İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, sonraki fonksiyonel çalışmalar ve adoptif transfer deneyleri için fare kemik iliğinden nötrofilleri izole etmek ve işaretlemektir. Bu işlem, öncelikle fare femur ve tibia kemiklerinden kemik iliği hücrelerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, eritrositler sırasıyla %0,2 ve %1,6 sodyum klorür çözeltilerinde ardışık olarak süspanse edilerek ozmotik olarak lizlenir.

Ardından, nötrofiller yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole edilir. Son adımda, nötrofiller hücre takip boyalarıyla işaretlenir. Nihayetinde, çeşitli fare dokularına göç eden adoptif transfer edilmiş nötrofillerin sayısını belirlemek için akış sitometrisi kullanılabilir.

Fare nötrofilleriyle kemik iliğinden izolasyonun kan veya peritona göre temel avantajı, hem kararlı durumdayken hem de enfeksiyon sonrasında, sonraki fonksiyonel çalışmalar ve adoptif transfer deneyleri için yeterli miktarda yüksek hücre sayısının kemik iliğinden elde edilebilmesidir. Fare nötrofilleri izolasyonu için gradyan santrifüj tekniği kullanmanın, immünomanyetik seçime veya floresanla aktive edilmiş hücre ayıklamaya göre avantajı; hızlı ve ekonomik olması ve nötrofil aktivasyonunu tetikleyebilecek antikorlarla etiketleme işlemini önlemesidir. Prosedür, ötanize edilmiş bir fareye %70 etanol püskürtüldükten sonra, laboratuvarımdan teknisyen Muca Swami tarafından gösterilecektir.

Hayvanın cildinin orta karın bölgesinden bir insizyon yapın ve ardından alt ekstremiteler de dahil olmak üzere hayvanın distal kısmındaki cilt dokusunu çıkarın. Sonra, makas kullanarak hayvanın arka ekstremitelerindeki kasları kesin ve ardından femur başının kırılmasını önleyerek ACE beum'u kalça ekleminden dikkatlice çıkıklaştırın. Ardından, femur ve tibia üzerindeki kalan kasları temizlemek için makas ve bistüri kullanın.

Kemik uçlarını kırmamaya dikkat ederek bacak kemiklerini diz ekleminden ayırın ve ardından kemikleri buz gibi soğuk RPMI 1 6 4 oh içeren bir Petri kabına yerleştirin. FBS ve antibiyotiklerle destekleyin. Kabı bir doku kültürü kabinine aktarın ve ardından her bir kemiğin dış kısmını yeni bir Petri kabı içerisinde %70 etanol ile sterilize edin.

Yaklaşık 10 ila 15 saniye sonra, her bir kemiğin yüzeyindeki etanolü, buz gibi soğuk, steril PBS ile art arda üç kez yıkayarak temizleyin. Ardından, her bir kemiğin epifizini kesin ve yeni steril bir Petri kabına yerleştirin. Sonrasında, 10 mililitre RPMI ile doldurulmuş 12 cc'lik bir şırıngaya 25 gauge iğne takın.

FBS ve EDTA ile takviye edin. Ardından, her bir femur tibia çiftinin şaftının her iki ucundan kemik iliği hücrelerini, tüm hücreleri toplamak için 100 µm filtre ile donatılmış 50 mL'lik vidalı kapaklı Falcon tüpüne boşaltın. Kemiklerin iç yüzeylerini iğne ucuyla sıyırın.

Kemikler beyazlaşmış göründüğünde, hücreler yeterince uzaklaştırılmış demektir. Şimdi bir skalpel kullanarak kemik epifizlerini 0,5 ila 1 mm boyutlarında küçük parçalara bölün ve ardından bunları 100 µm filtre üzerinden ezmek için 2,5 mL'lik bir BioPure pipet ucu kullanın. Toplanan hücreleri 427 ×g'de ve 4 °C'de yedi dakika boyunca santrifüjledikten sonra, eritrositleri 20 mL %0,2 sodyum klorür içinde yaklaşık 20 saniye boyunca yıkayın.

Ardından lizisi 20 mililitre %1,6 sodyum klorür ile durdurun, hücreleri santrifüjleyin ve ardından pelletini FBS ve EDTA ile desteklenmiş RPMI 1 6 4 oh içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri sayın ve tekrar santrifüjledikten sonra, yıkanmış pelletini buz soğukluğundaki steril PBS içerisinde mililitre başına en fazla 100 × 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Şimdi 15 mililitrelik konik bir tüpe 18 ila 26 °C sıcaklıkta üç mililitre his opak 1 1 1 9 ekleyin ve ardından üzerine 18 ila 26 °C sıcaklıkta üç mililitre yavaşça ekleyin.

Hisopaque 1 0 7 7 kullanın. İki yoğunluğun hazırlanmadan hemen sonra karışmasını önleyerek, kemik iliği hücre süspansiyonunu Hisopaque 1 0 7 7 üzerine dikkatlice katmanlandırın; yoğunluk gradyanını 25 °C'de, frenleme olmadan, 30 dakika boyunca 834 ×g'de santrifüjleyin ve ardından Hisopaque 1 1 1 9 ile 1 0 7 7 katmanlarının ara yüzeyinden nötrofilleri toplayın. Toplanan nötrofilleri RPMI 1 6 4 0, FBS ve antibiyotikler ile iki kez yıkadıktan sonra, hücreleri 37 °C'ye ön ısıtılmış PBS içinde 5 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspande edin.

Hücreleri saydıktan sonra, akış sitometrisi ile saflığı ve canlılığı belirlemek için her deneysel örnekten küçük bir alikot ayırın ve ardından geri kalan nötrofilleri, karanlıkta, sallanan bir su banyosunda 37 °C'de 10 dakika boyunca beş µM nihai konsantrasyonda bir hücre takip boyasıyla işaretleyin. Son olarak, aşağıda yer alan kompetitif yeniden popülasyon çalışmaları için farklı şekilde işaretlenmiş nötrofil popülasyonlarını karıştırmadan önce, boya çapraz kontaminasyonunu önlemek için hücreleri, FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 ile iki kez yıkayın; bu panelde, enfekte edilmemiş bir C57BL/6 fareden izole edilen, yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılmış kemik iliği nötrofillerinin temsili akış sitometrisi grafikleri gösterilmektedir. Histopath 1119 ve Histopath 1077 ara yüzeyinden toplanan kemik iliği hücreleri için kullanılan başlangıç kapılama stratejisi verilmiştir.

İleri ve yan saçılım kullanılarak, yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılmış nötrofillerin, adoptive transfer cell tracker uygulamasından sonra en az dört saat boyunca %90'tan daha saf ve %95'ten daha canlı olduğu gösterilmiştir. DIA etiketli nötrofiller, çeşitli fare dokularında akış sitometrisi ile takip edilebilir. Örneğin, bu deneyde canlı CD45 Ly6G CD11b hücreleri üzerinde kapılama (gating) yapılarak gösterildiği üzere, alıcı candida enfekte C57BL/6 faresinin kanında, kemik iliğinde ve böbreklerinde, adoptif olarak transfer edilen bu temsili CMTMR etiketli nötrofiller, PE ekspresyonları sayesinde alıcı farenin doğal CMTMR ve PE negatif nötrofillerinden ayırt edilebilir.

Fare kemik iliği nötrofillerin izolasyonu ve işaretlenmesi konusunda uzmanlaşıldığında, bu işlem üç saat içinde tamamlanabilir.