Name: Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Öğrenin, çokspektrumlu görüntüleme akış sitometrisi ile karbon nanotüplerin hücre içine alımını ve yerelleştirmesini istatistiksel olarak nicelendirmeyi. Bu yöntem nanotoksikoloji ve nanotıp alanlarında güvenlik değerlendirmesi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), Region Ile de France (sözleşme no E539) ve CNRS tarafından desteklenmiştir. Açık Erişim için EMD Milipore tarafından ödeme yapıldı.

1. Suda Dağılabilir Karbon Nanotüplerin (CNT'ler) Hazırlanması
<ol>
	<li>İlk CNT'leri 20 ° C'de bir banyo suyu sonikatöründe 20 dakika boyunca sonikasyondan önce hücre kültürü suyunda dağıtın. CNT'ler bir floresan prob ile işlevselleştirilirse, deney boyunca onları mümkün olduğunca ışıktan koruyun.</li>
</ol>
2. Hücreleri CNT'lerle Etiketleme
<ol>
	<li>% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin içeren DMEM ortamında 25 cm² plakalar üzerinde insan göbek damarı endotel hücrelerini (HUVEC) (örneğin) büyütün.</li>
	<li>Tam ortamda 0, 10, 20 ve 50 μg / ml konsantrasyonda CNT çözeltileri hazırlayın ve hücreleri 20 saat boyunca 37 ° C'de veya 20 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin (25 cm²'lik bir plaka için 2 ml CNT süspansiyonu).</li>
</ol>
3. Hücre Fiksasyonu
<ol>
	<li>Daha sonra inkübasyon ortamını çıkarın; hücreleri PBS ile durulayın, tripsinize edin ve hücreleri tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin. 1.200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı önce 4 ° C'de 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile, ardından korumak için PBS ile değiştirin. Gerekirse, hücreler işlemin bu aşamasında sitometri analizine kadar birkaç gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Her numune, 50 μl PBS'de konsantre edilmiş yaklaşık 106 hücre içermelidir. Analiz sırasında agregaları önlemek için bunları doğru şekilde askıya alın ve 50 μm'lik bir gözenekli boyayıcıdan süzün. 
	Not: Hücreleri korumak için her adımın çok nazik bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
</ol>
4. ImageStream Alımı
Hücrelerin görüntülerini almak için multispektral görüntüleme akış sitometresi ImageStream'i kullanın. 
Bazı noktalara saygı gösterilmelidir:
<ol>
	<li>Uyarlanmış bir büyütme seçin (burada 40X objektif kullanılır).</li>
	<li>Florokromlar kullanılıyorsa: 
	- florokrom içermeyen bir kontrol numunesi hazırlayın. 
	- Kullanılan her florokrom için tek renkli pozitif kontrollü hücreler hazırlayın 
	Numunelerinize ek olarak.</li>
	<li>FITC'yi uyarmak için lazer 488 nm'yi ve floresan emisyonunu toplamak için kanal 02'yi kullanın (bant geçişi 480-560 nm). Ek olarak, parlak alan (BF) ve karanlık alan (DF) için sırasıyla 01 ve 06 kanallarını da kullanın.</li>
</ol>
5. İşlem Sonrası - IDEAS Analiz Yazılımı (Versiyon 4.0)
<ol>
	<li>Elde edilen tüm olaylar arasında, analiz öncelikle tek hücrelerin popülasyonu ile sınırlandırılmalıdır: 'en boy oranını' (yani genişlik/yükseklik) ve 'hücre alanı'nı (BF'deki hücrelere uygulanan parametreler) temsil eden biparametrik bir nokta grafiği kullanın (Şekil 1). Standart bir alana ve 1'e yakın en boy oranına sahip ilgili bölgeye dahil edilen tek hücreler daha sonra çok hücreli olaylardan (geniş alan ve küçük en-boy oranı) ve döküntülerden (son derece küçük alan) ayırt edilir.</li>
	<li>Odaklanmış düzlemdeki hücreleri seçmek için, yüksek kontrastlı CNT'ler etiketli hücreler için uyarlanmış bir biparametrik nokta grafiği kullanın: BF görüntüsünde 'kontrast' ile 'RMS gradyanı' (bir görüntünün keskinlik kalitesini ölçer) arasında çizin - BF görüntülerinde hem düşük rms gradyanı hem de düşük kontrast gösteren odaklanmamış hücrelerin hariç tutulmasına izin verir (Şekil 1).</li>
	<li>
	<ol>
		<li>"En iyi bul özelliğini" kullanarak etiketli ve etiketsiz hücreler arasında en iyi istatistiksel ayrımı sağlayan parametreyi belirleyin. Çalışmamızda ortalama piksel nesne özelliği en uygun olan parametredir (Şekil 2).</li>
		<li>Test edilen konsantrasyonlar için alınan CNT'lerin miktarını karşılaştırmak için normalleştirilmiş frekansa karşı bu parametreyi kullanarak bir histogram izleyin (Şekil 3).</li>
		<li>Bu iki parametre arasındaki korelasyonu incelemek için 'BF'deki ortalama piksel nesnesi' (Notasyon: Ortalama Pixel_Object (M01, Ch01, Tight)_Ch01) ve 'DF'deki yoğunluk' (Intensity_MC_Ch06) biparametrik grafiğini izleyin (Şekil 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miktar tayini ayrıca maskeler aracılığıyla da değerlendirilir:
	<ol>
		<li>CNT'ler BF üzerinde güçlü bir şekilde emici koyu noktalar olarak göründüğünden, önce bu çalışmada 0-533 arasında değişen düşük yoğunluklu sınırlı bir piksel aralığı seçerek onlara tam olarak uyan bir eşik maskesi oluşturun (Maske 1, notasyon: Yoğunluk (M01, BF, 0-533)) (Şekil 5). Eşik yoğunluğunun seçimi, kontrol hücrelerine kıyasla etiketli hücreler üzerinde yapılır.</li>
		<li>Tersine, DF'nin yüksek yoğunluklu piksellerine (bu durumda 150-4095) uyan bir maske de oluşturun (Maske 2, notasyon: Yoğunluk (M06, DF, 150-4095)) (Şekil 6).</li>
		<li>Maskenin alanını kullanarak bir grafik çizin (1 veya 2; (notasyon: maske 1 için Area_Intensity(M01, BF, 0-533)): farklı konsantrasyonlarda CNT'lerin içselleştirilmesinin göreceli bir nicelleştirmesini sağlayacaktır (Şekil 7).</li>
		<li>Bu iki maske arasındaki korelasyon derecesini kontrol edin ('Maske 1'in alanı' ve 'Maske 2'nin alanı' biparametrik grafiği sayesinde) (Şekil 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücrelerdeki CNT'leri lokalize etmek için başka maskeler oluşturun:
	<ol>
		<li>Hücrenin iç kısmına uyan bir maske: Erode(M01, 7) - tüm hücrenin maskesine (M01) karşılık gelir (Şekil 8), bu da 7 piksel daha aşınmış (Şekil 9).</li>
		<li>Sadece Boole denklemini kullanarak zara uyan bir maske: M01 ve Erode(M01,7) değil - tüm hücrenin (M01) iç kısımdan çıkarılan maskesi (Erode(M01,7)) (Şekil 10).</li>
		<li>Membran üzerindeki koyu pikselleri (CNT'lere karşılık gelir) dikkate almak için maskeyi oluşturun: Yoğunluk (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533) (Şekil 11).</li>
		<li>Etiketli ve etiketsiz hücreler için alaka düzeylerini kontrol etmek için bir hücre koleksiyonuna uygulanan farklı maskeleri görselleştirin (Şekil 12).</li>
		<li>Siyah alan olarak adlandırılan 'Area_Yoğunluk (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533)' membran üzerindeki siyah pikselleri seçerek özellik alanını maskeye uygulayın. Membran üzerindeki CNT'lerin miktar tayinine izin verecektir. 
		 
		Son olarak, içselleştirilmiş CNT'leri sadece zar üzerinde adsorbe edilenlerden ayırt etmek için, zar üzerindeki siyah alanı tüm hücre üzerindeki siyah alana karşı çizin (yani, 'Area_ Yoğunluğu (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533' ve 'Area_ Yoğunluğu (M01, BF, 0-533)'). 
		 
		not: Aynı prosedür FITC-floresan sinyali için de uygulanır: FITC floresan yoğunluğunun artışını BF üzerindeki ortalama piksel sinyalinin azalmasıyla karşılaştırın veya BF üzerindeki koyu noktalar ile FITC floresan yoğunluğu arasındaki kolokalizasyonu karşılaştırın. Bizim durumumuzda, bu tür bir analiz ilgili değildir, çünkü floresan sinyali bir yandan BF'deki karanlık noktalarla ve diğer yandan DF'deki parlak alanla doğru bir şekilde eşleşmez, bu da CNT'lerin içsel özelliklerinin (ışık emiciliği ve saçılması) floresan probu ile ilgili sinyalden daha uygun olduğunu gösterir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tüm çizimler tek bir deneysel koşulda oluşturulduktan sonra, bir "istatistiksel rapor şablonu" oluşturun, şablonu .ast dosyası olarak kaydedin ve tüm veri dosyalarını toplu hale getirin.</li>
</ol>

<ol><li>Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promises%2C+facts+and+challenges+for+carbon+nanotubes+in+imaging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics.</a> Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).</li>
<li>De La Zerda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+photoacoustic+molecular+imaging+agents+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice.</a> Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).</li>
<li>Zavaleta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Raman+Spectroscopy+in+Living+Mice+for+Evaluation+of+Tumor+Targeting+with+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).</li>
<li>Welsher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+route+to+brightly+fluorescent+carbon+nanotubes+for+near-infrared+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice.</a> Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+cellular+uptake+and+expusion+of+single-wall+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> ACS Nano. 3, 149-158 (2009).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+mechanisms+of+functionalised+multi-walled+carbon+nanotubes+by+3D+electron+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging.</a> Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).</li>
<li>Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Carbon+Nanotubes+within+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells.</a> ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).</li>
<li>Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Cellular+Internalization+of+Nanoparticles+and+Bacteria+by+Multi-spectral+Imaging+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).</li>
<li>Qian, F., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Lineage-specific+Toll-like+Receptor-mediated+Signaling+in+Monocytes+and+Dendritic+Cells+from+Small+Samples+of+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).</li>
<li>Marangon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Carbon+Nanotube+Translocation+Assessed+by+Flow+Cytometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging.</a> Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).</li>
<li>Lacerda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mechanisms+of+chemically+functionalised+carbon+nanotubes+across+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes.</a> Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAl-Jamal%2C+KT+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+of+Transmembranal+Mechanism+and+Subcellular+Localization+of+Noncovalently+Modified+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

1. Değişiklik ve Sorun Giderme
Bu çalışmada ilk amaç, hücrelerdeki CNT'lerin miktarını ve lokalizasyonunu değerlendirmekti. Konfokal mikroskopi, floresan işaretleyici FITC8,14 ile işlevselleştirilmiş CNT'lerin hücre içi dağılımını değerlendirmek için a priori altın yöntem olabilirdi. Bununla birlikte, ana dezavantaj, tek hücreli görüntüleme ile sınırlı olması ve bu nedenle istatistiksel olarak anlamlı verilerin olmamasıdır. ImageStream, bu engellerin ötesinde çalışmaya izin verir: aslında, çok sayıda hücreyi (5.000-10.000) kısa sürede (<dk) tarayarak, her hücre için hücre altı çözünürlükte (0,5 μm) görüntüler sağlayan yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile geliştirilmiş istatistiksel olarak sağlam sonuçlar verir. Daha sonra tek görüntü analizine dayalı olarak büyük miktarda veriyi analiz etmeyi mümkün kılar.
Geleneksel akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında, ImageStream'in benzersiz avantajı, her hücrenin multispektral görüntülerini ve sinyal yoğunluğunun piksel piksel karşılaştırmasını sağlamaktır. Böylece ImageStream, yüksek verimli akış sitometrisinin istatistiksel gücünü, analiz edilen her hücre için konfokal görüntülemenin analitik avantajlarıyla birleştirir. Hücrelerde CNT'lerin etiketsiz nispi nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu için çok önemlidir.
2. Protokol İçindeki Kritik Adımlar
Kritik adım, her çalışmaya en uygun parametrelerin seçiminden oluşur. Bizim durumumuzda en iyi yol, analizi nanotüplerin absorpsiyon ve saçılma özelliklerine dayandırmaktı: BF'deki koyu lekelerin lokalizasyonu ile DF'deki parlak noktaların lokalizasyonu arasındaki iyi korelasyon, geliştirilen yöntemin ilgili ve güvenilir olduğunu desteklemektedir - ve hücre görüntüleme olmadan mümkün olmayabilirdi.
3. Tekniğin Sınırlamaları
CNT'lerin hücrelerde görselleştirilmesinin, yalnızca endozomal hücre içi veziküllerde birikme eğiliminde oldukları ve daha sonra güçlü emici ve saçılan noktalar olarak göründükleri için mümkün olduğu vurgulanmalıdır. Tek tek nanotüpler bu yönteme dayalı olarak tespit edilmemelidir, ancak sonunda açık bir sınırlama oluşturan floresan üzerinde tespit edilebilir. İkincisi, niceleme 'mutlak' değil, farklı etiketleme konsantrasyonları için ve kontrol etiketsiz hücrelerle karşılaştırıldığında görecelidir. Bazı nicel özellikler (ortalama piksel, yoğunluk vb.) mutlak parametrelerdir, diğerleri ise maske seçimine (eşik maskesi, yerelleştirme maskeleri) bağlıdır.
4. Mevcut Yöntemlere Göre Önemi
Floresan ile ilgili olarak, ImageStream analizi, FITC parlak sinyali ile diğer kanallardaki noktalar arasındaki CNT kümelerinin zayıf kolokalizasyonunu vurgular. Bu nedenle, floresansın CNT'lerin nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu için güvenilir bir gösterge olmadığı görülmektedir. Bununla birlikte, esas olarak floresan ölçümüne dayanan geleneksel akış sitometrisinin sınırlamasının üstesinden gelen multispektral yüksek verimli ImageStream, karbon nanotüplerin hücreler içinde lokalizasyonunu sağlarken, istatistiksel etiketsiz bir nicelemenin yolunu açar.
5. Gelecekteki Uygulamalar
Bu yüksek verimli istatistiksel nanometroloji yöntemi, hücrelerle etkileşime girdiğinde ışığın yüksek emilimini ve saçılımını gösteren herhangi bir nanomalzemeye genelleştirilebilir. Bu nedenle, nano-biyo-arayüz, nanotoksikoloji ve nanotıp araştırmaları için önemli uygulamalara sahip olabilir.

Son on yıllarda, nanopartiküllerin yeri geniş bir uygulama yelpazesinde önem kazanmıştır. Özellikle, karbon nanotüpler (CNT'ler), çeşitli teşhis ve tedavi uygulamaları için nanoaraçlar olarak giderek daha fazla araştırılmaktadır; Özel elektriksel, termal ve spektroskopik özellikleri sayesinde, CNT'ler çeşitli ilaçlar veya kontrast maddeler için dağıtım araçları olarak işlev görebilir veya doku mühendisliğinde de yer alabilir1.
Bununla birlikte, bu tür nanomalzemelerin potansiyel toksisitesi hakkındaki endişeler hala tartışılmaktadır, çünkü esas olarak CNT'lerin organizmadaki kaderi çok tartışmalı olmaya devam etmektedir. Gerçekten de canlı hücrelerde ve dokularda bunları tespit etmek ve ölçmek için uygun yöntemlerin eksikliği vardır: örneğin, Raman spektroskopisi, fotoakustik ve yakın kızılötesi fotolüminesans görüntüleme gibi teknikler önerilmiştir, ancak her yöntem nanotüplerin türüne ve / veya ortamlarına bağlı olarak sınırlamalar gösterir2-8.
Burada, önerilen yöntem, hücrelerdeki nanopartiküllerin tespiti ve miktarının belirlenmesi için uygulanabilir olabilir. Bu, hem akış sitometrisini hem de yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi birleştiren bir cihaz olan ImageStream'in kullanılmasıyla mümkün oldu. Büyük bir hücre arasında (5000 olay/sn'ye kadar) elde etmenin avantajlarını ve aynı anda her hücrenin istatistiksel verilerinin ve yüksek çözünürlüklü görüntülerinin faydalarını (0,5 μm uzamsal çözünürlük) birleştirir. Genel olarak, görüntüler bir CCD kamera kullanılarak toplanır ve hücrenin iki boyutlu gri tonlamalı bir temsilidir. Işık, görüntüdeki her piksel için nicelleştirilir ve floresansın veya hücre altı boyuta sahip bileşenlerin (örneğin BF'de) hem yoğunluğunu hem de konumunu tanımlar, böylece hücreleri görünümlerine göre ayırt etmek için güçlü bir yetenek sağlar9,10. 
Buradaki amaç, hücrelerdeki CNT'lerin dağılımının ve davranışının nicel bir değerlendirmesini sağlayacak bir nanometroloji yöntemi tasarlamaktı. Özellikle, bu yöntem CNT'lerin hücreler tarafından hücresel alımını, işlenmesini ve ekzositozunu incelemek için geliştirilmiştir. İlk olarak CNT'lerin karmaşık hücresel trafiğini ve ikinci olarak bu nanomalzemelerin hücreler arasındaki transferini kanıtladık: hücre içselleştirilmiş CNT'ler strese girdiklerinde konakçı hücrelerinden kaçarlar, hücre dışı boşlukta yurtdışına yayılırlar ve ister homotipik ister heterotipik olsunlar, saf hücreler tarafından yeniden içselleştirilirler11
'dir.
Önceki çalışma, CNT işlevselleştirmesine ve agregasyon durumuna bağlı olarak aktif veya pasif olmak üzere farklı hücre alım mekanizmalarının ortaya çıkabileceğini gösterdi12. Burada çok duvarlı CNT'ler, 1,3-dipolar siklo ekleme ve midasyon yoluyla işlevselleştirildi ve daha sonra bir floresan probu, izotiyosiyanat içinde floresan (FITC) ile türetildi. Transmisyon elektron mikroskobunda, hücreler tarafından ya sitozolik lokalizasyonla ayrı ayrı ya da çoğunlukla endozomal ve lizozomal bölmelerdebulunan demetler halinde içselleştirilmiş gibi görünmektedirler 11. ImageStream'de, kümelenmiş CNT'ler, BF'de koyu noktalar ve DF'de parlak noktalar olarak yüksek bir korelasyonla görünür ve CNT etiketli hücreler ile kontrol hücreleri arasında net bir ayrım sağlar. Öte yandan, CNT'lerle işlevselleştirilmiş floresan işaretleyici tarafından yayılan floresan sinyalinin dağılımı o kadar iyi bir şekilde kolokalize edilmedi: aslında, muhtemelen bir söndürme fenomeni nedeniyle, yeşil floresan noktalar BF ve DF üzerindeki noktalarla mutlaka eşleşmez. Bu, ilk olarak, ImageStream ile CNT'lerin tespiti için bir floresan probunun zorunlu olmadığını ve ikinci olarak - bir fortiori - CNT'lerin hem nicelleştirilmesi hem de lokalizasyonu için tam olarak temsil edilmediğini gösterir.
Nanopartiküllerin istatistiksel bir nispi nicelleştirmesini vermenin ötesinde, bu yöntem aynı zamanda hücrelerdeki CNT'lerin lokalizasyonu hakkında bilgi sağlar, yani örneğin hücrenin içindeki CNT'leri plazma zarına bağlı olanlarla ayırt eder. CNT'leri hücre görüntülerinde lokalize etme yeteneği, geleneksel akış sitometrisi analizininsınırlamasının üstesinden gelir 13. Prosedür burada, hücrenin belirli bölgelerine uyan maskelerin oluşturulması ve yüklü CNT'lere karşılık gelen koyu lekelerin seçilmesi yoluyla geliştirilmiştir.
Genel olarak konuşursak, bu yöntem, kullanılan nanopartiküllerin ışığı güçlü bir şekilde emebilmesi (ve/veya dağıtabilmesi) koşuluyla, hücrelerde görselleştirme veya niceleme ihtiyacını içeren çok çeşitli deneyler için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>ImageStream</td><td><a href="https://www.amnis.com/imagestream.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Amnis</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Çokspektrumlu görüntüleme sitometrisi ile hücreleri yerelleştirme ve karbon nanotüpler bağıl kantitasyonu

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Karbon nanotüpler (CNT'ler) gibi karbon bazlı nanomalzemeler, karbon bakımından zengin hücre yapılarından ayırt edilmesi çok zor olan bu tür nanopartiküllere aittir ve fiili olarak hücre ve doku seviyelerindeki dağılımlarını değerlendirmek için hala nicel bir yöntem yoktur. Burada önerdiğimiz şey, bir multispektral görüntüleme akış sitometresi (ImageStream, Amnis) kullanarak hücrelerdeki CNT'lerin saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren yenilikçi bir yöntemdir. Bu yeni geliştirilen cihaz, hem yüksek verimli hücreleri hem de yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi entegre ederek, böylece doğrudan akıştaki her hücre için görüntüler ve dolayısıyla istatistiksel olarak ilgili görüntü analizi sağlar. Her hücre görüntüsü, parlak alan (BF), karanlık alan (DF) ve floresan kanallarda elde edilir ve her hücre için sırasıyla ışık absorpsiyonu, ışık saçılımı ve floresan seviyesine ve dağılımına erişim sağlar. Analiz daha sonra, deneyin her koşulu için elde edilen 7.000-10.000 hücrenin her bir görüntüsünün piksel piksel karşılaştırılmasından oluşur. CNT'lerin lokalizasyonu ve miktarının belirlenmesi, CNT'lerin bazı özel içsel özellikleri sayesinde mümkün olmaktadır: güçlü ışık emilimi ve saçılması; gerçekten de CNT'ler, BF'de güçlü bir şekilde emilen koyu noktalar ve DF'de hassas bir kolokalizasyonla parlak noktalar olarak görünür.
Bu metodoloji, nanomalzemeler ve hücreler arasındaki etkileşimler hakkındaki çalışmalar üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir, çünkü bu protokol, ışığı yeterince güçlü bir şekilde emme (ve/veya dağıtma) yeteneğine sahip oldukları sürece, çok çeşitli nanomalzemeler için uygulanabilir.

ImageStream cihazının çalışma prensibine genel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir. Cihaz, Şekil 2'de CNT'lerle işaretlenmiş üç farklı hücre örneğinde gösterildiği gibi, akış halindeki her bir hücrenin aydınlık alan (BF), karanlık alan (DF veya yan saçılım ışığı) ve floresan kanallarını içeren birden fazla yüksek çözünürlüklü görüntüsünü üretir. Bu kanalların üst üste bindirilmiş görüntüleri de gösterilmekte olup, ilk bakışta korelasyonu örneklendirmektedir.
Tüm işlem sonrası analizlerin hücre görüntülemesine dayandığı göz önüne alındığında, odaklanmış hücrelerin seçimi çalışma için kritik öneme sahiptir (Şekil 3). Aslında, CNT'lerin varlığı, etiketlenmemiş hücrelere kıyasla hem kontrastta hem de gradyanda değişikliklere yol açar: önemli miktarda CNT internalize etmiş olan odaklanmış hücreler, düşük rms gradyanına (ki bu genellikle odaklanmış karşı odaklanmamış hücrelerin ayırt edilmesinde kullanılan tek parametredir) ancak aynı zamanda yüksek kontrasta sahip olma eğilimindedirler; bu durum, iki parametreli bir grafiğin neden temel teşkil ettiğini açıklar. Şekil 3'te odaklanmamış (sarı alan) karşı odaklanmış hücrelerin (mavi alan) ayrımı gösterilmektedir.
Hücre içine alınmış CNT'ler net bir şekilde ayırt edilebilmektedir - özellikle BF görüntülerinde güçlü emilimli koyu noktalar olarak görünürler (farklı etiketleme konsantrasyonlarının etkisini görmek için Şekil 4'e bakınız). Ayrıca, BF üzerindeki ortalama piksel sinyali analiz edilerek alımın göreceli bir nicelendirmesi yapılmıştır: Şekil 5'teki grafikler, CNT etiketleme konsantrasyonu ile beraber bu sinyalin önemli ölçüde arttığını göstermektedir (deney koşulu başına yaklaşık 7.000 hücre için sonuçlar).
İkinci olarak, CNT'lerin kantifikasyonu, BF'nin kısıtlı bir koyu piksel aralığına veya CNT varlığından kaynaklanan lekelere karşılık gelen DF'nin yüksek yoğunluklu piksellerine uygulanan maskeler aracılığıyla da gerçekleştirilebilir (Şekil 6'daki örneklere bakınız). Böylece, bu maskelerin alanının grafiğe dökülmesi, alımın artışını vurgulamaya olanak tanır (BF üzerindeki maske alanı ile örneklendirilmiş olan Şekil 7'de 0-533 aralığındaki pikseller seçilmiştir).
Ayrıca, BF ve DF üzerindeki lekeler arasındaki korelasyon, DF yoğunluğuna karşı BF ortalama piksel sinyali (Şekil 8'de olduğu gibi) (maskeden bağımsız analiz) veya BF üzerindeki maske alanı (Maske 1) ile DF üzerindeki alan (Maske 2) grafiğe dökülerek değerlendirilebilir.
Hücre içindeki CNT'lerin lokalizasyonu için oluşturulan prosedüre ilişkin olarak, Şekil 9A oluşturulan farklı maskeleri göstermektedir. Lokalizasyon maskelerinin sağlamlığının (varsayılan hücre maskesinin erozyonuna dayalı olarak), etiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücre koleksiyonu üzerinde görsel olarak kontrol edilmesi gerektiğini unutmayın. Tüm örnekler için aynı maskeler kullanılır.
Hücre membranındaki siyah lekelerin toplam alanının tüm hücredeki alana karşı grafiğe dökülmesi, 37 °C'de 20 sa boyunca inkübe edilen hücrelerin 4 °C'de 2 sa inkübasyon ile karşılaştırıldığında internalizasyon skorunu verir (bkz. Şekil 9B); bu durum, 4 °C'de CNT'lerin çoğunlukla membranda yer aldığını, 37 °C'de ise CNT'lerin hücrelerin %90'ından fazlasında internalize olduğunu göstermektedir.
Son olarak floresansla ilgili olarak, floresan lekeler ile BF (ve DF) üzerindeki lekeler arasındaki korelasyonun çok düşük olması nedeniyle bu parametre CNT'lerin kantifikasyonu için bir gösterge olarak kullanılmamıştır. Nitekim, FITC yoğunluğu ile parlak alan ortalama pikseli arasındaki korelasyon, -0,2'lik bir Pearson korelasyon katsayısını göstermektedir. Şekil 10'da, floresans sinyalinin parlak alan siyah lekesiyle uygun şekilde eşleştiği veya eşleşmediği iki durum örneklendirilmiştir.
<img alt="ImageStream optik düzeni: lazer uyarımı ve deteksiyonu ile akış sitometrisi kurulumunu gösteren diyagram." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. ImageStream'in genel çalışma prensibine genel bakış.Multispektral görüntüleme sistemi; brightfield, darkfield ve floresan olmak üzere üç farklı modda hücre başına 12 görüntüye kadar elde eder. Kurulum; 405, 488, 560 ve 658 nm dahil olmak üzere 5 uyarım lazerinden oluşur. Işık, küvetten akan hücrelerden farklı objektif lensleri (bu çalışmada 40X objektif lens kullanılmıştır) ile toplanır ve açısal bir dizilimdeki longpass filtre setinden oluşan spektral ayrıştırma elemanına aktarılır. Hücre görüntülerinden sorumlu CCD kamera, görüntüde iz oluşmasını önlemek için time-delay-integration adı verilen bir teknikle çalıştırılır. Genişletilmiş alan derinliği (EDF) bir seçenektir.
<img alt="Hücre görüntüleme, floresan mikroskopi, FITC işaretleme, parlak alan, karanlık alan, 2 μm ölçek, analiz." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. Karbon nanotüplerle (50 μg/mL) işaretlenmiş hücrelerin ImageStream ile farklı kanallar (Parlak Alan (BF), Karanlık Alan (DF), floresan (FITC) ve bunların üst üste bindirmeleri) üzerinden yakalanmış görüntü galerisi. Hücre içi lizozomlar içinde hapsolmuş CNT'ler, parlak alan görüntülerinde büyük siyah lekeler olarak görünür. Buna karşılık, karanlık alan ve floresan görüntülerinde parlak lekeler oluştururlar.
<img alt="Hücre görüntüleme analizi; gradyan RMS'ye karşı kontrast saçılım grafikleri; hücre morfolojisi verilerini içeren diyagram." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. Odak noktasındaki hücrelerin seçimi. BF görüntülerinde karekök ortalama (rms) gradyanına karşı kontrastı temsil eden iki değişkenli nokta grafiği, odak dışı hücrelerin elenmesini sağlar. Burada sarı alan odak dışı hücreleri, mavi alan ise odaklanmış hücreleri temsil eder. Odak dışı hücreler, parlak alan görüntüsünde hem düşük kontrast hem de düşük gradyan rms ile karakterize edilir. Odaklanmış hücrelerin CNT'ler ile etiketlendikten sonra ayırt edilebilmesi için rms gradyanına ek olarak kontrast özelliğine de ihtiyaç duyulur.
<img alt="Artan konsantrasyonlara hücresel yanıt; mikroskop görüntüsü; hücre morfolojisi değişikliklerinin incelenmesi." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 4"> 
Şekil 4. ImageStream ile görselleştirilen CNT'lerin doz bağımlı alımı. Hücrelerle inkübasyon sırasında (0-50 µg/ml aralığında), CNT dozuna paralel olarak aydınlık alan görüntülerindeki siyah noktaların sayısı ve alanı artmaktadır. Kontrol hücrelerinde siyah noktaların bulunmadığına dikkat ediniz.
<img alt="Statik denge ortalama piksel yoğunluğu grafiği; normalize edilmiş frekans; doz yanıtı; veri analizi." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 5"> 
Şekil 5. Aydınlık alan görüntülerine dayalı CNT alımının göreceli kantifikasyonu. Tüm hücreyi içeren "nesne" maskesine uygulanan ortalama piksel özelliğinin histogramları, kantifikasyon için kullanılabilecek doz bağımlı bir davranışı açıkça göstermektedir. R9 aralığı, CNT-pozitif hücreleri kapsamaktadır.
<img alt="Aydınlık ve karanlık alan mikroskobu görüntüleri, maske yoğunluk analizi, hücresel yapıların farklılaştırılması." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 6"> 
Şekil 6. BF görüntülerindeki siyah noktaları ve DF görüntülerindeki parlak noktaları seçen maskelerin oluşturulması. CNT'ler BF görüntüsünde güçlü absorbsiyon gösteren koyu noktalar olarak göründüğünden, bu çalışmada 0-533 arasında düşük yoğunluğa sahip sınırlı bir piksel aralığını seçmek için bir eşik maskesi oluşturulmuştur (Mask 1, notasyon: Intensity(M01, BF, 0-533)). Buna karşılık, yüksek saçılma alanlarına karşılık gelen DF'deki parlak noktaları seçmek için DF görüntüsündeki yüksek yoğunluklu piksellere (bu durumda 150-4095) uygun bir maske (Mask 2, notasyon: Intensity (M06, DF, 150-4095)) kullanılmıştır.
<img alt="Kontrol ile 50 μg/mL arasındaki farklı konsantrasyonlarda alan yoğunluğunun frekans dağılım grafiği." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 7"> 
Şekil 7. CNT'lerin doz bağımlı alımı, BF görüntülerindeki siyah nokta alanının nicelleştirilmesiyle gösterilmiştir. BF'ye uygulanan eşik maskesi (mask 1) kullanılarak, her bir hücre için siyah noktaların alanı nicelleştirilebilir ve doz bağımlı bir dağılım sergilendiği görülebilir.
<img alt="Scatter plot showing pixel intensity and object area analysis for image data comparison." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
Şekil 8. BF (absorpsiyon) ve DF (saçılma) görüntülerine dayalı CNT miktar belirleme yöntemleri koreledir. Solda, BF görüntüsündeki ortalama piksel karşı DF görüntüsündeki yoğunluk, CNT'ler ile işaretlenmiş hücreler için iyi bir korelasyon göstermektedir (50 µg/ml) (Pearson korelasyon katsayısı r = -0,68). Sağda, BF üzerindeki koyu lekeleri kapatan maske alanı karşı CNT'ler ile etiketlenmiş hücreler için DF'de maske uyumunun parlak noktalarının alanı (50 µg/ml). Pearson korelasyon katsayısı r = -0,83'tür. 7.000 hücreden elde edilen değerler grafiklenmiştir.
<img alt="Sıcaklık etkileri, saçılım grafikleri ve çeşitli koşullarda membran alan değerlendirmesini içeren hücre analiz diyagramı." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 9"> 
Şekil 9. Spesifik maskeler kullanılarak hücrelerdeki CNT lokalizasyonu. (A) Hücrenin belirli bir konumuna uygun maskeler oluşturulmuştur; soldan sağa doğru - tüm hücre, sadece membran ve hücre içi. Bir başka maske, eşik yoğunluğu sayesinde siyah noktalara uyum sağlar (Maske 1, notasyon: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) CNT'lerin lokalizasyon değerlendirmesi, A'da açıklanan lokalizasyon maskeleri kullanılarak hücrelerin farklı bölgelerindeki siyah noktaların alanı ölçülerek elde edilebilir. İçselleştirme yolunu inhibe etmek için inkübasyon, CNT'ler (50 µg/ml) ile hem 37 °C'de hem de 4 °C'de gerçekleştirilmiştir. Membrandaki siyah alanın tüm hücredeki siyah alana oranını temsil eden grafik, 4 °C'de membranda CNT'lerin doza bağlı bir absorbsiyonunu gösterirken, CNT'lerin tam içselleştirilmesi 37 °C'de etkilidir.
<img alt="Floresan mikroskobi, hücre analizi, FITC boyama, parlak alan ve floresan üst üste bindirme." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 10"> 
Şekil 10. BF üzerindeki CNT kaynaklı siyah noktaların FITC görüntüsündeki floresan parlak noktalarla kolokalizasyonu. Floresan parlak noktalar, BF üzerindeki siyah noktalarla her zaman aynı konumda değildir. Görüntülenen ilk iki hücre için düzgün bir eşleşme görülmekteyken, son iki hücre için görülmemektedir.

Bu çalışmada temel amaç, karbon nanotüplerin (CNT'ler) hücresel alımını ve nihai ekzositozunu izlemekti. Bu perspektiften bakıldığında, burada multispektral görüntüleme akış sitometrisini kullanan, istatistiksel olarak anlamlı sayıda hücrede CNT'lerin nicelleştirilmesine ve lokalizasyonuna izin veren benzersiz bir yöntem önerdik.

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istatistiksel olarak anlamlı sayıda hücrede karbon nanotüplerin hücresel alımını izlemek ve nicelleştirmek için nano metrolojik bir yöntem sağlamaktır. Bu, öncelikle hücrelerin, hücrelere konsantrasyona bağlı bir şekilde giren suyla dağılabilen karbon nanotüplerle işlenmesiyle gerçekleştirilir. Bu karbon nanotüpler daha sonra floresan bir işaretleyici ile işaretlenir.Ardından fiksasyondan sonra, her hücre çok spektrumlu görüntüleme akış sitometresinin parlak alan, karanlık alan ve floresan kanallarında görüntülenir. Karbon nanotüplerin dağılımını ve ışık absorbsiyonu, saçılan ışık ve floresan seviyelerini görselleştirmek için, nanotüp etiketlemesinin her hücrede piksel piksel oluşturduğu etki incelenir. Nihayetinde, hücreler içindeki doğal ışık absorbsiyonu ve saçılması, karbon nanotüplerin lokalizasyonuna ve kantifikasyonuna olanak tanır.Böylece bu yöntem, karbon bazlı materyallerin canlı hücrelerdeki etkileri ve akıbeti ile karbon nanotüplerin bir ilaç taşıma sistemi olarak potansiyeli gibi nanotoksikoloji ve nanotıp alanlarındaki yeni soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İşleme, floresan etikete bağlanmış karbon nanotüpleri hücre kültürü suyunda dağıtarak başlayın. Ardından nanotüpleri bir banyo sonikatöründe 20 °C'de 20 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Sonrasında nanotüpleri tam besiyerinde 0, 10, 20 ve 50 µg/mL konsantrasyonlarda dilüe edin ve ardından her bir dilüsyondan 2 mL'yi, her dilüsyon için bir adet 25 cm²'lik plaka içerisinde ilgili hücrelerle 37 °C'de inkübe edin. 20 saat sonra, inkübasyon besiyerini her plakadan uzaklaştırın ve karbon nanotüp etiketli hücreleri PBS ile durulayın.Yıkamanın ardından, her plakadaki hücreler tripsin ile ayrıştırılır ve ardından komple DMEM besiyerinde yeniden süspande edilir. Sonrasında, her örnek ayrı 15 mililitrelik falcon tüplerine aktarılır ve hücreler oda sıcaklığında 200 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjlenir. Her bir pelet, dört derece Celsius'ta bir saat boyunca %4 paraformaldehit içerisinde yeniden süspande edilir.Fiksasyondan sonra, hücreleri tekrar santrifüjle çöktürün ve her bir pellet örneğini 150 µL PBS içinde 15 × 10⁵ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Ardından, hücrelerin görüntülerini bir multispektral görüntüleme akış sitometresi (ImageStream) ile elde etmek için örnekleri ayrı ayrı 50 mikronluk ağ süzgeçlerden geçirin.Öncelikle, uygun bir büyütme seçin ve ardından ilgilenilen örnekleri görüntüleyin. Karanlık alan görüntüleme için 685 nanometre lazer kullanın ve akış sitometresini ayarlayın. Karanlık alan emisyonunu 745 ile 800 nanometre band geçiren filtrede toplamak için altıncı kanalı kullanın.Görüntü analizi için örnekleri bir numaralı parlak alan ve altı numaralı karanlık alan kanallarında görüntüleyin. İlk olarak, hücre alanı ile genişlik/yükseklik en-boy oranını karşılaştıran parametrik bir nokta grafiği oluşturun. Bu işlem; standart alana ve bire yakın en-boy oranına sahip tek hücrelerin, geniş alana ve düşük en-boy oranına sahip çok hücreli yapıların ve son derece küçük alan sergileyen döküntülerin birbirinden ayırt edilmesini sağlar.Tek hücrelerin doğru şekilde seçildiğini doğrulamak için hücre görüntülerini kullandıktan sonra, düşük karekök ortalama gradyanlı ve düşük kontrastlı odak dışı hücrelerin hariç tutulmasını ve odak düzlemindeki hücrelerin seçilmesini sağlamak için kontrastı karekök ortalama gradyana karşı çizdirerek yüksek kontrastlı karbon nanotüp işaretli hücreler için biparametrik bir nokta grafiği oluşturun. Ardından, işaretli ve işaretlenmemiş hücreler arasında en iyi istatistiksel ayrımı sağlayan parametreyi belirlemek için en iyi özelliği bulma aracını kullanın. Örneğin, bu temsili deney için ortalama piksel nesne özelliği en uygun olanıdır.Ardından, her bir deneysel konsantrasyonda hücreler tarafından alınan nanotüplerin kantifikasyonu için bir histogram oluşturmak amacıyla bu parametreyi normalize edilmiş frekansa karşı grafiğe dökün. Şimdi, parlak alan üzerindeki ortalama piksel nesnesi ile karanlık alan üzerindeki yoğunluk için biy-parametrik bir grafik çizin. Bu iki parametre arasındaki korelasyonu kontrol etmek için, karbon nanotüpler parlak alan kanalında yoğun koyu noktalar olarak göründüğünden, hücre görüntüleri üzerinde işlem yapılarak nanotüp kantifikasyonu da değerlendirilir; eşik maskesini oluşturmak için, örneğin sıfır ile 533 arasında düşük yoğunluklu kısıtlı bir piksel aralığı seçerek koyu nanotüplere tam olarak uyan bir maske oluşturun ve karanlık alan kanalında parlak görünen nanotüpleri görselleştirmek için maske iki olarak adlandırılan ikinci bir maske oluşturun.Yüksek yoğunluğa sahip bir piksel aralığı seçin. Örneğin, bu deney için 150 ile 4.095 arası bir aralık seçilmiştir. Ardından, ya parlak alan maske birini ya da karanlık alan maske ikisini kullanarak, nanotüplerin göreceli internalizasyonunu nicelleştirmek için bir nokta grafiği (dot plot) oluşturun.Örneğin, maske iki ile karanlık alanın karşılık geldiği altıncı kanaldaki alanı, maske bir ile aydınlık alanın karşılık geldiği birinci kanaldaki alana karşı grafiğe dökün. Maske bir ve maske iki arasındaki doğrusal korelasyonu belirledikten sonra, önce tüm hücrenin bir maskesini oluşturup ardından maskeyi aşındırarak sitoplazma içindeki nanotüpleri görselleştirin. Hücrenin iç kısmını görmek için artık erode M 0 1 7 olarak adlandırılan maskeyi yedi piksel aşındırın.Hücre membranı içindeki karbon nanotüpleri görselleştirmek için M zero one and not erode M 0 1 7 Boole denklemini kullanın. Bu, membran üzerindeki koyu pikselleri değerlendirmek amacıyla, yalnızca membranın bir maskesini oluşturmak için hücrenin tamamının maskesinden hücrenin iç kısmının çıkarılması işlemidir. Membran maskesine brightfield mask one'ı uygulayın.Etiketli ve etiketlenmemiş örnekler arasındaki farkı doğrulamak için tüm bu maskeleri aynı anda birden fazla hücreye uygulayın. Ardından, hücre membranındaki karbon nanotüpleri nicelleştirmek için özellik alanı (feature area) aracını kullanarak membrandaki siyah pikselleri seçin. Son olarak, internalize olan karbon nanotüpleri membranda absorbe olanlardan ayırt edin.Membranın siyah alanını tüm hücrenin siyah alanına karşı grafiğe dökün. Bir deney koşulu için tüm grafikler oluşturulduğunda, bir istatistiksel rapor şablonu oluşturun. Şablonu A ST dosyası olarak kaydedin ve tüm veri dosyalarını toplu işleme tabi tutun.Görüntü akış cihazı, burada üç farklı nanotüp etiketli hücre ile gösterildiği gibi, akış sitometresindeki her bir hücrenin parlak alan, karanlık alan ve floresan kanalları dahil olmak üzere birden fazla yüksek çözünürlüklü görüntüsünü üretir. Bu kanalların üst üste bindirilmiş görüntüleri de gösterilmiştir. Karbon nanotüplerin varlığı, etiketlenmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında, etiketli hücrelerin hem kontrastında hem de gradyanında değişikliklere neden olur.Bu nedenle, odak hücrelerinin seçimi için bi-parametrik bir nokta grafiğinin (dot plot) oluşturulması önemlidir. Sarı renkteki odaksız hücreler, nanotüp etiketlemesinin varlığına veya yokluğuna bakılmaksızın, düşük kontrastları ve düşük karekök ortalama gradyanları ile ayırt edilebilir. Etiketlenmemiş odak hücreleri de düşük kontrast sergiler; ancak odak hücreleri nanotüplerle etiketlendiğinde yüksek bir karekök ortalama gradyan gösterirken, hücreler yüksek kontrast ve düşük karekök ortalama gradyan profili sergiler.İçselleştirilmiş karbon nanotüpler, özellikle yoğun koyu lekeler şeklinde göründükleri Brightfield kanalında kolayca ayırt edilebilirler ve bu lekelerin alanları nanotüp konsantrasyonu ile birlikte artar. Brightfield görüntülerinin ortalama piksel sinyalleri analiz edildiğinde, nanotüp alımının göreceli bir kantifikasyonu belirlenebilir. Örneğin, bu histogramlar, nanotüp işaretleme konsantrasyonundaki her artışla birlikte nanotüp alımında meydana gelen anlamlı artışı göstermektedir; ayrıca karbon nanotüp kantifikasyonu, ya bir brightfield görüntüsü içindeki sınırlı bir koyu piksel aralığına ya da nanotüplerin bulunduğu alanlara karşılık gelen darkfield içindeki yüksek yoğunluklu piksellere uygulanan maskeler aracılığıyla da gerçekleştirilebilir.Bu maskelerin alanlarının çizdirilmesi, karbon nanotüp alımının daha ileri düzeyde kantifikasyonuna olanak tanır. Ek olarak, parlak alan ve karanlık alan görüntülerindeki noktalar arasındaki korelasyon, karanlık alan yoğunluğuna karşı parlak alan ortalama piksel sinyalinin çizdirilmesiyle veya parlak alan içindeki maske alanının karanlık alan içindeki alana karşı çizdirilmesiyle değerlendirilebilir. Sonraki iki şekilde, hücrenin iç kısmında yerelleşmiş karbon nanotüplerin analizleri gösterilmektedir.Bu ilk görüntüler, oluşturulan farklı maskeleri göstermektedir. Varsayılan hücre maskesinin erozyonuna dayalı lokalizasyon maskelerinin sağlamlığının, etiketli ve etiketsiz hücre koleksiyonu üzerinde görsel olarak kontrol edilmesi gerektiğini unutmayın. Bu nokta grafiklerinde gösterildiği gibi, internalizasyon skorunu belirlemek için hücre membranındaki siyah noktaların toplam alanı ile hücrenin tamamının alanının karşılaştırmalı grafiği çizilmiştir.4 °C'de iki saat boyunca inkübe edilen hücrelerle karşılaştırıldığında, 37 °C'de 20 saat boyunca inkübe edilen hücrelerde karbon nanotüplerin çoğunlukla membran üzerinde yer aldığı görülürken, 37 °C'de karbon nanotüpler hücrelerin %90'ından fazlasında içselleştirilmiştir. Floresan lekeler ile aydınlık ve karanlık alan kanallarındaki lekeler arasındaki korelasyonun çok düşük olması nedeniyle, karbon nanotüp floresansı karbon nanotüp içselleştirmesinin iyi bir göstergesi değildir. Nitekim, fitzy yoğunluğu ile aydınlık alan ortalama pikseli arasındaki korelasyon, -0,2'lik bir Pearson korelasyon katsayısına işaret etmektedir.Bu görüntülerde gösterildiği üzere, floresan sinyali parlak alan siyah noktalarıyla güvenilir bir şekilde örtüşmemektedir; karbon nanotüpler, hücre içi lizozomlar içindeki sınırlanma ve agregasyon floresan sinyalini kısmen söndürmüştür. Buna karşılık, dağılmış nanotüpler gelişimden sonra daha güvenilir bir floresan sinyali verebilir. Bu teknik, nanoteknoloji ve nanotıp alanındaki araştırmacıların, istatistiksel yüksek kapasiteli bir sitometri yöntemi kullanarak canlı hücrelerin karbon tabanlı nanomalzemelerle veya yüksek absorbsiyon ve ışık saçma kapasitesine sahip herhangi bir nanomalzemeyle olan etkileşimini keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.

localization-relative-quantification-carbon-nanotubes-cells-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Bu video, nöronal hücrelerin mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri, mitokondriyal DNA ile ilişkili protein ve mitokondriyal dış zar proteini için antikorlarla etiketlenmesini ve ardından seviyelerini ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir.

Nöronlarda Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Ölçülmesi

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

İn vitro mikronükleus tahlil genotoksisite ve sitotoksisite değerlendirmek için iyi kurulan bir yöntemdir ama manuel mikroskobik kullanarak tahlil Puanlama zahmetli ve subjektif ve inter-scorer değişkenlik muzdariptir. Bu yazıda, multispektral görüntüleme akışı sitometrisi kullanılarak testin tam otomatik bir sürümünü gerçekleştirmek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Anodik ark deşarjı çeşitli karbon nanoyapıların sentezlemek için en pratik ve verimli yöntemlerden biridir. Ark kontrol edilebilirlik ve esnekliğini artırmak için, homojen olmayan bir manyetik alan, büyük ölçekli grafen gevreği ve yüksek saflıkta tek duvarlı karbon nanotüpler, tek adımlı bir sentez süreci ile tanıştı.

Tek duvarlı Karbon Nanotüpler Eşzamanlı Sentezi ve Manyetik geliştirilmiş Arc Plazma Grafen

Öğrenin, çokspektrumlu görüntüleme akış sitometrisi ile karbon nanotüplerin hücre içine alımını ve yerelleştirmesini istatistiksel olarak nicelendirmeyi. Bu yöntem nanotoksikoloji ve nanotıp alanlarında güvenlik değerlendirmesi için kullanılır.

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Daha fazla video keşfet