Name: Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Öğrenin, tek molekül floresan mikroskobisi için kuvars yüzeylerin iki aşamalı PEG kaplama ile pasifleştirilmesini. Bu yöntem, cam yüzeylerdeki spesifik olmayan bağlanmayı azaltarak görüntüleme kalitesini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SDC, ACH ve CJ Avrupa Araştırma Konseyi aracılığıyla Hibeler (ERC-StG-2012-309509) Başlangıç ​​tarafından desteklenmiştir. J.-MN Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) (2011-0018198) tarafından desteklenen; ve Kore ÇKS sayesinde Pioneer Araştırma Merkezi Programı (2012-009586) Bilim, ICT Bakanlığı ve Gelecek Planlaması (MSIP) tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma aynı zamanda Küresel Frontier Projesi (H-GUARD_2013-M3A6B2078947) gibi Kore MSIP tarafından finanse BiyoNanoTeknoloji Sağlık-Guard Merkezi tarafından desteklenmiştir. YKL ve J.-HH Seul City, Kore Seul Bilim Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Etiketli Rep proteini Dr Şua Myong cömert bir hediye oldu.

1.. Hazırlama ve Temizleme kaydırın Bir microfluidic odası, bir kuvars slayt ve bir lamel oluşur. Prizma-tipi toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi yılında, kuvars slayt yüzey görüntüsü alınır. Bu nedenle, iyice 2 H, O, aseton, KOH ve pirana çözeltiler kullanılarak bir kuvars slayt temizlemek için önemlidir. Th çok aşamalı temizleme tek bir molekül fluoresans ölçümleri ile müdahale, bir yüzey üzerinde floresan organik molekülleri ortadan kaldırır. Buna ek olarak, pirana gravür hidroksil gruplarını üreterek kuvars yüzeyi hidrofilik hale getirir. Serbest hidroksil grupları, adım 3&#39;te amino-silanizasyon reaksiyonu için gereklidir. <ol><li> Sondaj kuvars slaytlar. 3/4 mm elmas matkap ucu (Şekil 2a) ile bir kuvars slayt içine delik bir çift delin. Birden fazla kanal istenirse, daha pa matkapirs delikleri (Şekil 2b). Bu delikler, Adım 7&#39;de bir mikroakışkan odası içine enjekte çözüm için kullanılır. <ol><li> Sondaj sırasında H 2 O ıslak matkap ucu tutun. Matkap ucunun ömrünü arttıran bir yağlayıcı olarak H 2 O gerçekleştirir. </li><li> Ara sıra matkap ucu silerek delik delme yardımcı olur. </li><li> Delikler sonra PEGilasyon işlemi sırasında kolay tanımlama için sürgünün bir tarafı işaret eder. Belirteçler daha sonra karışıklığı önlemek için referans olarak kullanılabilir. Markalama için, bir elmas matkap ucu kullanılabilir. Mürekkep yüzeyinde alabilirsiniz beri herhangi bir kalem kullanmayınız. </li></ol></li><li> H 2 O. ile temizleme Cam boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. Tipik haliyle 5-15 slaytlar tek bir kavanoza yerleştirilebilir. MilliQ H 2 O. ile slaytlar durulayın Bunu 3 kez tekrarlayın ve kirleri çıkarmak için 5 dakika boyunca MiliQ H 2 O ile slaytlar ses dalgalarına maruz. Su atılması ve tekrar 3 kez slaytlar durulayın130 W, bu protokol için kullanılan ultrasonik titreşim güç olduğunu MiliQ H 2 O. Not. Yükseköğretim Sonication güç kuvars slaytların ömrünü azaltabilir. </li><li> Aseton ile temizleme. Aseton ile MilliQ H 2 O değiştirin. 20 dakika veya daha uzun süre boyunca aseton ile slaytlar sonikasyon. </li><li> H 2 O ile durulama Aseton atın ve MiliQ H 2 O. ile slaytlar durulayın Herhangi bir aseton artıklarını uzaklaştırmak için 3 kez tekrarlayın. </li><li> KOH ile temizlik. 1 M KOH ile su yerine yerleştirin ve 20 dakika ya da daha uzun süre için slaytlar sonikasyon. Aşırı dağlama (örn. gece KOH tedavi) yüzey kalitesini artıracaktır, ancak floresan görüntüleme ile engel olabilecek çizik, tanıtacak. </li><li> H 2 O ile durulama KOH izlerini çıkarmak için 3 kez MilliQ H 2 O ile slaytlar durulayın. </li><li> Piranha dağlama. <ol><li> Bir Duran slayt sahibinin veya bir ısmarlama Teflon tutucu ve pl Transfer slaytlarKimyasal bir kaput bulunan bir kaba (1 L) içinde onları as. </li><li> H 2 450 ml SO 4 ile beher doldurun. </li><li> SO 4 H, 2 ila 3:01 oranında ve H2O 2 H, 2 O 2 150 ml ilave edilir. Çözüm kendiliğinden kaynamaya başladığında, sıcaklık 90 ° C üzerinde artırır Emin H 2 O 2 çözeltisi, reaksiyon başlamadan önce, oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Aksi takdirde, kaynama çözeltinin sıcaklığı daha düşük 90 ° C olabilir, </li><li> Uygun karıştırma için bir çözüm karıştırılır ve beher 20 dakika boyunca rahatsız sağlar. </li><li> Birlikte slayt tutucu ile piranha çözüm dışarı slaytlar almak ve MiliQ H 2 O. içeren bir slayt tutucuya koyun Oda sıcaklığına ulaştığında Bu arada, bir belirtilen atık şişeye piranha çözüm atın. </li><li> MilliQ H 2 O. ile slaytlar 3 kez durulayın Ekstra bakım daha ste alınmalıdırslaytlar olası kontaminasyonu önlemek için ps. 3. Adım devam. Hemen aşağıdaki adımlarla devam etmek için tavsiye edilir. * Dikkat: piranha çözüm son derece duyarlıdır. Bu çözüm tutarken ekstra dikkatli alınmalıdır. Buna ek olarak, bu tür aseton gibi organik çözücü ile karıştırılmış yanlışlıkla, bir patlamaya yol açabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Lamel Temizleme Bir microfluidic odası, bir kuvars slayt ve bir kapağı s dudak oluşmaktadır. Bir prizma tipi TIRF mikroskop kullanıldığında, bir lamel yüzey görüntüsü değildir. Bu nedenle, sadece H2O ve KOH ile bir lamel temizlemek için yeterlidir. Halinde, bir lamel (nesnel tipi TIRF mikroskobu ile örneğin) yansıması gereken, bu pirana çözeltisi (Aşama 1.7) ile lamelleri tedavisi için önerilir. Lamel yüzeyinin PEG&#39;leme kaliteli değilse, bu proteinler için bir lavabo olarak hareket olabilir unutmayın birprotein konsantrasyonundaki değişikliklere neden d. <ol><li> H 2 O ile durulama Yeri lamelleri cam boyama kavanoz (24 x 30, 24 x 40 veya 24 x 50 mm 2). Tipik haliyle 5-15 lamelleri tek bir kavanoza yerleştirilebilir. MilliQ H 2 O. ile lamelleri 3 kez durulayın </li><li> KOH ile temizlik. 1M KOH ile su yerine yerleştirin ve 20 dakika veya daha uzun süre lamelleri sonikasyon. </li><li> H 2 O ile durulama KOH izlerini kaldırmak için MiliQ H 2 O ile lamelleri 3 kez durulayın. Adım 3&#39;e devam ediyor. </li></ol> Slaytlar ve Lameller 3. Amino-silanlaştıncı Amino-silanizasyon kimyası ile kuvars slaytlar ve amin grubu ile lamelleri yüzeyini işlevselleştirilmesi. Metanol amino-silanizasyon reaksiyonu için bir katalizör olarak bir çözücü ve asetik asit gibi kullanılır. <ol><li> Metanol ile durulama. S&#39;den boyama yemekler MilliQ H 2 O (değiştirinTeps&#39;in 1 ve 2) metanol ile. Adım 3.3 kadar metanol slaytlar ve lamelleri tutmak. Metanol kirliliklerin beri bir zaman gereksiz yere uzun süre (örneğin birkaç saat) metanol slaytlar ve lamelleri tutmayın yüzeyine yapışır. </li><li> Amino-silanizasyon çözelti hazırlanması. <ol><li> Metanol ile bir PYREX şişesi birkaç kez durulayın. 5 dakika veya daha uzun süre boyunca metanol ile şişesi sonikasyon. Bu temiz tutulan özel bir şişeyi olması tavsiye edilir. </li><li> Şişe içine 100 ml metanol dökülür. </li><li> Asetik asit içinde 5 ml. </li><li> APTES 3 ml (3-aminopropil trimetoksisilan) ekleyin ve yavaşça çalkalanarak karıştırılır. </li></ol></li><li> Amino-silanizasyon. Aminosilanization reaksiyon karışımı ile slaytlar ve lamelleri içeren boyama yemekler metanol değiştirin. <ol><li> 20-30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, bir kez 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. </li></ol></li><li> Metanol ile durulama. A değiştirinReaksiyon, metanol ile minosilanization. Metanol atın ve yeni bir metanol çözeltisi ilave edilir. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. </li></ol> Polimer (First Round) kullanarak 4. Yüzey Pasifleme NHS-ester, bir polietilen glikol (PEG) ile birleştirilmesi yoluyla kuvars slaytlar ve lamelleri amin kaplı bir yüzey pasifleştirme. Bu reaksiyon, bir gece boyunca pH 8.5 &#39;da PEG çözeltisinin doyurucu konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. <ol><li> Slaytlar ve lamelleri Kurutma. N2 gaz kullanarak slaytlar ve lamelleri kurutun ve yan PEG&#39;lenmiş yukarı baktığından olmak zorunda olduğu bir şekilde temiz bir pipet kutulara yerleştirin. Pipet kutu kısmen MilliQ H2O ile doldurulur Bu nemli ortam gecede inkübasyon sırasında kurumasına PEG&#39;leme çözümü engeller. </li><li> Reaksiyon tamponu hazırlanması. 10 ml sodyum bikarbonat ve 84 mg çözülmesiyle taze sodyum bikarbonat tampon maddesi (pH 8.5), 0.1 M hazırlanmasıMilliQ H 2 O. PH değerinin ayarlanması için hiç gerek yoktur. Bu solüsyon bir sonraki kullanımı (örneğin, adım 6.1) için dondurulmuş depolanabilir. </li><li> PEGylation çözüm hazırlanması. <ol><li> Bir 1.5 ml bir tüp içinde NHS-ester PEG-NHS ester mPEG (5000 Da) içindeki bir (5000 Da), 13 ve 8 mg biyotinile 0.2 mg arasında bir PEG karışım hazırlayın. Slaytları N sayıda hazırlanırken, tek bir tüp içerisinde PEG karışımın K kat daha büyük bir miktarda hazırlar. </li><li> 64 ul (veya N kez slaytlar K sayısı için 64 ul) yeni hazırlanmış bir tampon maddesi (4.2 Aşama) ekleyin. Onları tamamen eritmek için onu yukarı ve aşağı Pipet. </li><li> Hava kabarcıklarını çıkarmak için 1 dakika 16.100 xg ile santrifüj. Sonra pipetle etmeyin. Aksi takdirde, hava kabarcıkları Adım 4.4 de PEG&#39;lenmesi müdahale hangi oluşturacak. </li></ol></li><li> PEGylation. <ol><li> Aşama 4.1 &#39;den kurutulmuş bir kuvars slayta PEGilasyon karışımın 70 ul bırakın. 24 x 50 mm 2 cov durumunda, 90 ul kullanınerslip. </li><li> Yavaşça çözüm üzerinde Adım 4,1 kurutulmuş lamel yerleştirin. </li><li> , PEG&#39;lenmesi bir üniforma ve kaliteli olması için hava kabarcıkları tanıtmak için özen. Nedeniyle yüzey gerilimi için, hava kabarcıklarının en kendiliğinden yüzey gerilimi nedeniyle beş dakika içinde, reaksiyon hacmi bırakabilir. </li><li> Bir karanlık ve nemli ortamda slaytlar inkübe. Biz, pH 8 kullanımı NHS-ester PEG yarı ömrü yaklaşık bir saattir. En azından, 2 saat boyunca inkübe. Bir gecelik inkübasyon PEGilasyon (veriler gösterilmemiştir) daha yüksek kaliteli olur. </li></ol></li></ol> 5. Uzun vadeli Depolama -20 º C&#39;de PEGillenmiş slaytlar ve N 2 lamelleri saklanması <ol><li> Slaytlar ve lamelleri Kurutma. Dikkatle, bir tarafına lamel kaydırarak slayt ve lamel sökmeye MiliQ H 2 O ile durulayın ve N2 ile kurulayın. </li><li> Slaytlar ve lamelleri saklama. For hemen kullanım, PEG&#39;lenmesi (Adım 6) ikinci turu için prosedürü takip edin. Uzun bir süre saklamak için, aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> PEG&#39;lenmiş yüzeyleri birbirinden uzağa doğru bakacak şekilde bir 50 ml tüp içinde kayması ve lamel bir çift yerleştirin. </li><li> Kısmen, bunun tüpü kapatmak tüpü vakum ve daha sonra N2 ile doldurun. Bu adımlar, uzun bir süre için PEG&#39;lenmiş yüzeyi koruyarak yardımcı olur. Tüpü sıkıca vidalayın ve -20 ° C&#39;de saklayın Slaytların kalitesi (sağ, Şekil 3a) 3 aya kadar iyi kalır. </li></ol></li></ol> Polimer (İkinci Tur) kullanılması 6. Yüzey Pasifleme PEG katmanı daha kalın yapmak ve aynı zamanda yüzey üzerinde kalan amin gruplarını söndürmek için PEGilasyon ilave tur. Kısa NHS ester PEG moleküllerinin (333 Da) kullanımı varolan PEG tabakası içine nüfuz etkili olabilir. Bu recDoğru bir slayt kullanmadan önce PEG&#39;lenmesi bu ikinci turda yapmak tavsiye olunur. <ol><li> Reaksiyon tamponu hazırlanması. Taze sodyum bikarbonat tampon maddesi (pH 8.5), 0.1 M hazırlayın. Aşama 4.2 &#39;den dondurulmuş çözeltisi de kullanılabilir. </li><li> PEGylation çözüm hazırlanması. Sodyum bikarbonat tampon maddesi 63 ul 250 mM MS4-PEG 7 ul içinde çözündürülür. </li><li> PEGylation. Adım 4.4 gibi aynı prosedürü uygulayın. Gece boyunca kadar 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Slaytlar ve lamelleri Kurutma. Slayt çifti ve lamel sökün, MiliQ H 2 O ile durulayın N 2 ile onları kuru ve temiz bir pipet kutuda saklayın. Adım 7&#39;de, bir mikro-akışkan haznesi monte edilmesi için devam edin. </li></ol> 7. Bir mikroakışkan Odası Montaj Bir PEGile kuvars slayt bir çift ve bir lamel kullanarak microfluidic odasını Montaj. Çift taraflı yapışkan bant bir ara parçası olarak kullanılır. Bölme böylece, epoksi yapıştırıcı ile kapatılır veEtkin çözüm kuvars slayt deliklerden tanıtılmaktadır. <ol><li> PEGilatlanmış tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye bir kuvars slayt yerleştirin. </li><li> Slayt üzerinde çift taraflı yapışkan bantlar koyarak çaprazdan PEGillenmiş yüzeyinde bir kanal (7 mm genişliği 5) olun. Delik kanalın merkezinde konumlandırılmış olduğundan emin olun. Bir odasını yapma sürecinde PEGillenmiş yüzeyini bozmamak için özen gösterin. Bu, (bkz. Şekil 2) yerleştirilmesi ve farklı çift taraflı yapışkan bantlar yapışarak çok kanallı bir slayt yapmak mümkündür. </li><li> Yavaşça odası tamamlamak için üstüne PEG&#39;lenmiş lamel yerleştirin. PEGile tarafı aşağı dönük olmalıdır. </li><li> Çift taraflı bantlar yerleştirilir alana lamel basarak odasına mühür. Haznesi su sıkıca kapatılmış olur böylece yavaşça ama iyice yapın. </li><li> Epoksi yapıştırıcı ile haznenin kenarları kapatın. </li><li> Üzerinde streptavidin veya nötravidin hareketsizP200 pipet kullanarak T50 içinde streptavidin veya nötravidin çözeltisi (10 mM Tris-HCI [pH 8.0], 50 mM NaCl tamponu) 0.1 mg / ml, 50 ul ekleyerek biyotinile edilmiş PEG katmanı. Sonra, T50 tampon 100 ul ile aynı hizada inkübasyondan 1 dk. </li><li> Senin tek molekül görüntüleme için biotinli biyolojik moleküllerin ekleyin. </li></ol> 8. Geri Dönüşüm kaydırın Kuvars slaytlar Geri Dönüşüm. İkinci slaytlar lamelleri ve çift taraflı yapışkan bantlar kapalı alarak geri dönüştürülür. <ol><li> Kullanımdan sonra, musluk suyu içinde odacıkları saklayın. Su içinde uzun süreli inkübasyon bölmelerin sökülmesini kolaylaştırır. </li><li> Bir mikrodalga kullanarak musluk suyunda odaları kaynatın. Bir Pyrex beher kullanın. 10 dakika veya daha uzun süre kaynatın. </li><li> Bir jilet kullanarak lamelleri ve çift taraflı yapışkan bantlar çıkar. Kendi düzlemine dik bir kuvars slayt basmayın. Aksi takdirde, kırar. Uzak kanaldan jilet tutun. Otherwise, bu kanalda çizikler tanıttı. </li><li> Parmakları ile ovularak bir ev deterjan kullanılarak slaytlar durulayın. </li><li> Cam boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. Tipik haliyle 5-15 slaytlar tek bir kavanoza yerleştirilebilir. 10% ev deterjanı ekleyin ve 20 dakika ya da daha uzun süre için slaytlar ses dalgalarına maruz. Sekme büyük bir su miktarı ile slaytlar durulayın. </li><li> 1.2 Adım gidin. </li></ol>

<ol><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfaces+and+orientations%3A+much+to+FRET+about%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Surfaces and orientations: much to FRET about.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).</li>
<li>Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein-nucleic+acid+and+protein-protein+complexes%3A+surface+passivation+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization.</a> Methods. 52 (2), 192-200 (2010).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+system+for+single+molecule+fluorescence+measurements+of+surface-immobilized+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules.</a> J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).</li>
<li>Kingshott, P., Griesser, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+that+resist+biodegradation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Solid+St+M%22%5BJournal%5D)">Surface that resist biodegradation.</a> Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).</li>
<li>Elbert, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+treatments+of+polymers+for+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Surface treatments of polymers for biocompatibility.</a> Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).</li>
<li>Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+lipid+bilayers+and+DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies.</a> Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).</li>
<li>Kenausis, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28L-lysine%29-g-Poly%28ethylene+glycol%29+layers+on+metal+oxide+surfaces%3A+attachment+mechanism+and+effects+of+polymer+architecture+on+resistance+to+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption.</a> J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).</li>
<li>Groll, J., Star Moeller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((polymer+surface+passivation+for+single-molecule+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">polymer surface passivation for single-molecule detection.</a> Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).</li>
<li>Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyethylene+glycol+coatings+of+uptake+of+indocyanine+green+loaded+nanocapsules+by+human+spleen+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro.</a> J Biomed Opt. 16 (5), (2011).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> J Vis Exp. (37), e1689(2010).</li>
<li>Upadhyayula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coatings+of+polyethylene+glycol+for+suppressing+adhesion+between+solid+microspheres+and+flat+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces.</a> Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).</li>
<li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level%3A+introducing+the+tools+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).</li>
<li>Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+single-molecule+spectroscopy+to+macromolecular+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes.</a> Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318, 426-430 (2007).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol kapsamında kritik adım Bu amino-silanizasyon reaksiyondan önce yüzeyi hidrofilik hale getirmek için gereklidir. Bu, cam / kuvars yüzeyi üzerindeki serbest hidroksil grubu oluşturur pirana aşındırma yoluyla elde edildi. Yavaş yavaş iner yüzeyin hidrofil bu yana uzun bir süre için 2 H, O ya da hava ya da maruz kalan pirana kazınmış yüzey tutmak için önerilir. NHS-ester PEG molekülü reaktiftir. -20 º C&#39;de numuneler oluşturun ve azot altında bunları saklamak için tavsiye edilir Oda sıcaklığında APTES kimyasal raf ömrü kısa. Her ay bir yenisi ile değiştirmeniz tavsiye edilir. Bu protokolün Değişiklikler Eğer herhangi bir pratik bir nedenle piranha aşındırma kullanamazsınız zaman, zaman uzun bir süre için KOH kullanılarak aşındırma (örneğin oyeterli olmasını) e sahip ve hidroksil grubu da maruz yapacaktır. Bu alternatif yaklaşımın sıkan slayt ciddi çizikler nedeniyle birkaç geri dönüştürür sonra kullanılamaz hale geliyor. Bu genellikle floresan organik malzemeler 7 giderilmesinde etkilidir propan meşale kullanarak bir cam / kuvars yüzey yakmak için uygulanmaktadır. Bu piranha gravür yedekli olduğundan bu işlem bu protokolde yer değildi. Bu işlem potansiyel olarak hidroksil gruplarının oksidasyonu yol unutmayın. Bir yüzey ya da KOH pirana çözeltisi kullanılarak kabartma bir kez Bu nedenle, bu işlem gerçekleştirilebilir olmamalıdır. 7 &#39;den daha düşük pH değerine sahip bir tampon tek molekül görüntüleme için kullanıldığı zaman, PEG konformasyon pasivasyon derecesini azaltır &quot;fırça&quot; için &quot;mantar&quot; değişir. 7.0 &#39;dan daha düşük pH kullanıldığı zaman, bu nedenle, daha da disukinimidil tartarat &lt;kullanarak yüzeyi etkisizleştirmek için önerilirsup&gt; 7. Perspektifler Bu çalışma, yüksek kaliteli yüzey pasivasyon ulaşmak için sağlam bir protokol sağlamıştır. Bu protokol, protein 14 hem de hücre ekstreleri içinde protein kompleksleri ile ilgili ve 15 imüno olan tek molekül floresan çalışmaları için yararlı olacaktır. Bu, yaygın olarak kuvvet ve tork spektroskopisi spektroskopisi 16 gibi diğer tek molekül teknikleri kullanılacaktır. Ayrıca, bir yüzey 17 adsorbe hücreleri önlemek için yararlı olacaktır. Bu çalışmada verilen protokol, çok adımlı işlemler için talep edilir. Lipid-PEG 8 ve poli-lisin PEG 9 ile yüzey pasivasyon alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu yana, bunu uygulamak kolay olan herhangi bir kimyasal reaksiyonlar gerektirmez. Ancak, pasivasyon derecesi kimyasal modif yoluyla elde bu kadar yüksek değilBir yüzeyin ication.

Tek moleküllü protein çalışma yaparken bu deney, herhangi bir yüzey kaynaklı protein arıza veya denaturasyon 1,2 arınmış, böylece yüzey pasivasyon yüksek bir kalite elde etmek için gereklidir. , Sığır serum albümin gibi yüzey aktif maddeler, ile muamele edilmiş, bir cam yüzey, genel olarak, tek bir nükleik asit molekülü çalışmalar 3 için kullanılır iken, bu pasivasyon derecesi protein çalışmaları için yeterince yüksek değildir. Polimer (polietilen glikol, PEG) ile kaplanmış bir cam yüzeyi pasifleştirme performans 4-6 üstündür. Böylece, o bir tek-molekül floresan çalışmada 7-10 tanıtıldı beri tek-molekül protein çalışmaları için evrensel kullanılır hale gelmiştir. Polimer kaplama prosedürü birden fazla yüzey işlemleri 7,11,12 gerektirir. Bu nedenle, ayrıntılı talimatlar olmadan tüm prosedürü takip etmek zordur. Genellikle yüzey pasivasyon derecesi protokol i bağlı olarak değişirs izledi. İşte biz tek-molekül protein çalışmaların önemli darboğazları birini kaldıracak adım-adım talimatlar ile sağlam bir protokol mevcut. Genel bakış için Şekil 1&#39;e bakınız.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Slayt hazırlama ve temizleme</güçlü></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>VWR</td><td>631-0136 631-0144 631-0147</td><td>24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 &nbsp;( No.1&frac12;, Dikdörtgen)</td></tr><tr><td>Elmas matkap uçları</td><td>MTN-Giethoorn, Hollanda</td><td>LA-0564-00DB</td><td>3/4 mm</td></tr><tr><td>Duran sürgülü tutucu</td><td>LGS, Hollanda</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>Cam boyama kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>300101</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Boom</td><td>6233905</td><td>1 L, hidrojen peroksit %30. Açılmış şişeler 4 ° C'de saklanmalıdır.</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Boom</td><td>80900627.9010</td><td>Sülfürik asit %95-98</td></tr> <tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Potasyum hidroksit</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Branson</td><td></td><td>Masaüstü ultrasonik temizleyici, 3510</td></tr><tr><td>Kuvars slaytlar</td><td>Finkenbeiner</td><td></td><td>1" x 3", 1 mm kalınlığında</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>2. Lamel temizleme</güçlü></td></tr><tr><td>Duran sürgülü tutucu</td><td>LGS, Hollanda</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Potasyum hidroksit</td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Branson</td><td></td><td>Masa üstü ultrasonik temizleyici, 3510</td></tr><tr><td colspan="4">3. Slaytların ve lamellerin amino-silanizasyonu< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma</td><td>320099-500ML</td><td>Asetik asit, buzul</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-100ML</td><td>3-aminopropil trimetoksisilan. N < alt > 2 < / alt > altında oda sıcaklığında saklayın. Ayda bir kez değiştirin.</td></tr><tr><td>Şişe (200 ml)</td><td>VWR</td><td>Şişesi (200 ml)</td><td>Pyrex şişesi. Aminosilanizasyon için ayrılmış bir şişeniz olsun.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Branson</td><td></td><td>Masaüstü ultrasonik temizleyici, 3510<</td></tr><tr>td colspan="4"><güçlü>4. Polimer kullanarak yüzey pasivasyonu (ilk tur)</güçlü></td></tr><tr><td>Biotin-mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5.000&nbsp;Da. 1-2 mg'lık alikotları saklayın (10 slayt için yeterli) -20 &°C'de; N2 altında C.</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>mPEG-süksinimidil valerate (SVA), MW 5.000 Da. 80 mg'lık (10 slayt için yeterli) alikotları -20 &°C'de saklayın; N2 altında C.</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>5. Yüzey pasivasyonu (ikinci tur)</güçlü></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Dimetil sülfoksit BioReagent, moleküler biyoloji için, > % 99.9</td></tr> <tr><td>DST</td><td>Pierce</td><td>20589</td><td>Diseksinimidil tartarat</td></tr><tr><td>MS4-PEG</td><td>Pierce</td><td>22341</td><td>Kısa NHS-ester PEG, MW 333 Da. 100 mg MS4-PEG'yi 1.1 ml DMSO'da çözün. Mağaza 20 & l alikotlar -20 ° C'de.</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>6. Mikroakışkan bir odanın montajı< / güçlü></td></tr><tr><td>Çift yapışkan bant</td><td>Scotch</td><td></td><td>10 mm genişliğinde</td></tr><tr><td>Epoksi</td><td>Thorlabs</td><td>G14250</td><td>Devcon 5 dakika epoksi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1 KG</td><td>Sodyum klorür</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td>ImmunoPure NeutrAvidin Biotin Bağlayıcı protein. H2O'da 5 mg / ml'de stok 4 & ° C'de.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>S-888</td><td>4 derece<C'de H sub><2 / sub>O veya T50'de 50 mg / ml stoklayın.</td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 KG</td><td>Tris</td></tr></tbody></table>

tek molekül protein araştırmaları yüzey pasifleme

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Tek molekül floresan spektroskopisi nano biyolojik olayların geniş bir anlayış vesile olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknik, biyolojik bilimlerin verebilir ne önemli örnekleri protein-protein ve protein-nükleik asit etkileşimleri üzerinde mekanik anlayışlar vardır. Protein etkileşimleri, tek molekül düzeyinde problandı zaman, proteinler ya da alt-tabakalar, genellikle uzun süreli bir gözlem için izin veren bir cam yüzey üzerinde immobilize edilir. Bu immobilizasyon şeması istenmeyen yüzey eserleri tanıtmak olabilir. Bu nedenle, bu atıl hale getirmek için cam yüzeyi etkisizleştirmek için gereklidir. Polietilen glikol (PEG) ile yüzey kaplama spesifik olmayan bir cam yüzey ile etkileşim proteinleri önlenmesinde yüksek performans için öne çıkmaktadır. Bununla birlikte, polimer kaplama prosedürü nedeniyle yüzey için gereken yüzey işlemleri, bir dizi ve sıkı zorunluluğundan kaynaklanan komplikasyon için, zordurProsedürün sonunda herhangi bir flüoresan molekül arındırılmış olması. Burada, biz adım adım talimatları ile sağlam bir protokol sağlar. Bu pirana aşındırma, amin gruplarıyla yüzey işlevsellik ve son olarak PEG kaplama dahil olmak üzere bir yüzey temizleme kapsar. PEG tabakanın bir yüksek yoğunluk elde etmek için, oldukça pasivasyon kalitesini artırır iki tur boyunca PEG molekülleri ile yüzeyin muamele edilmesi için yeni bir strateji tanıtmak. Herkes yüksek kaliteli yüzey pasivasyon elde edebilirsiniz, böylece temsili sonuçlar yanı sıra her bir kritik aşama için pratik önerilerde bulunur.

Mikroakışkan odası montajı sonra (7.1 Adım - 7.6) ve Adım 7,7 yapmadan önce, bu PEGillenmiş yüzeyinin kalite kontrol yürütmek için tavsiye edilir. Yüzey pasivasyon başarılı bir şekilde yapılmış ise, en az 10, spesifik olmayan bir 1-10 nM, floresanla işaretlenmiş protein haznesine (sol Şekil 3a) ilave edildiğinde gözlenen bir görüntüleme alanı (25 mm x 25 mm) başına adsorbe edilmiş proteinler bulunmaktadır. Temizlik veya reaksiyon adımlardan biri düzgün yürütülen edilmediği zaman, non-spesifik sayısı önemli ölçüde artar proteinleri adsorbe ve CCD ekran floresan sinyalleri ile doymuş olabilir. Piranha dağlama atlanır Örneğin, gözlemlenen non-spesifik adsorpsiyon 100 kat daha büyük bir miktarı vardır (Şekil 3a; ortasında sol karşılaştırın). İkinci PEG&#39;leme adım atlanır edildiğinde, yaklaşık 3 saati vardısa spesifik olmayan adsorpsiyon gözlenen daha büyük miktarda (Şekil 3b). Süresi kimyasal maddeler (örneğin, APTES birkaç ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza) (veriler gösterilmemiştir) kullanıldığında PEGilasyon düşük derecede görülmektedir. Zaman önemli bir miktarda da PEGillenmiş beri geçti zaman yüzey kalitesi de düşer (Şekil 3a, sağ ile sol karşılaştırın). Bildiğimiz kadarıyla, bu PEGilasyonun iki tur tek-molekül çalışmaları için tanıtıldı ilk kez. PEGilasyonun iki tur PEG tabaka oluşumu (Şekil 3b) en yüksek kalitesini garanti eder. Çift PEGilasyonun üstün niteliği belirgin (Film 1b Film 1a karşılaştır) filmlerde gösterilir. Bu filmler, çözelti içinde floresan moleküller gelen arka plan sinyalleri çift PEGilasyon olduğu zaman, çok daha zayıf olduğu gözlenmiştir<html> proteinler, iki kat PEG&#39;lenmiş tabakası tarafından daha etkili bir şekilde püskürtüldü olduğunu gösterir, el. Bu iki aşamalı bir süreçtir şiddetle tavsiye edilir olsa deneme optimal olmayan pasivasyonu tolere ise, ikinci PEG&#39;leme adım atlanabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1:. Yüzey işlemleri şematik: (a) bir mikroskop lamı, aseton, KOH, ve pirana çözümleri ile temizlenir. Bu NHS-ester PEG ile APTES ve PEG&#39;lenmiş ile işlevlendirilmektedir. Gerektiğinde (b) bir örtücü cam, çözelti ile pirana KOH yanı sıra ile temizlenir. Bu NHS-ester PEG ile APTES ve PEG&#39;lenmiş ile işlevlendirilmektedir. fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Şekil 2:. Mikroakışkan odası (a) bir tek kanallı odası. Mikroskop lamı delinmiş iki delik vardır. Bu bir çift taraflı yapışkan bant, iki dilim kullanarak lamel ile monte edilir. (B) üç kanallı odası. Mikroskop lamı delinmiş altı delik vardır. Bu bir çift taraflı yapışkan bant, dört dilim kullanarak lamel ile monte edilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3: çözelti içinde boya etiketli proteinler ile çekilen CCD görüntüler. (A) CCD görüntüleri çözeltisi içinde 10 nM Cy3-labeld temsilcisi ile 60X objektif lens kullanarak prizma tipi toplam iç yansıma floresan mikroskop ile alınmıştır. (Sol) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı. (Orta) bir yüzey prepa olduBu makalede protokol aşağıdaki kırmızı, ama piranha dağlama geçildi. (Sağ) bir yüzey bu makalede protokol takip edilerek hazırlandı ve azot altında -20 ° C &#39;de 3 ay boyunca depolanmıştır. (B) çözeltisi içinde 10 nM Cy3-labeld Rep ile çekilen CCD görüntüler. (Sol) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı. (Sağ) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlanmıştır, ancak PEGilasyonun ikinci tur geçildi. Ölçek çubuğu = 5 um. Film 1: çözelti içinde boya etiketli proteinleri ile alınmıştır CCD film. CCD filmler çözelti içinde 10 nM Cy3-labeld temsilcisi ile 60X objektif lens kullanarak prizma tipi toplam iç yansıma floresan mikroskop ile alınmıştır. Zaman çözünürlüğü 100 msn. (A) bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı. (B) Bir yüzey bu makalede protokol izlenerek hazırlandı, ama oldu PEGyl ikinci turtirme geçildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">buraya tıklayın</a> Film 1a görüntülemek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">buraya tıklayın</a> Film 1b görüntülemek için.

Biz, polietilen glikol (PEG) kullanılarak bir cam yüzey pasifleştirilmesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yüzey temizleme, yüzey işlevselleştirilmesini ve PEG kaplama kapsar. Biz, mevcut yöntemlere kıyasla, pasivasyon üstün kalite sağlar ki, iki tur boyunca PEG molekülleri ile yüzeyin muamele edilmesi için yeni bir strateji tanıtmak.

Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Bu prosedürün genel amacı, üstün kalitede bir kuvars lam yüzeyi elde etmektir. Bu işlem, önce delikli kuvars lamların ve lamelllerin su ve aseton ile temizlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, yüzey kalitesini artırmak için lam, potasyum hidroksit ve piranha çözeltisi ile aşındırılır.Ardından, lamlar ve lameller amin grupları ile fonksiyonelleştirilir ve cam yüzeyi inert hale getirmek için bir polimer kullanılarak iki tur yüzey kaplama işlemi uygulanır. Son adım, mikroakışkan odağın, polietilen glikol kaplı veya pegyllenmiş yüzeyler birbirine bakacak şekilde lam ve lamelden monte edilmesidir. Nihayetinde, yüzeyin iki tur boyunca peg molekülleri ile işlenmesine dayalı yeni bir strateji, tek molekül floresan mikroskopisi ile gözlemlendiği üzere pasivasyon kalitesini önemli ölçüde artırmaktadır.Bu tekniğin veya potasyum oksit aşındırması sonrası polimer kaplama gibi mevcut tekniklerin temel avantajı, bu tekniğin üstün kalite garanti etmesidir. Bu yöntemde yeni olan kişiler, çok sayıda işlem uygulanması gerektiğinden zorluk yaşayacaklardır. Başlangıç için kuvars lamlar, metin protokolünde ayrıntılı anlatıldığı şekilde hazırlanır.Slaytları cam bir boyama kavanozuna yerleştirerek temizleyin. Genellikle tek bir kavanoza beş ila 15 slayt yerleştirilebilir. Ardından slaytları UE water ile durulayın; bu durulama işlemini üç kez tekrarladıktan sonra, kirleri temizlemek için slaytları beş dakika boyunca UE water ile sonikasyon işlemine tabi tutun, suyu boşaltın ve slaytları UE water ile üç kez daha durulayın.Ardından, UE suyunu asetonla değiştirin ve lamları asetonla 20 dakika veya daha uzun süre sonikasyona tabi tutun, asetonu dökün ve herhangi bir aseton kalıntısını gidermek için lamları Milli Q suyu ile durulayın. Sonra, suyu bir molar potasyum hidroksit ile değiştirin ve lamları 20 dakika veya daha uzun süre sonikasyona tabi tutun. Aşırı aşındırma yüzey kalitesini artıracaktır ancak floresan görüntülemeyi etkileyebilecek çiziklere yol açacaktır.Piranha aşındırması gerçekleştirmek için potasyum hidroksit kalıntılarını temizlemek amacıyla lamları üç kez Milli Q suyu ile durulayın. Lamları bir Duran lam tutucuya veya özel yapım bir Teflon tutucuya aktarın ve kimyasal çeker ocak içerisinde bulunan bir litrelik bir behere yerleştirin. Beheri 450 mililitre sülfürik asit ile doldurun.Ardından, sülfürik asit ve hidrojen peroksit arasında üçe bir oran sağlamak için 150 mililitre hidrojen peroksit ekleyin. Çözeltiyi uygun şekilde karıştırmak için karıştırın ve beheri 20 dakika boyunca rahatsız etmeden bekletin. Lamları piranha çözeltisinden çıkarın ve millieu suyu içeren bir lam tutucuya yerleştirin.Bu sırada, piranha çözeltisini belirlenmiş bir atık şişesine boşaltın. Oda sıcaklığına ulaştığında, lamları cover slip temizliğinde olduğu gibi üç kez UE water ile durulayın. Boyama kaplarındaki UE water'ı metanol ile değiştirin. Lamları ve cover slip'leri metanol içerisinde bekletin.Bu sırada, balona 100 mililitre metanol dökerek amino silanizasyon çözeltisini hazırlayın. Ardından beş mililitre asetik asit ve üç mililitre üç amino propil trimetilsilan ekleyip sallayarak nazikçe karıştırın. Lam ve lamel içeren boyama kaplarındaki metanolü, amino silanizasyon reaksiyon karışımı ile değiştirin.20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sırasında bir kez bir dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Ardından, amino adalaşma reaksiyonunu metanol ile değiştirin. Son olarak metanolü dökün ve taze bir metanol çözeltisi ekleyin.Yüzey fonksiyonelleştirmenin ilk turu için bu prosedürü, önce polimer kullanarak üç kez tekrarlayın; lamları ve lamelleri nitrojen gazı kullanarak kurutun. Ardından, pegillenecek tarafı yukarı bakacak şekilde, kısmen milli Q su ile doldurulmuş temiz pipet kutularına yerleştirin. Sonrasında, önceden hazırlanmış peg solüsyonuna, yeni hazırlanmış reaksiyon tamponundan 64 µL ekleyin.Tamamen çözünmesi için karışımı pipetle yukarı aşağı çekip bırakın. Ardından 16.100 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Hava kabarcıklarını gidermek için, pegilasyon karışımından 70 µL'yi kurutulmuş bir kuvars lam üzerine damlatın.Çözeltinin üzerine nazikçe kurutulmuş bir lamella yerleştirin; pegillenmiş lam ve lamellaları saklamak için slaytları karanlık ve nemli bir ortamda iki saatten gece boyuna kadar inkübe edin. Lamellayı yana doğru kaydırarak lam ve lamellayı dikkatlice birbirinden ayırın ve nitrojen gazı ile kurutmadan önce UE suyu ile durulayın. Bir çift lam ve lamellayı, pegillenmiş yüzeyler birbirine bakmayacak şekilde 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Tüpü kısmen kapatın ve nitrojen gazı ile doldurup kapağını sıkıca vidalamadan önce vakumlayın. -20 °C'de saklayın. Bu adımlar, pegillenmiş yüzeyin uzun süre korunmasına yardımcı olur.Slaytı bir mikroakışkan oda oluşturmak için kullanmadan hemen önce, metin protokolünde açıklandığı şekilde ikinci bir pegilasyon işlemi gerçekleştirin. Pegillenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde bir kuvars slaytı düz bir yüzeye yerleştirin. Slayt üzerine çift taraflı yapışkan bant yapıştırarak, pegillenmiş yüzeyde çapraz bir kanal oluşturun.Deliklerin kanalın merkezinde konumlandığından emin olun. Ardından, kanalı tamamlamak için pegyllenmiş bir kapatma lamini nazikçe üzerine yerleştirin. Pegyllenmiş taraf aşağı bakmalıdır.Kapak camını çift taraflı bandın yerleştirildiği alanların üzerine bastırarak hazneyi mühürleyin. Haznenin su sızdırmaz şekilde mühürlenmesi için bu işlemi nazikçe ancak eksiksiz bir şekilde yapın. Son olarak, haznenin kenarlarını epoksi yapıştırıcı ile kapatın.Metin protokolünde açıklandığı üzere, streptavidin veya nötr avidin immobilizasyonunu gerçekleştirin ve tek molekül görüntüleme için biyotinlenmiş biyolojik molekülleri ekleyin; yüzey işlemleri başarıyla tamamlandığında, gözlemlenen görüntüleme alanı başına non-spesifik olarak adsorbe olan protein sayısı 10'dan azdır. Kamaraya 1 ila 10 nanomolar floresan işaretli protein eklendiğinde, temizleme veya reaksiyon adımlarından herhangi biri uygun şekilde yürütülmemişse, non-spesifik olarak adsorbe olan protein sayısı önemli ölçüde artar. Örneğin, piranha aşındırma adımı atlanırsa, 100 kat daha fazla non-spesifik adsorpsiyon gözlemlenir.Çift pegilasyonun üstün doğası burada belirgin bir şekilde gösterilmektedir. Sol panelde gösterildiği üzere, çift pegilasyon kullanıldığında floresan moleküllerden ve solüsyondan gelen arka plan sinyallerinin çok daha zayıf olduğu gözlemlenmiştir. Bu durum, proteinlerin çift pegile edilmiş tabaka tarafından daha etkili bir şekilde itildiğini göstermektedir.Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde dört saatte tamamlanabilir. AYA ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken uygun eldiven, koruyucu gözlük ve önlük gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

surface-passivation-for-single-molecule-protein-studies

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Inorganik bir yüzeye proteinlerin non-spesifik adsorpsiyon izlemek için solid-state nanopores kullanarak bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak ve tek-molekül düzeyinde probed olması adsorpsiyon için izin, rezistif-pulse prensibi kullanmaktadır. Tek bir protein adsorpsiyon süreci denge noktasından uzak olduğu için, kantitatif protein adsorpsiyonu sabit görünen birinci dereceden reaksiyon hızı belirlenmesi yanı sıra ve Langmuir adsorpsiyon sabit sağlayan sentetik nanopores...

Solid-state Nanopores ile izlenmesi Protein Adsorpsiyon

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Bu iletişim kuralı tek boyutlu (1 D) Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin çalışmak için bir basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek molekül akışı uzanan tahlil göstermektedir.

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin, tek molekül floresan mikroskobisi için kuvars yüzeylerin iki aşamalı PEG kaplama ile pasifleştirilmesini. Bu yöntem, cam yüzeylerdeki spesifik olmayan bağlanmayı azaltarak görüntüleme kalitesini artırır.

Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme

Daha fazla video keşfet