İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Bu prosedürün genel amacı, lipo aspirat şeklinde elde edilen yağdan adipoz kaynaklı kök hücreleri izole etmektir. Bu, önce cerrahi solüsyonun çıkarılması ve kontamine kırmızı kan hücrelerinin aspiratının yıkanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, yıkanmış lipo aspiratın kollajenaz ile enzimatik sindirimi yoluyla kök hücrelerin serbest bırakılmasıdır.

Daha sonra, stromal vasküler fraksiyon veya SVF şeklinde salınan hücreler santrifüjleme ile toplanır. Son adım, yapışık ASC'lerin seçimi ve kültürü için süpernatan ve plakayı, SVF hücrelerini çıkarmaktır. Sonuçta bu kültürlenmiş ASC'lerin kemik, yağ ve kıkırdağa doğru in vitro indüksiyonu.

Soylar, çoklu potansiyellerini doğrulamanın yanı sıra bu hücrelerin kültür içindeki varlığını doğrulamak için kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, hücre hasadından önce büyük miktarlarda lipo aspirin ile çalışmanın lojistiği nedeniyle mücadele edeceklerdir. Steril kollajenaz hazırlayın: Bir çözelti ve steril kontrol ortamı yazın.

Lippo aspiratı bir aspirasyon kabında toplayın. Lippo aspiratı dikkatlice bir litrelik steril bir cam hoparlöre boşaltın. Lippo aspirat tabakaları yerçekimi ile ayrıldığında, varsa üst yağ tabakasını aspire edin.

Ayrıca, alt iç kısmı çıkarın. Elde edilen yağ dokusu tabakasının hacmini değerlendirin. Eşit hacimde steril bir XPBS ekleyin ve aspirasyon için kullanılan pipetle karıştırın.

İki tabaka yerleştiğinde, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak inatı aspire edin. Yağ tabakası sarı altın rengine dönene kadar yağ dokusu fraksiyonunu PBS ile yıkamaya devam edin. Yağ dokusu fraksiyonunu bırakarak inate'i son bir kez aspire edin.

Cam hoparlörde. Lippo aspirat katmanlarının son yıkamadan sonra ve son aspirasyondan önce beş dakika oturmasına izin verin. Bir filtre ünitesinde, steril kollajenaz bir çözelti hazırlayın.

Yağ fraksiyonu ve steril filtreninkine eşit bir hacim ekleyin. Daha sonra yıkanmış yağ fraksiyonunu dikkatlice kollajenaz çözeltisine dökün ve şişeyi sıkıca kapatın. Daha sonra kollajenaz yağ karışımını 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika boyunca her beş ila 10 dakikada bir hafifçe döndürerek inkübe edin, sindirim ilerledikçe yağ dokusu tabakasını daha pürüzsüz bir görünüm için değerlendirin ve gerekirse reaksiyon süresini artırın katı yağ parçalarını çözün.

Sindirilmiş kollajenaz yağ karışımını içeren filtre ünitesini %70 etanol ile sterilize edin ve tekrar biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Şimdi stromal vasküler fraksiyonu içeren inatın 25 mililitrelik alikotlarını steril 50 mililitrelik santrifüj tüplerine pipetleyin. Her tüpe 25 mililitre kontrol ortamı ekleyin ve kollajenazı etkisiz hale getirmek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, stromal vasküler fraksiyonu biyogüvenlik kabininde bir pelet olarak toplamak için 1.200 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı her tüpten aspire edin. Üst yağ tabakasının ve yüzen adipositlerin bu süpernatan ile aspire edildiğinden emin olun.

Daha sonra, SVF peletlerini 30 mililitre şartlandırılmış ortam kullanarak bir santrifüj tüpünde birleştirin ve santrifüjlemeden sonra iki peletten süpernatanları aspire ettikten sonra iki yeni 50 mililitrelik santrifüj tüpüne eşit olarak bölün. RBC lizisi istenirse, bu iki peletin her biri 10 mililitrelik bir RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edilebilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilebilir. Santrifüjlemeden sonra, stromal vasküler fraksiyonun topaklarını elde etmek için süpernatanları aspire edin.

Bu iki peleti yeni bir santrifüj tüpünde birleştirin. Beş ila 10 mililitre kontrol ortamı kullanılarak, büyük doku parçacıkları, yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilmiş 100 mikronluk bir ağ filtresi kullanılarak filtrelenebilir. Şimdi adipoz kök hücreleri içeren filtrelenmiş fraksiyonu doku kültürü kapları üzerine alikotlayın.

Ardından her yemeği uygun bir kontrol hacmi ile destekleyin. Medya kültürü. Ortam değişikliği olmadan üç ila dört gün boyunca hücreler, kültürü, ortamı aspire eder ve kontamine kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için hücreleri bir kez steril PBS ile yıkar, daha sonra ortamı yeniler ve bu manuel enzimatiği kullanırken kültüre devam

Elde edilen kültürlenmiş A SC popülasyonu, görünüş olarak nispeten homojendir ve en popüler doğrulama aracı olarak fibroblast benzeri hücrelerden oluşur. Tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak A SC popülasyonunun in vitro indüksiyonu, mezodermal, ektodermal ve endodermal soylara farklılaşmalarına neden olur. İn vitro tri germ tabakası potansiyeli, çok çeşitli rejeneratif model sistemleri için ASC'lerin kullanılmasına neden olmuştur.

Adipojenik, osteojenik ve konjenik hücrelere farklılaşma genellikle A SC'yi tanımlamak ve çoklu potansiyelini doğrulamak için yeterlidir. Ek olarak, ASC'ler ayrıca ektodermal soyun veya endodermal hepatik hücre soyunun iskelet miyojenik ve düz miyojenik soy hücrelerine de farklılaşabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir stromal vasküler fraksiyonun Lipos'tan nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Turing'in amacı için, bu bir SC bileşenidir.