Name: Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Öğrenin, G protein-bağlanmış alıcıları yapısal biyoloji çalışmaları için p-azido-L-fenilalanin ile genetik olarak kodlanmış moleküler probler kullanarak incelemeyi. Bu yöntem, bağlanma bölgelerinin belirlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz birkaç vakıf ve hayırsever bağışçıların cömert desteği (SakmarLab.org bakınız) teşekkür ederim.

1.. GPCRs içine Doğal olmayan amino asitlerin bölge spesifik genetik Incorporation <ol><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T hücreler (glukoz 4.5 g / L, 2 mM glutamin) koruyun. </li><li> Lipofektamin Plus tepkin maddesi kullanılarak 10 cm&#39;lik bir plaka içerisinde% 60-80 konflüansa büyütülmüştür hücreleri transfekte. <ol><li> 750 ul DMEM için, arzu edilen bir pozisyonda amber durdurma kodonu ihtiva eden 10 ul Plus tepkin maddesi, GPCR cDNA 3.5 ug (pMT4. Rho veya pcDNA 3.1. CCR5), 3.5 baskılayıcı tRNA cDNA&#39;nın (pSVB.Yam) arasında ve 0,35 ug ug eklemek p-azido-L-fenilalanin (pcDNA.RS) için, mutant bir amino asil-tRNA sentetaz cDNA. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ayrıca, bir kontrol olarak hizmet etmek üzere ağırlıkça GPCR cDNA (bir amber durdurma kodonu içeren) kullanılarak da benzer bir transfeksiyon gerçekleştirin. 17 ul Lipofektamin ile DMEM 750 ul bu karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra dengeye getirmek4 ml toplam hacim. </li><li> 10 cm&#39;lik bir tabakta aspire ortam hücrelere transfeksiyon karışımı uygulanır ve CO2 atmosfer,% 5 37 ° C&#39;de geri dönün. 4-6 saat sonra,% 20 FBS ve 1 mM azf içeren 4 ml DMEM hücreleri ek. </li></ol></li><li> Ertesi gün, DMEM,% 10 FBS ve 0.5 mM azf içeren büyüme ortamı değiştirin. </li><li> Hasat hücreleri 48 saat sonrası transfeksiyon, ifadesini analiz ya da aşağıdaki bölümlerde açıklanan foto-veya etiketleme prosedürleri devam etmek. <ol><li> Büyüme ortamı içinde UAA mevcudiyetinde GPCR sarı mutant ifadesini teyit edin. Biz Batı bağışıklık algılama bunu. Lyse% 1 hücre topağı (ağ / hac) 20 mM Tris-HCI, pH dodesil-β-D-maltozit (DDM) 7.5, 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile 100 mM NaCl 16,000 xg&#39;de lizat santrifüj ve SDS-PAGE ile indirgeyici koşullar altında süpernatantı çözmek. Bir PVDF membrana aktarılır ve inci kullanılarak tam uzunluktaki reseptör ifadesini tespit etmek için bağışıklık-beneklenme analizi gerçekleştirmekreseptörün C-ucunda bir epitopu tanır tasarlanmış e 1D4 mAb (National Hücre Kültürü Merkezi),. 31 </li></ol></li></ol> 2. Hedefli foto-kullanarak Ligand Bağlama Sitesi Haritalama <ol><li> 48 saat post-transfeksiyon, hücrelerden aspire ortam ve 4 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile değiştirin. 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de geri dönün. </li><li> 1x PBS ile tekrar süspansiyon hücreleri ve bir Falcon tüp transfer. Pelet hücreleri ve süpernatan aspire 2 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> 20 mM HEPES, pH 7.5,% 0.2 BSA ve reseptör-ligand kompleksi oluşmasını sağlamak için, zaman ve sıcaklığın gerekli uzunluğu için bağlanma satürasyon konsantrasyonu da üçlü ligand içeren 1x Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi içinde hücre pelletini. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca (örneğin, UV-A lambası kullanın) 365 nm&#39;de azf fotoaktivasyon için bir 24 oyuklu veya 96 oyuklu plakaya transfer hücre süspansiyonu Maintain buz üzerinde plaka numune ısıtma ve hücre parçalanmasını önlemek için. </li><li> Pelet hücreleri, bir Eppendorf tüpü, santrifüje hücreleri aktarın, süpernatant kaldırmak ve analiz geçin. Topaklar gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> (W / v) DDM, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5 ve proteaz inhibitörleri% 1 ihtiva eden liziz tamponu içinde hücre topakları yeniden süspanse edin. 4 ° C&#39;de 1 saatlik inkübasyondan sonra, 16,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca hücre lizat santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. </li><li> Süpernatana 1D4 mAb-sefaroz 2B reçine ilave edin ve işlenmiş C-terminal 1D4 mAb epitop kullanılarak GPCR immunopurify için 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, liziz tamponu ile pek çok kez yıkayın boncuklar. Çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 1 SDS ile Elute örnekleri. </li><li> Bir 15 ml şişe ihtiva eden sintilasyon sıvısına, elüsyon bir kısmını aktarın ve inci olan toz haline getirilmiş olan bağlayıcının spesifik bağlanmasındaki yer değiştirme miktarını belirlemek için bir beta parıldama sayacında sayılıre reseptörü. </li><li> Standart jel elektroforezi ile kalan 1D4 mAb saflaştırılmış eluen gidermek. Bir 4-12% SDS-PAGE jel ve bağışıklık boyama için bir PVDF membrana daha sonra yarı-kuru aktarımı kullanın. Biz de moleküler ağırlığı görsel yaklaşımı rehberlik standart protein merdiven ile bir şerit bulunur. <ol><li> % 0.05 Tween-20 içeren TBS tampon maddesi içinde% 5 süt, PVDF membranı ile bloke edin. HRP-konjuge edilmiş anti-fare IgG ikincil antikor, ardından 1D4 mAb ile tam uzunluklu reseptör ifadesini teyit etmek için membran kontrol edin. </li><li> Gelişmiş chemiluminescence (ECL) reaktif ile tedavi ve bantları görselleştirmek için filmi otoradyografıye membran maruz. </li></ol></li><li> Özel moleküler ağırlık belirteçler kesilerek ardından her numune şerit ayırmak için bir tıraş bıçağı ile membran kesin. Sintilasyon akışkan maddesi ihtiva eden tüplere zar segmentleri aktarın. Bir beta-parıldama sayacında sayılarak, her zar segmentte trityum miktarını ölçmek. </li><li> Pozitif tespitGPCR ve ligandın bunun toplamına eşit görünür moleküler kütlesi de trityum algılama ile photocrosslink. </li></ol> 3. Epitop Etiketleme ve Hücre yüzey Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Hedeflenen <ol><li> 24 saat post-transfeksiyon PBS&#39;de 1 x 1 ml yıkama hücreleri ve 3 dakika boyunca 1 ml% 0.25 tripsin ile tripsinize edin. ,% 10 FBS ve 0.5 mM azf içeren 9 ml DMEM ile Supplement. Hücrelerin tekrar ve hücre yoğunluğu saymak. Biz standart bir Hemasitometre kullanın. </li><li> 0.01 mg / ml, oyuk başına poli-D-lisin, 100 ml ile yüksek bağlanma, berrak tabanlı, 96 oyuklu plaka ön tedavi. 1x PBS ve kuru hava ile tekrar tekrar yıkama, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Levha 200 6 x 10 4 yoğunluğunda transfekte edilmiş hücrelerin ul - 8 x 10 4 hücre / oyuk, 96 oyuklu plakaya ve CO2 atmosfer,% 5 37 ° C&#39;de geri dönün. </li><li> Ertesi gün etiketleme için hücreleri hazırlamak. Yavaşça 100 ul / göz PBS 1x t ile üç kez yıkayıno herhangi AZF içeren büyüme ortamı çıkarın. Hücreler PBS Ca 2 + ve Mg2 + ihtiva eden kullanılarak, örneğin, yapışık kalmasını sağlayın. </li><li> PBS içinde 5-20 mM&#39;de tutulan bir stok 1x HBSS / PBS içinde 50-200 uM FLAG-triarilfosfin etiketleme reaktifi hazırlayın. Her bir (her sarı mutant için üç kopya halinde) 60 ml uygulanır ve 30 dakika ila 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de geri dönün. 1x HBSS / PBS içinde etiket tedavisiz gözenekli bir grup kullanın koruyun. Ayrıca AZF-GPCR&#39;dir varyantları ile karşılaştırmak için bir ağırlık GPCR&#39;dir kontrolü içerir. </li><li> Zamanda, bloke edici tampon içinde 100 ul / ile hücreler 3 kez yıkanmakta, BB (1 x PBS,% 0.5 BSA), tamamen reaksiyona girmemiş etiket çıkarmak için kullanılır. </li><li> Hücrelere 100 ul / oyuk (1 x PBS içinde% 16 stoktan hazırlandı)% 4 paraformaldehid uygulanır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. BB ile üç kez yıkayın. </li><li> Etiketli reseptör ve reseptör ekspresyonunu tespit etmek için standart hücre yüzeyi ELISA protokolü yapın. İkinci An ve ardından, buz üzerinde 1.5 saat için primer antikor ile inkübe1 saat oda sıcaklığında inkübasyon tibody. <ol><li> FLAG-triarilfosfin etiketleme reaktifi FLAG peptit epitopunun tespit etmek için bir anti-FLAG M2 antikoru 100 ul (BB yapılan antikorun örneğin 1:2,000 seyrelti) ilave edin. Aynı zamanda, negatif kontrol olarak etiketli olmayan tedavi kuyu sonda. Wt veya AZF-GPCR, hücre yüzeyi ekspresyonunu belirlemek için kuyu ayrı bir dizi antikoru (1:500 seyreltme bir kullanımı), anti-CCR5 2D7 ekleyin. </li><li> BB ile hücreler üç kez yıkayın ve HRP ile konjüge edilmiş anti-fare IgG ikincil antikor (1:2,000 seyreltme), 100 ul ile inkübe edin. </li><li> Dikkatle BB ile hücreleri beş kez yıkayın. 50 ul tampon algılama ekleyin Amplex Red, 20 mM 2 H 2 O, 1 x PBS (1:10:90 oranı) ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. Λ ex = 530 bir floresan çoklu-plaka okuyucu üzerinde spektral veri toplamak ve λ em 590 =. </li></ol></li></ol> 4. Bir GPCR ve Bioorthogonal floresan etiketleme <ol><li> LyseWt veya AZF-rodopsin% 1 ihtiva eden 1 ml tampon maddesi içinde çözündürme varyantları (w / v) DM, 50 mM HEPES ve Tris-HCI, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 ve 1 proteaz inhibitörleri eksprese eden 10 7 hücre hasat 4 ° C&#39;de hr 10 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de santrifüj hücre lizatı ve süpernatan fraksiyonu toplamak. </li><li> Işlenmiş C terminus 1D4 epitopu ile reseptörün yakalamak için 100 ul mAb 1D4-sefaroz reçinesi 2B ekleyin. 4 ° C&#39;de 12 saat boyunca inkübe 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.3 (w / v)% 0,1 ile DDM, reçineyi üç defa yıkanır. </li><li> Immün afinite matrisi (mAb 1D4-sefaroz 2B) üzerinde hareketsizleştirilmiş reseptörü etiketlemek için 0.5 ml - 0.3 arasında bir toplam hacim içinde 0.1 mM Fluorescein-fosfin ekleyin. Oda sıcaklığında 12 saat boyunca inkübe edin. Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. Girmemiş etiketi kaldırmak için reçine yıkayın. </li><li> (W / v) DDM ve 0.33 mg / ml nonapeptit (1D4 epitopuna karşı C9 peptid)% 0.1 ihtiva eden 100 ml yıkama tampon maddesi ile işaretlenmiş reseptörü Zehir2 mM fosfat tampon maddesi içinde 1 saat için buz üzerinde kuluçkalama ile pH 6.0. </li><li> Indirgeyici koşullar altında SDS-PAGE ile etiketli örnekleri giderin. PBS kısaca jeller yıkayın ve sonra-jel floresan ile AZF-GPCR&#39;nin etiketleme görselleştirmek. Örneğin, floresan ile modifiye reseptörünü tespit etmek için, 488 nm dalga boyu lazer konfokal floresan tarayıcıyı kullanın. </li></ol>

<ol><li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors%3A+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li>
<li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+eukaryotic+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li>
<li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li>
<li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li>
<li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li>
<li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li>
<li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li>
<li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li>
<li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li>
<li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+%28GPCR%29+using+genetically+encoded+photocrosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li>
<li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li>
<li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li>
<li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escaping+the+flatlands%3A+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li>
<li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%3A+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+%C3%85+crystal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li>
<li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , submitted (2013).</li>
<li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin%3A+characterization%2C+cross-reactivity%2C+and+application+as+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li>
<li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li>
<li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+structure%2C+dynamics%2C+and+activation%3A+A+perspective+from+crystallography%2C+site-directed+spin+labeling%2C+sulfhydryl+reactivity%2C+and+disulfide+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%3B+Membrane+Proteins%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li>
<li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking%3A+use+of+a+photoactivatable+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzophenone+photophores+in+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li>
<li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N%28epsilon%29-%28o-azidobenzyloxycarbonyl%29+lysine+for+site-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz GPCRs içine, reaktif bir prob, AZF site-spesifik birleşme için buraya sağlam bir metodoloji tarif ve GPCRs yapısını ve dinamiklerini incelemek için bu aracı üç yararlı uygulamaları göstermek. Bizim yöntem sitede-özellikle UAA&#39;lar kimyasal 32, 33 etiketleme veya tek erişilebilir sistein mutant foto 34 bağlama dayalı alternatif bir strateji ile temel bir problemi aşılmaktadır dahil. Sistein tiyol grupları hedef kimyaları flüoresan millerini takmak için kullanılmış olsa da, böyle bir strateji,...

Heptahelikal G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) önemli ve çeşitli hücre-dışı sinyallerin aracılık eden yüksek dinamik zar proteinlerinin bir üst ailesidir içermektedir. Klasik paradigmada, reseptör aktivasyonu ligand bağlı şekilsel değişiklikleri ile birleştirilmiştir. 1 GPCRs yapısal biyoloji 2 Son gelişmeler zar sinyalizasyon moleküler mekanizmaları üzerinde önemli fikir vermiştir. 3-5 Ancak, daha büyük kimyasal hassasiyet ile anlamak için fonksiyonel mekanizma ve GPCR&#39;dir sinyal yapısal dinamikleri, yaklaşımları bir araç aktif bir sinyal kompleksleri sorgulamak için bilgilendirici moleküler ve kimyasal sondalar dahil etmek gereklidir. Bu amaçla, site-spesifik olarak, daha önce Schultz ve c öncülük bastırma teknolojisi kullanılarak amber kodonu doğal olmayan amino asit (UAA) mutagenez göre ifade edilen reseptörlerine olmayan veya minimal bozucu probları tanıtmak için bir yöntem adapteoworkers. 6 Bu örneğin memeli hücreleri dışındaki çok heterolog ifade sistemlerinin zordur GPCRs gibi proteinler için yüksek verim ekspresyonu ve mutagenez sistem elde etmek için UAA mutagenez yöntemi optimize edilmiştir. Ortogonal bir mühendislik bastırma tRNA kullanarak ve belirli bir UAA için aminoasil-tRNA sentetaz çifti gelişti, site-spesifik ifade hedef GPCRs içinde UAA&#39;lar tanıttı. UAAS başarıyla dahil edilmesi, p-asetil-L-fenilalanin (ACF), p-benzoil-L-fenilalanin (BZF) ve p-azido-L-fenilalanin (azf) bizim modeli GPCRs olarak gösterilmiştir - rodopsin ve insan CC kemokin alıcısı, CCR5. 7, 8 Prensip olarak, bir UAA genetik olarak protein dizisi içinde herhangi bir pozisyonda kodlanabilir ve bir hedef GPCR tek kodon tarama olanak olarak bu özelliği bir değerli biyokimyasal bir araçtır. Biz bir reaktif Azi olan UAA, azf, çok yönlülük, özellikle burada odakparçasını yapmak. 9 AZF aynı zamanda komşu birincil aminler ya da alifatik hidrojenlerin ile reaksiyona sokularak bir ışıkla çapraz bağlayıcı olarak hizmet edebilir, bir kızıl ötesi (IR) probu, 8, olarak hizmet ek olarak. Buna ek olarak, biyolojik açıdan atıl azido grubu bioorthogonal etiketleme reaksiyonlarda bir seçici kimyasal tutma yeri olarak katılabilir. İşte biz böyle tuzak hedefli foto çapraz bir reseptör-ligand kompleksi ve bioorthogonal epitop etiketleme ve floresan etiketleme stratejilerinin GPCRs modifikasyonu gibi GPCRs, içine AZF site-spesifik esas yararlı uygulamaları gösteren örnekler sunuyoruz. Işıkla aktive reaktifler 1960&#39;lardan beri biyolojik sistemler incelemek için kullanılmıştır. Bu dönemde 10, reseptör-ligand çapraz bağlama deneylerinin bir bolluk GPCR kompleksleri incelemek için rapor edilmiştir, burada en fotoafinite ligandları kullanımını içeriyordu. 11, 12 Bununla birlikte, bu Onlar gerektirmeyen gibi uygulamalar teknik, sınırlıBir çapraz bağlama grubu taşıyan ligandların e sentezi. 13-15 Ayrıca, liganddaki çapraz bağlayıcı parça ile, bu GPCR&#39;nin üzerinde çapraz link yerini belirlemek zordur. Site özel bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı proteinlere UAAS olarak foto-çapraz grupların dahil değerli bir gelişmedir. 16, 17 Biz, bir reseptör-ligand kompleksinin oluşmasına katılan bir reseptör üzerinde bağlayıcı arayüzü tanımlamak için bir foto-çapraz bağlı bir teknik geliştirdi GPCRs içine fotolabil gruplar getirerek hücreleri canlı. 18, 19 Burada, bir küçük moleküllü ligand bağlama sahası, CCR5 üzerinde tritiye Maraviroc tanımlamak için bu hedef foto-çapraz teknolojiyi uygulamak için, deney protokolü ve veri analizi yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem, doğal ligandın kimyasal yapısını koruyarak ek olarak, ligand üzerindeki radyoaktif kolu, kesin miktar istifade eder. Floresans-tabanlı teknikler, doğrudan reseptörünün oluşum durumunu tarama ile reseptör aktivasyonunun yapısal temeli tam görüşü destekler. 20, 21 Bununla birlikte, GPCRs flüoresan etiketler tanıtmak için esneklik sahip teknikler site-spesifik olarak sınırlı bulunmaktadır. Biz GPCR sinyalizasyon komplekslerin tek-molekül algılama (SMD) kolaylaştırmak için bioorthogonal kimyasal modifikasyon stratejileri istihdam ilgilendi. 22. Azido grubu, Stadinger-Bertozzi ligasyon, 23, 24 bakır-germeli terfi azid-olarak bioorthogonal kimyaları katılabilir alkin siklo-(SpAAC) 25 ve bakır ile katalize edilen azit-alkin siklo (CuAAC). 26 İletişim bir azid ve bir fosfin arasındaki özel reaksiyon içerir Staudinger Bertozzi-bağlama reaksiyonu, burada odaklanır. Bir peptid epitop (FLAG peptidi) veya bir fluoresan bir etiket maddeye konjüge iki farklı fosfin türevlerinin kullanımını göstermektedirGPCRs siteye özgü modifikasyonu elde etmek için (fluorescein). Biz daha önce maruz çözücüdür hedef siteleri seçmek için X-ışını kristal yapıya ve dinamik simülasyonları kullanarak azf varyantları rodopsin site-spesifik etiketleme koşullarını optimize edilmiş. 27., 28. Biz de by background-serbest etiketleme ulaşmak için fizibilite resimli Staudinger- Bertozzi ligasyon. 29 İletişim burada immün afinite matrisi üzerinde hareketsiz hale getirildi ve daha sonra in-jel floresan ile görselleştirilmiştir bir deterjan-çözünebilir reseptörünün floresan etiketleme elde etmek için kullanılan genel prosedürü göstermektedir. Ayrıca, bilinmeyen yapı, CCR5&#39;in bir reseptör üzerinde etiketleme için uygun pozisyonları belirlemek için bu etiketleme strateji üzerinde yararlı bir uzantısı göstermektedir. Bu AZF-GPCR, hücre bazlı bir yarı yüksek bir ürün formatında varyantları bioorthogonal modifikasyonu dayanır bir hedef peptid epitop etiketleme stratejisi kullanılarak gerçekleştirilir. 30 Buyöntem etiketleme olayları izlemek için bir hücre-yüzey ELISA çok adımlı algılama özelliklerini kullanır. Biz burada tartışmak metodolojiler genel ve ilkesel olarak bastırma teknolojisi kodon sarı kullanarak azf ile dahil herhangi GPCR&#39;nin uygulanabilir. Ayrıntılarıyla GPCRs yapısal ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi ve bunların daha sonraki uygulamaları kullanılarak bu azf gibi UAAS ile dahil reseptörlerin Memeli hücre ekspresyonunda söz konusu olan adımlar Burada yer alan protokollerde.

<table><tbody><tr><td>Plazmid pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>azF</td><td></td><td></td> için plazmid pcDNA.RS<td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plazmitler pMT4.Rho ve pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>İsteğe bağlı olarak kehribar durdurma kodonunu (TAG) istenen bir konumda içerir</td></tr><tr><td>HEK 293T hücreleri</td><td></td><td></td><td>Yapışık hücreler</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>İkizler Biyo-ürünleri</td><td>100-106&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofektamin: 18324-012 Plus: 11514-015&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanin</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü>Tablo 1.</güçlü> Doğal olmayan amino asitlerin GPCR malzemelerine bölgeye özgü genetik olarak dahil edilmesi</td></tr><tr><td>Maxima ML-3500S UV-A lambası</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF, 365 nm ışıkla aktive edilir</td></tr><tr><td>Hank'in Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Bilimsel</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trityum etiketli ligand</td><td></td><td></td><td>İşbirlikçiden (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>%1 (a/h) n-dodesil-&beta;-D-maltosid</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-sefaroz reçinesi</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb, CNBr ile aktive edilen sefaroz 2B reçinesi üzerinde hareketsiz hale getirilmiş</td></tr><tr><td>% 1 (a / h) sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - %12 SDS jelleri</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>NuPAGE cihazında gerçekleştirilen SDS-PAGE</td></tr>, <tr><td>Trans-Blot SD cihazı</td>, <td>Biorad</td><td></td><td>Yarı kuru transfer cihazı</td></tr>, <tr><td>İmmobilon poliviniliden diflorür (PVDF) membranı,</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Yağsız Enerjili</td><td>Süt Fisher Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>LS-273</td><td>Sintilasyon sıvısı</td></tr><tr><td>Sintilasyon şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Sıvı Sintilasyon Sayacı</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Beta-Sintilasyon sayacı</td></tr><tr><td>Anti-rodopsin 1D4 mAb</td><td>Ulusal Hücre Kültürü Merkezi</td><td>özel</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge anti-fare IgG KPL</td><td>, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Kemilüminesan Yüzey</td><td>Termo Bilimsel</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyblot CL AR filmi</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü>Tablo 2.</güçlü> Hedeflenen fotoçapraz bağlama malzemeleri</td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BAYRAK-triarilfosfin</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>M2 BAYRAK mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma</td><td>P6407</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>Şeffaf alt, yüksek bağlayıcılık EIA / RIA</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (Kalsiyum, Magnezyum)</td> <td>Gibco</td><td>14040</td> <td>&</td></tr><tr><td>% 16 Paraformaldehit</td><td>EMS</td><td>28908</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>HRP konjuge</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tavşan karşıtı IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplex Kırmızı</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>DE Sağlık Ürünleri</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CytoFluor II floresan çok kuyulu plaka okuyucu</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü>Tablo 3.</güçlü> Hedeflenen peptit-epitop etiketleme ve hücre yüzeyi ELISA malzemeleri</td></tr><tr><td>Floresein-fosfin</td><td></td><td></td> <td>(Huber et al., 2012'de sunuldu)</td></tr> <tr><td>Nonapeptid (C9 peptidi)</td> <td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>1D4-epitop NH2-TETSQVAPA-COOH'yi taklit eden peptit</td></tr><tr><td>%1 (a/h) n-dodesil-&beta;-D-maltosid</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-sefaroz reçinesi</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb, CNBr ile aktive edilen sefaroz 2B reçinesi</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - %12 SDS jelleri</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>NuPAGE cihazında gerçekleştirilen SDS-PAGE</td></tr>, <tr><td>Confokal Typhoon 9400 floresan tarayıcı</td><td>GE Healthcare</td>, <td>488 nm dalga boyunda lazerli Tarayıcıyı</td> <td>durdurdu</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>< güçlü > Tablo 4. < / güçlü > Floresan etiketleme malzemeleri</td></tr></tbody></table>

genetik olarak kodlanmış molecular probes g protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Kompleksler sinyal G protein-eşli reseptör (GPCR) yapı ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için, yeni yaklaşımlar reseptör fonksiyonunu bozmayan ifade edilen reseptörlerine bilgi sondaları veya etiket tanıtmak için gereklidir. Bu genetik olarak kodlamak için amber kodonunun bastırılması teknolojisi kullanılan doğal olmayan bir amino asit, heterolog memeli hücrelerinde ifade GPCRs çeşitli hedef konumlarda p-azido-L-fenilalanin (azf). Azido grubunun çok yönlülüğü kendi doğal hücre ortamında veya deterjan çözündürülmüş koşullar altında GPCR&#39;ler çalışma için farklı uygulamalar burada gösterilmektedir. İlk olarak, bir trityum etiketli küçük moleküllü ligand genetik olarak kodlanmış bir azido amino asit çapraz bağlı bir GPCR olan ligand bağlama cebinde kalıntılarını belirlemek için hücre bazlı bir foto-çapraz hedeflenen teknoloji göstermektedir. Daha sonra bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligasyon mina ile reaksiyona göre GPCRs siteye özgü modifikasyonunu göstermekfosfin türevleri kullanılarak azido grubunu hedef tion. Biz, bir bütün hücre bazlı bir ELISA yaklaşım kullanarak in-kültür ve algılama ifade zar proteinlerinin hedef peptide epitop etiketleme için genel bir strateji tartışılmıştır. Son olarak, AZF-GPCR&#39;ler seçici floresan probları ile etiketlendi edilebileceğini göstermektedir. Ilke olarak aktif bir sinyal kompleksi sorgulamak için GPCR ifade edilen herhangi bir amino asit pozisyonunda uygulanabilir olduğu tartışılan yöntemler, geneldir.

Bu spesifik yerinde bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı renkte bir GPCR olarak molekül probları tanıtmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi kullanılabilir. Şekil 1&#39;de şema metodoloji belirgin adımlar ve GPCRs içine, çok yönlü, UAA, p-azido-L-fenilalanin (azf) içeren çeşitli uygulamalarını açıklar. Memeli hücrelerinde AZF-GPCRs sentezlenmesi ligandlarına foto-çapraz hedefli ve bioorthogonal etiketleme kimyasalları ile peptid epitop ya da etiketleme bir GPC...

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sinyal komplekslerinin yapısal ve dinamik çalışmalarını kolaylaştırmak için hedef G-proteini kenetli reseptörlere tek bir bilgilendirici prob yerleştirmektir. Bu, eksprese edilen bir GPCR'ye doğal olmayan amino asit zeto, fenilalanin veya zeto fee'nin dahil edilmesi için gerekli translasyonel mekanizmayı eksprese eden plazmidlerin hücrelere transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. GPCR zeto fee varyantı daha sonra reseptörün yapı ve fonksiyonunu incelemek için üç farklı şekilde uygulanabilir.İlk olarak, zeto fee, trityumla işaretlenmiş bir ligandın bağlanma bölgesinin tanımlanmasını sağlayan bir foto-aktive çapraz bağlayıcı olarak GPCR'de kullanılır. Ardından zeto fee, biyortogonal etiketleme kimyaları aracılığıyla GPCR'ye peptid konjuge veya floresan bir prob eklemek amacıyla reaktif bir kimyasal tutamak olarak kullanılabilir; canlı hücre ve biyokimyasal yöntemlere dayalı olarak GPCR'lerin hedeflenmiş foto-çapraz bağlama, hedeflenmiş epitop etiketleme ve floresan etiketlemesinde moleküler prob zeto fee'nin kullanımını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, foto-afinite ligandlarının veya sistein etiketlemesinin kullanımı gibi mevcut yöntemlere g

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

G proteinlerinin G proteinine bağlı reseptörler tarafından seçici aktivasyonunu tespit etmek için basit yöntemler, hücre sinyalizasyonunda olağanüstü bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) biyosensörleri, canlı hücrelerde kontrollü konsantrasyonlarda konformasyonel değişiklikleri araştırmak için bir GPCR'nin G protein peptitlerine çift olarak bağlanmasıyla geliştirilmiştir.

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

GPCR'lerin cazip ilaçlanabilir hedefler olduğu göz önüne alındığında, GPCR ligand taraması böylece kurşun bileşiklerinin belirlenmesi ve yetimleşme çalışmaları için vazgeçilmezdir. Bu çalışmalara yönelik olarak, TEV tabanlı bir muhabir tsay'ı kullanarak yaklaşık 300 KPCR'de geçici β-arrestin2 alımının eşzamanlı olarak profilini çıkarmak için kullanılan açık kaynak kaynak platformu PRESTO-Tango'u tanımlıyoruz.

Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Bu protokol, G proteinine bağlı reseptör ligand stimülasyonu üzerine canlı HEK293 hücrelerinde G proteini aktivasyonunun gerçek zamanlı ölçümü için BRET tabanlı biyosensörlerin kullanımını açıklar. Burada, β2-adrenerjik reseptör ve kannabinoid tip 1 reseptörü, çeşitli G proteini alt tipleri ve çeşitli GPCR'ler için sensörlerin etkinliğini göstermek için örnek olarak hizmet eder.

Canlı Hücrelerde G Proteinine Bağlı Reseptör Aktivitesini Ölçmek için BRET Tabanlı G Protein Biyosensörleri

Edimsel koşullanma paradigması kullanarak rasgele nokta kinematograms ve bilgisayar tarafından oluşturulan omurgasızlar video oynatma kullanan bir kertenkele görsel duyarlılık testi.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Öğrenin, G protein-bağlanmış alıcıları yapısal biyoloji çalışmaları için p-azido-L-fenilalanin ile genetik olarak kodlanmış moleküler probler kullanarak incelemeyi. Bu yöntem, bağlanma bölgelerinin belirlenmesini sağlar.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Daha fazla video keşfet