiyon gözlenir.

Çift pegilasyonun üstün doğası burada belirgin bir şekilde gösterilmektedir. Floresan moleküllerinden ve çözeltiden gelen arka plan sinyallerinin, sol panelde gösterildiği gibi çift pegilasyon kullanıldığında çok daha zayıf olduğu gözlendi. Bu, proteinlerin çift pegile tabaka tarafından daha etkili bir şekilde itildiğini gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. AYA ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu işlem yapılırken her zaman uygun eldiven, gözlük ve önlük gibi önlemler alınmalıdır.