Name: Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Keşfedin sinaptik vezikül geri dönüşümünü FM boyaları kullanarak sinir uçlarında görüntüleme yöntemini. Bu protokol uyarılmış ve spontan sinaptik aktiviteleri değerlendirmek için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu çalışmanın yürütülmesi boyunca yararlı tartışmalar için harata laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği, distoni Tıbbi Araştırma Vakfı, Edward Mallinckrodt, Jr Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı ve NCH için Whitehall Vakfı hibe tarafından finanse edildi

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Biz, spontan ve minyatür sinaptik aktivite uyarılmış ve destaining aşamasında görüntüleme için yanıt sinaptik veziküller boyama ve lekenin için protokoller tanımlamışlardır. Mevcut protokoller ek olarak, minyatür sinapsis aktivitesine dayandığı FM destaining gözlemleme yeni bir protokol dahil ettik. Bu protokolleri kullanarak, önceden hareket bozukluğu distoni bir fare modeli kültürlü nöronlar anormallikleri tespit. Yüksek etkinlik 20 ile uyarıldığında, vahşi tip farelerde muadilleri ile karşılaştırıldığında,...

Sinaptik veziküllerin işlevi sinaptik iletim önemli bir belirleyicisidir. Bunların presinaptik plazma zarı (ekzositozu) ile kaynaştırmak zaman bu veziküller nörotransmitter serbest bırakmak ve bunlar plazma zarı (endositoz) rejenere edilmiş ve nörotransmitter ile yeniden sonra serbest bir çevrimi için hazır hale gelir. Dinamikleri ve sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan mekanizmaları içine Araştırma ölçüde Stiril FM boyaların 1 tanıtımı ile birlikte ivme kazanmıştır. Pozitif (Şekil 1A, Şekil 1B FM1-43 StereoView birden boyalar) hidrofilik baş grupları ve hidrofobik kuyrukları ücret bu amfipatik moleküller, tersine çevrilebilir girmek ve onları nüfuz etmeden lipid membranlar çıkabilirsiniz. FM boyaların grupları yaydıkları ışık aralığını etkileyen benzer özellikler taşırlar. Örneğin, FM2-10, FM1-43 ve-84 FM1 iki siklik bileşikler ve sho arasında bir çift bağa sahipw yeşil emisyon. Aralarındaki fark, hidrofob belirler ve bu nedenle zardan çıkış hızı (departitioning), hidrofobik kuyruk uzunluğudur. FM5-95 ve FM4-64 durumlarda, üç çift bağlar siklik bileşikler bağlamak ve onlar kırmızı emisyon göstermektedirler. Bu boyalar, hidrofilik kısmına göre değişir. Vadesi hidrofilik çevreye hidrofobik ortam göreceli olarak kuantum veriminde bir artışa bağlı olarak, biyolojik zarların içine sokulur, tüm FM boyalar olarak, floresan yoğunluğu artar. Böylece FM şiddetindeki değişiklikler membran ciro değişiklikleri temsil eder. Farklı renk (emisyon spektrumları) ve hidrofobluğa FM sinaptik vezikül geri dönüşüm çok yönlü bir araştırma aracı boyar yapmak. Bu özelliklere bağlı olarak, FM boyalar çok sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz aşağıdaki şema (Şekil 2) uygun olarak kullanılmaktadır. NöronBu endositoz (boyama) yoluyla meydana olarak s sinaptik vesiküller (SVS) içine alınacak etkinleştirme, FM, boyayı ihtiva eden bir hücre dışı çözelti içinde banyo edilir. Daha sonra boya, boya içermeyen hücre dışı çözelti uygulanması ile yıkanır, bu, yani yalnızca aktif geçiren endositoz boya (Şekil 2, alt) ile yüklenir sinaptik veziküllerin bir küme içerir işlevsel sinir terminalleri, ortaya koymaktadır. Sonraki ekzositozu hücre dışı alanı için FM boya kaybı ve floresan bir eşlik eden kaybına neden olur (destaining, nedeniyle bir hidrofilik çevreye departitioning ve uzak ekzositoz sitesinden difüzyon hem de). Bu nedenle FM floresan yoğunluğundaki değişiklikler sinaptik vezikül ekso-ve endositoz göstergeleridir. FM boyalar, çeşitli organizmalar ve preparatlar 2,3 sinaptik veziküllerin leke ve destain için kullanılmıştır. Örnekler memeli Neur dahilÖnal kültürleri 4-9, memeli beyin dilimleri 10,11, nöromüsküler kavşakları 12,13, retina bipolar nöronlar 14,15 ve kokleanın 16 saç hücreleri. Genellikle bu tür deneylerde, boyama ve destaining hem yoğun nöron (uyarılmış aktivite) uyararak tetiklenir. Bir dış etmenin etkisi ile (kendiliğinden ve minyatür sinaptik aktivite) 9,17-19 yokluğunda olduğu gibi geri dönüşüm Ancak son zamanlarda, zayıf bir uyarıya yanıt olarak sinaptik vezikül geri dönüşüm aynı zamanda, analiz edilmiştir. Spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri hareket potansiyellerinin kendiliğinden ateş (Şekil 3) içeren önceki ile, dış uyaranların yokluğunda meydana olanlar olarak tanımlanmaktadır. Bu zayıf sinaptik faaliyetleri geniş uyarılmasıyla tetiklenen daha FM sinyalleri olarak daha küçük değişikliklerle ilişkilidir. Ölçüm gerektirir FM fluoresc değişimlerence yoğunluğu doğru sinaptik vezikül eksositosizini veya endositozu ama yoğunluğu yapay olmamasını değişiklikleri yansıtacak. Dışlayıcı bir nedeni FM boyalar ile, plazma zarının spesifik olmayan lekelenme varlığıdır. Bu bileşenin kademeli yıkama hatalı sinaptik faaliyetleri atfedilen edilecek ölçülen floresan yoğunluğunda kademeli bir değişim, yol açacaktır. Bu faktör (Protokolü bakınız) uygun yöntemlerle azaltılabilir. Dışlayıcı en önemli nedeni sinaptik keseler içinde tutulan FM boya photobleaching olduğunu. FM yoğunluğu ışıkla ağartma ilgili değişiklikler ölçülür biyolojik (sinaptik) değişikliklere göre küçük olmalıdır. Hassas kameralarının son gelişmeler, örneğin, elektron-çarparak şarj-kuplajlı aygıt (EMCCD) kamera, mümkün maruz kalma süresini kısaltarak ve fluorofor uyarmak için kullanılan ışığın yoğunluğunu zayıflatarak ışıkla ağartma en aza indirdiği bulunmuştur. Dışlayıcı bir başka nedeni bir sürüklenme in ışık mikroskobu odaklama seviyesi. Bir görüntüleme oturumu sırasında odak kayması mekanik ya da termal etkilere neden olabilir ve hatalı ölçülen floresan yoğunluğunda bir değişikliğe yol açacaktır. Burada, bu durum özellikle, minyatür sinaptik etkinliği, daha zayıf ya da herhangi bir stimülasyon bağlamında sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz etmek için FM boyaların kullanımı gerekli protokolleri ve donanım tarif etmektedir. Biz kültürlü kemirgen hipokampal nöronlar kullanarak ve destaining faz görüntüleme, uyarılmış ve spontan sinaptik olaylar sırasında veziküllerin boyama ve destaining örneklerini göstermektedir. Biz de sinaptik faaliyetleri herhangi bir FM boya kaybı yokluğunda, FM boya ağartmanın derecesini değerlendirmek nasıl gösterilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Sinyal üreteci</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;İzole stimülatör&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Düşük büyütmede hücre morfolojisinin değerlendirilmesi için kullanılır.</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>Minimal odak kayması ile yüksek çözünürlüklü floresan ve iletilmiş ışık görüntüleme için kullanılır.</td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>Su daldırma lensi önerilir. Görüntülenen yapı lamel yüzeyinden derin bir konumda değilse (&lt;i&gt;örneğin&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m) yağ daldırma lensi kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Filtre kübü</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>FM1-43 için 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em</td></tr><tr><td>Filtre kübü</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>FM4-64 için 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EMCCD kamera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>Bu EMCCD kamera, floresanın yüksek hassasiyetle tespiti için kullanılır.</td></tr><tr><td>Sıvı sirkülasyonlu soğutucu</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>Gürültüyü azaltmak amacıyla, -80&amp;deg;C sıcaklığı korumak için kameranın sürekli soğutulmuş su ile perfüze edilmesi için kullanılır.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>Bu ışık kaynağı, floresan uyarımının hızlı açma/kapama kontrolü için kullanılır.</td></tr><tr><td>Görüntü toplama yazılımı</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme hücresi</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı perfüzyon sistemi</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Dikkat: toksik reaktif. Dikkatli kullanınız.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Aldehit ile fikse edilebilir FM1-43 (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Aldehit ile fikse edilebilir FM4-64 (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Ionomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; dengeli tuz çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Medyum</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>Bu solüsyon, floresan görüntülemeyi etkileyecek olan fenol kırmızısı içermez.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dikkat: toksik reaktif. Dikkatli kullanınız.</td></tr><tr><td>Sakkaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

uyarılmış, spontan ve minyatür synaptic faaliyetleri sırasında fm boyalar kullanarak sinaptik vezikül geri dönüşüm sınavı

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Fonksiyonel sinir terminalleri sinaptik kesecikler ekzositoz ve endositoz tabi. Bu sinaptik vezikül geri dönüşüm etkili membran ciro ortaya styryl FM boyalar kullanılarak analiz olabilir. FM boyaların kullanılması için geleneksel protokolleri uyarılmış (uyarılmış) sinaptik etkinliği aşağıdaki nöronlar analiz etmek için tasarlanmıştır. Son zamanlarda, bu tür protokoller spontan veya minyatür sinaptik olaylar gibi zayıf sinaptik faaliyetleri, eşlik FM sinyallerini analiz için kullanılabilir hale gelmiştir. FM sinyalleri, bu küçük değişikliklerin analizi görüntüleme sistemi, yoğunluğu küçük değişiklikler tespit etmek için yeterince duyarlı olan, ancak büyük genlikli bu suni bastırılmış değişiklikler gerektirir. Burada, uyarılmış spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri, ve bir örnek olarak kültürlü hipokampal nöronlar kullanmak için uygulanabilir bir protokol açıklar. Bu, önemli olduğu için bu protokol, aynı zamanda, boyaların FM ışıkla ağartma oranını değerlendirmek için bir araç içeriryoğunluğundaki küçük değişiklikler görüntüleme eserler kaynağıdır.

Bir örnek olarak, sinaptik veziküllerin destaining zaman süreci (Şekil 4) için temsilci sonuçlar göstermektedir. Kültür hipokampal nöronlar spontan sinaptik etkinliği (adım 2.3) kullanılarak FM4-64 ile boyanmış ve boya içermeyen çözeltisi (çözelti 2 yıkama) ile yıkanmıştır. Görüntüleme spontan aktivite (adım 5.3) (sürekli çizgi ilk parçası, Şekil 4A) kullanılarak başlangıç ​​destaining zaman sürecini gösterir. Bu, yaklaşık 120 saniye boyunca 10 Hz saha uyarısıyla her bir (adım 5.1) ile ...

Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir.

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

examination-synaptic-vesicle-recycling-using-fm-dyes-during-evoked

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

FM boyalar sinaptik dinamiklerin anlaşılmasına çok değerli yardım edilmiştir. FMS normalde farklı stimülasyon sırasında floresan mikroskop altında takip edilmektedir. Ancak, elektron mikroskobu ile kombine FM boyaların Fotoçevrim sinaptik BOUTONS, diğer ultrastrüktür bileşenleri arasında, farklı sinaptik vezikül havuzları görselleştirme sağlar.

Styryl Boyaların Fotoçevrim kullanarak Synaptic veziküllü Havuzları incelenmesi

Merkezi sinir terminallerine ikmal ve belirli sinaptik vezikül (SV) havuzları seferberlik ölçmek için canlı bir floresan görüntüleme tekniği açıklanmıştır. SV geri dönüşüm iki tur bir iç kontrol sağlayan aynı sinir uçlarında izlenir.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

Bu video, bir floresan boya kullanarak channelrhodopsin eksprese eden Drosophila larvalarındaki nöromüsküler kavşaklarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için bir protokolü göstermektedir. Mavi ışık, channelrhodopsinleri aktive ederek kalsiyum akışına ve sinaptik vezikül ekzositozuna neden olur. Boya, nöronal membranlara entegre olur ve endositoz sırasında içselleştirilir, bu da floresanın artmasına neden olur. Daha fazla mavi ışık stimülasyonu, azaltılmış floresan ile gösterilen...

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo - ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.

FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

Biz optik bir tahlil sinaptik vezikül (SV) kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için açıklar. Bu iletişim kuralı bir presynaptic işaret ve protein ilgi ifade etmek için çift transfection ile birleştirerek presynaptic siteleri, onların sinaptik vezikül kapasitesi geri dönüşüm bulun ve faiz protein rolünü belirlemek için bize izin verir.

Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Keşfedin sinaptik vezikül geri dönüşümünü FM boyaları kullanarak sinir uçlarında görüntüleme yöntemini. Bu protokol uyarılmış ve spontan sinaptik aktiviteleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Daha fazla video keşfet