Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çok merkezli somal insan kanser hücrelerinde mitoz sırasında filantr türevi PJ 34'ün sitotoksik etkisini gözlemlemektir. Bu, centrosomların GFP gama tubulin ile ve kromozomların transfeksiyon yoluyla H iki B red ile işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. Transfeksiyonun amacı, canlı çok merkezli somal kanser hücrelerinde mitoz sırasında centrosomların göçü ve kümelenmesi ile kromozomların diziliminin izlenmesini sağlamaktır.

İkinci adım olarak, transfekte edilen hücrelerin bir kısmı, ekstra sentrozom temizleyici bir ajan olarak görev yapan PJ 34 molekülüne maruz bırakılır. Ardından, sentrozom ve kromozom migrasyonu ile ilişkili mitoz sırasındaki olayları yakalamak amacıyla transfekte edilmiş canlı kanser hücreleri konfokal mikroskopi ile taranır. Elde edilen ardışık görüntülerin yeniden düzenlenmesi veya kümelenmesi, canlı hücrelerin konfokal görüntülemesine dayanarak, mitoz sırasındaki kanser hücrelerinde PJ 34 uygulamasının temizleyici ve sitotoksik etkilerini göstermektedir.

Bu tekniğin etkileri, mitoz sırasında yalnızca otozomal kanser hücrelerini yok eden hedeflenmiş bir kanser tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu tekniği, Sheba Tıp Merkezi Kanser Araştırma Merkezi'nden iş birliği yaptığımız Dr. Asher Castillo ve Telaviv Üniversitesi Sacko Tıp Fakültesi görüntüleme biriminden Dr. Leonid Middleman gösterecektir. M-D-A-M-B 231 meme kanseri hücrelerini canlı konfokal görüntüleme için hazırlamak amacıyla, 35 mm çapındaki polidizayn kaplı cam tabanlı kültür kaplarına 2 × 10⁵ hücre ekleyin ve complete medium içerisinde 37 °C'de %5 CO₂ altında inkübe edin.

Hücre kültürü, %60 ila %70 konfluense ulaştığında transfeksiyon için hazır hale gelir. Hücreler, biri sentrozomların floresan tespiti için gamma tubulin ve GFP kodlayan, diğeri ise kromozomların floresan tespiti için histone red kodlayan iki plazmit ile transfekte edilecektir; transfeksiyon, üreticinin protokolü takip edilerek lipozomal transfeksiyon reaktifi jet PI kullanılarak gerçekleştirilir. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve ardından hücre besiyerini iki mililitre takviye içermeyen ılık DMEM ile değiştirin. Transfeksiyon karışımını DMEM içindeki hücrelere nazikçe ekleyin ve ardından hücreleri sekiz saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

DMEM'i iki mililitre komple besiyeri ile değiştirin ve hücreleri inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan sonra, besiyerini 20 µM PGA 34 içeren iki mililitre komple besiyeri ile değiştirin.

Canlı konfokal görüntülemeden önce hücreleri 18 saat daha inkübe edin. Canlı konfokal görüntüleme tarayıcı ayarlarının teknik parametreleri şunlardır: Tarama modu XYZT, pinhole airy 1.00, zoom 3.5, çözünürlük sekiz bit, lazer DPSS 561 nanometre, argon görünür lazer 488 nanometre, helyum neon görünür lazer 633 nanometre.

Objektif H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63x 1.40 Yağ UV sayısal açıklık 1.4. Tarama hızı 700 hertz ve kırılma indisi 1.52. Hücreleri, %5 karbon dioksit ve 37 °C sıcaklıkta tutarak bir görüntüleme odacığında en az 16 saat boyunca canlı konfokal görüntülemeye tabi tutun.

Transfeksiyon etkinliği floresan mikroskobu ile incelenecektir. Bu prosedüre, her kuyucuğunda bir lamel bulunan altı kuyucuklu bir plakaya, iki mililitre komple ortam içerisinde 2 × 10⁵ MDA MB 231 hücresi ekerek başlayın. Hücreleri, üretici protokolünü takip ederek lipozomal transfeksiyon reaktifi jet PI kullanarak daha önce olduğu gibi transfekte edin.

Transfeksiyondan 36 saat sonra. Lamel üzerine yerleştirilen transfekte hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra her kuyucuktaki besiyerini uzaklaştırın. Hücreleri, -20 °C'de yedi dakika boyunca bir bir oranında metanol ve aseton içeren soğuk bir çözeltide inkübe ederek fikse edin.

Yedi dakika sonra, fiksasyon solüsyonunu aspire edin ve üzerinde hücrelerin olduğu lamelin kimyasal çekmecede 30 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Ardından, DPI içeren prolonged gold anti-fade reaktifini uygulayın ve lamelin karanlıkta altı saat boyunca kurumasını bekleyin. Lamı floresan mikroskop altında inceleyin ve kırmızı ile yeşil sinyallere sahip transfekte hücrelerin yüzdesini hesaplayın.

Toplam hücre popülasyonu içinde, 100 ila 200 hücre sayıldığında istenen transfeksiyon yüzdesi yaklaşık %20 ila %40'tır. Bu prosedüre başlamak için, altı kuyucuklu bir plaka içindeki cam lameller üzerinde, 2 mL komple besiyerinde 2 × 10⁵ MDA-MB-231 meme kanseri hücresi ekimi yapın. Besiyerine PJ 34 ekleyin ve hücreleri gerekli süre boyunca inkübe edin.

İnkübasyon süresi tamamlandığında, lamelleri bir kez PBS ile yıkayın ve hücreleri, -20 °C'de yedi dakika boyunca bir bir oranında buz gibi soğuk metanol ve aseton çözeltisi içinde inkübe ederek sabitleyin. Ardından, sabitleme çözeltisini aspire edin ve lamellerin kimyasal çeker ocak altında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. Hücre membranlarını permeabilize etmek için lamelleri bir kez PBST ile yıkayın ve ardından hücreleri, oda sıcaklığında bir saat boyunca PBST içindeki %10 normal eşek serumu ile bloke edin.

Bloklama çözeltisine anti-alfa tubulin ve anti-gamma tubulin primer antikorlarını ekleyip vorteksleyerek ilk antikor karışımını hazırlayın. Ardından, altı kuyucuklu bir plaka kapağındaki her bir lam için 100 µL antikor karışımı uygulayın. Lamı ters çevirip nazikçe antikor damlasının üzerine yerleştirin ve iki saat boyunca inkübe edin.

Oda sıcaklığında ekleme yapın. Bu işlem iğ ipliklerini ve sentrozomları boyayacaktır. Lamelleri kuyucuklara geri yerleştirin ve hücreleri PBST ile üç kez yıkayın.

Ardından, altı kuyucuklu bir plaka kapağı üzerine lamel başına 1 damla olacak şekilde LOR 488 ve LOR 568 sekonder antikorlarını ekleyin. Daha sonra lameleri antikor damlalarının üzerine yüzleri aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Sekonder antikorlarla inkübasyon tamamlandığında, lameleri kuyucuklara geri yerleştirin ve hücreleri PBST ile üç kez yıkayın.

Son olarak, lamelleri prolonged gold anti fade reaktifi kullanarak kapatın ve sabitlenmiş hücreleri konfokal mikroskopi ile görüntülemeden önce kurumaları için oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca inkübe edin. PJ 34, daha önce iki sentrozoma ve bifokal iğlere sahip mitoz geçiren normal hücrelere zarar vermeden, çoklu sentrozomlu kansertli hücreleri seçici olarak yok ettiği gözlemlenmiş, stabil ve suda çözünür bir phant rodine'dir. Bu çalışmada, PJ 34'ün sitotoksik aktivitesi, ekstra sentrozom oluşumunun yüksek olduğu canlı insan meme kanseri M-D-A-M-B 231 hücreleri kullanılarak incelenmiştir.

Gamma tubulin odaklarını işaretlemek için gamma tubulin GFP ve kromozomları işaretlemek için histone H two B red kullanılarak hücrelere transfeksiyon yapılmıştır. M-D-A-M-B 231 hücrelerinin konfokal görüntüleme ile en az 16 saat boyunca taranması, aşağıdaki video kliplerde gösterildiği üzere, mitozdaki hücrelerin çoğunda ekstra sentrozom bifokal kümelenmesini temsil eden sentrozomların bifokal kümelenmesini ortaya çıkarmıştır. Bu ilk video, mitoz sırasında rastgele seçilmiş, sentrozomları gamma tubulin ile yeşil olarak işaretlenmiş bir canlı hücreyi göstermektedir.

İkinci videodaki GFP ile, histon H2B kırmızı ile transfekte edilmiş rastgele seçilmiş bir MDA-MB-231 hücresinde mitoz sırasında kromozom yeniden düzenlemesi görselleştirilmiştir. Bu üçüncü video, bifokal kümelenmiş ekrisom odaklarının yeşil ve kromozomların kırmızı ile işaretlendiği, mitoz geçiren bir MDA-MB-231 hücresine aittir. Buna karşın, 20 µM PJ 34 ile inkübe edilen canlı transfekte MDA-MB-231 hücrelerinde kümelenmemiş sentrozomlar ve kromozomların anormal düzenlemesi tespit edilmiş olup, bu hücrelerdeki mitoz bu filmde gösterildiği üzere hücre ölümü ile sonuçlanmıştır.

Mitoz sırasında meydana gelen hücre ölümünün bu gerçek zamanlı belgelenmesi, mitozdaki çok kutuplu iğciklere sahip insan malign hücrelerinin sayısı ile PJ 34 ile inkübe edilen hücrelerdeki hücre ölümü yüzdesi arasında daha önce tanımlanmış olan pozitif korelasyonu güçlü bir şekilde desteklemektedir. PJ 34 güçlü bir PARP bir inhibitörü olarak hareket ettiğinden, PARP bir inhibisyonunun mitotik başarısızlıkla ilişkili hücre ölümüne yol açma olasılığı araştırılmıştır. Artan PJ 34 konsantrasyonlarının sitotoksik aktivitesi, normal ve PARP bir eksikliği olan fare embriyonik fibroblastlarında test edilmiş olup sonuçlar burada gösterilmiştir.

Soldaki grafik, belirtilen konsantrasyonlardaki PJ 34 ile 48 saat boyunca inkübe edilen ve siyah çizgi ile temsil edilen normal fare embriyonik fibroblastlarında ve gri çizgi ile temsil edilen PARP one eksik fibroblastlarında hesaplanan multifokal iğcik yüzdesini göstermektedir. Bu yüzdeler, üç farklı deneyde tespit edilen toplam 20 iğcik üzerinden hesaplanmıştır. Sağdaki grafik, 20 micromolar ile 72 saat boyunca inkübe edilen normal ve PARP one eksik fare embriyonik fibroblastlarının sağkalımını göstermektedir.

PJ 34 hücre sağkalımı, hücrelerin A TP üretimi ile analiz edilmiştir. Üç farklı deneyde her bir hücre hattı için yapılan dört ölçümün ortalama değerleri sunulmuştur. Bu sonuçlar, PJ 34'ün PARP one eksikliği olan fare embriyonik fibroblastlarında doz bağımlı olarak bozulmuş iğciklere ve hücre ölümüne neden olduğunu, ancak normal fibroblastlarda buna yol açmadığını göstermektedir.

PJ 34'ün, PARP 1 eksikliğine rağmen PARP 1 eksikliğine sahip metleri yok etmiş olması ve PARP 1 inhibisyonu için gereken konsantrasyonların üzerinde PJ 34 ile inkübe edilen PARP 1 eksik fare embriyonik fibroblastlarında multifokal iğlerin oluşumu ile hücre yok olması arasındaki korelasyon, PARP 1 eksik fare embriyonik fibroblastlarında sentrozomların temizlenmesi ile PARP 1 inhibisyonu arasında nedensel bir bağlantı olduğu fikriyle tutarlı değildir. Bu konfokal görüntüler, mitozdaki normal ve PARP 1 eksik fare embriyonik fibroblastlarını göstermektedir; hücreler fikse edilmiş, permeabilize edilmiş ve iğlerini yeşile, sentrozomlarını ise kırmızıya boyayan alfa ve gama tübülin için immün etiketlenmiştir. Kromozomlar DPI reaktifi ile maviye boyanmıştır.

Hücreler ya işlem görmemiş olarak bırakılmış ya da belirtilen konsantrasyonlarda 48 saat boyunca PJ 34 ile inkübe edilmiştir. PJ 34 ile işlem gören PARP 1 eksik fare embriyonik fibroblastlarında kümelenmemiş gamma tubulin odakları, bozulmuş iğler ve hücre ölümü gözlemlenmiş; ancak PJ 34 ile işlem gören normal fare embriyonik fibroblastlarında bu durum gözlemlenmemiştir. İncelenen hücre kültürlerinin bir kısmı, PARP 1'in enzimatik aktivitesini inhibe eden iki güçlü non-parine PARP 1 inhibitörü olan BT 8 88 ve G 0 1 4 6 9 ile işlem görmüştür.

Test edilen PARP bir inhibitörlerinin hiçbiri, PARP bir aktivitesini inhibe eden konsantrasyonlarda normal fare embriyonik fibroblastlarına zarar vermemiştir. Bu PARP bir inhibitörleri ayrıca, PARP bir eksikliği olan fare embriyonik fibroblastlarında sentrozom kümelenmesini de etkilememiştir. Bu sonuçlar, PJ 34'ün çoklu sentrozomlu hücreler üzerindeki sitotoksik aktivitesinin, diğer güçlü PARP bir inhibitörleri tarafından paylaşılmadığını göstermektedir Once mastered.

Bu teknik, çeşitli amaçlar doğrultusunda diğer canlı hücre tiplerinde de kullanılabilir.