Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sinyal komplekslerinin yapısal ve dinamik çalışmalarını kolaylaştırmak için hedef G-Protein eşleşmeli reseptörlere tek bir bilgilendirici probun tanıtılmasıdır. Bu, gerekliliği olan translasyonel mekanizmayı ifade etmek için gerekli plazmitlerle hücreleri kesmek suretiyle sağlanır. bu da, ifade edilen bir GPCR'ye yapay olmayan amino asit zeto, fenilalanin veya zeto fee'yi dahil eder. GPCR zeto fee varyansı daha sonra reseptörün yapısını ve işlevini araştırmak için üç farklı şekilde uygulanabilir.

Öncelikle, zeto fee GPCR'de bir foto aktivasyon çapraz bağlayıcı olarak kullanılır ve bu, tritye edilmiş bir ligandın bağlanma bölgesinin tanımlanmasını sağlar. Daha sonra, zeto fee, biyo ortogonal etiketleme kimyası yoluyla bir peptit eşleştirilmiş veya floresan probun GPCR'ye bağlanması için reaktif kimyasal bir saplama olarak kullanılabilir. Canlı hücre ve biyokimyasal yöntemlere dayalı olarak, GPCR'lerin hedeflenen foto çapraz bağlanması, hedeflenen epitop etiketleme ve floresan etiketlemesinde zeto fee moleküler probunun kullanımı sonuçları elde edilir. Bu tekniğin, foto afinite ligandlarının veya sistein etiketlemesinin kullanılması gibi mevcut yöntemlere kıyasla ana avantajı, bilişsel olarak inaktif ve reaktif yapay amino asit P zeto fenol alanin'i, bilinen bir pozisyondaki hedef bir reseptöre spesifik olarak tanıtma esnekliğidir.

Bu yöntem, GPCR sinyal alanındaki önemli sorulara yardımcı olabilir ve bunlar arasında, doğal membran ortamında bir reseptör LIG kompleksindeki etkileşim bölgelerinin haritalanması ve floresan tek molekül çalışmalarının, A-G-P-C-R'nin biyo ortogonal etiketleme için uygun pozisyonlarını belirleyerek kolaylaştırılması yer alır. Üçüncü olarak, bu yöntem G protein kar reseptörlerinin moleküler mekanizması hakkında içgörüler sağlayabilir ve aynı zamanda hücresel ve membran proteinlerinin çeşitli sistemlerine uygulanabilir. Bu deneyi başlamadan önce, KO'nun modifiye edilmiş kartal ortamında HEC 2 9 3 T hücrelerini, 37 derece Celsius'ta ve %5 CO2 atmosferinde %10 fetal bovin serum ile birlikte tutun.

Hücreleri, metin protokolünde açıklandığı gibi, lipektomi plus reaktifi kullanarak 10 santimetrelik bir plaka içinde G pcr, r CD, NA ile %60 ila %80 konfluansa transfekte edin. Ertesi gün, büyüme ortamını, 10%FBS ve 0.5 milimolar fee içeren DMEM ile değiştirin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, metinde açıklandığı gibi ekspresyonu analiz edin.

Bu videonun geri kalanında açıklandığı gibi foto, çapraz bağlanma veya etiketleme prosedürlerine geçin. Transfeksiyondan 48 saat sonra hücrelerden medyayı aspira edin ve dört mililitre bir x fosfat tamponlu salin veya PBS ile değiştirin. 15 dakika boyunca 37 derece Celsius'ta döndürün, böylece hücreler plaktan ayrılır. Ardından hücreleri bir XPBS ile yeniden süspanse edin ve bir Falcon tüpüne 1500 RPM'de iki dakika boyunca santrifüj yapın.

Hücreleri pelet halinde çıkarmak için süspansiyonun üzerindeki süpernatantı aspira edin ve hücre peletini, metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanmış doyurucu bağlanma konsantrasyonundaki tritye edilmiş ligandı içeren bir x Hanks tamponlu tuz çözeltisi ile yeniden süspanse edin. Hücre peletini, belirli reseptör ve liganda bağlı olan reseptör ligand kompleksi oluşumunu sağlamak için 37 derece Celsius'ta gereken süre boyunca inkübe edin. Ardından, hücre süspansiyonu 24 kuyuluk veya 96 kuyuluk bir plakaya aktarın.

Daha sonra, hücreleri buz üzerinde tutmak ve örnek ısıtması ve hücre lizininin önlenmesi için örnek ısıtması sırasında plakayı buz üzerinde tutun. Foto aktivasyonun ardından hücreleri bir einor tüpüne aktarın ve santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve analize geçin.

Hücre peletini lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Ardından hücre lizatını, 16.000 kez G'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarmada bulunmadan, süpernatantın içine 1D dört monoklonal antikor modifiye edilmiş SROs iki B reçinesini ekleyin ve GPCR'yi mühendislik yapılmış C terminal 1D dört monoklonal antikor epitopu kullanarak immüno saflandırmak için dört derece Celsius'ta bir gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, boncukları lizis tamponu ile birkaç kez yıkayın. Numuneleri 1%SDS ile 37 derece Celsius'ta bir saat boyunca sallamak ile elüte edin.

EENT'nin bir kısmını scintillasyon sıvısı içeren bir 15 mililitrelik viale aktarın ve belirli bir tritye edilmiş ligandın reseptöre özgü bağlanma miktarını kantifiye etmek için bir beta scintillasyon sayacı üzerinde sayın. Kalan saflaştırılmış EENT'yi, standart protein merdivenli bir dört ila 12%SDS jel kullanarak standart jel elektroforezi ile çözün. Ardından, immüno blotlama için A-P-V-D-F membranına yarı kuru transfer yapın.

PVDF membranını, %5 sütlü TBS tamponu içeren 0.05%Tween 20 ile blokleyin. Tam boyutlu reseptör ekspresyon