Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sinyal komplekslerinin yapısal ve dinamik çalışmalarını kolaylaştırmak için hedef G-proteini kenetli reseptörlere tek bir bilgilendirici prob yerleştirmektir. Bu, eksprese edilen bir GPCR'ye doğal olmayan amino asit zeto, fenilalanin veya zeto fee'nin dahil edilmesi için gerekli translasyonel mekanizmayı eksprese eden plazmidlerin hücrelere transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. GPCR zeto fee varyantı daha sonra reseptörün yapı ve fonksiyonunu incelemek için üç farklı şekilde uygulanabilir.

İlk olarak, zeto fee, trityumla işaretlenmiş bir ligandın bağlanma bölgesinin tanımlanmasını sağlayan bir foto-aktive çapraz bağlayıcı olarak GPCR'de kullanılır. Ardından zeto fee, biyortogonal etiketleme kimyaları aracılığıyla GPCR'ye peptid konjuge veya floresan bir prob eklemek amacıyla reaktif bir kimyasal tutamak olarak kullanılabilir; canlı hücre ve biyokimyasal yöntemlere dayalı olarak GPCR'lerin hedeflenmiş foto-çapraz bağlama, hedeflenmiş epitop etiketleme ve floresan etiketlemesinde moleküler prob zeto fee'nin kullanımını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, foto-afinite ligandlarının veya sistein etiketlemesinin kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hedef bir reseptörde bilinen bir konuma biyolojik olarak inert ve reaktif bir doğal olmayan amino asit olan P zeto fenilalanin'in bölgeye özgü olarak yerleştirilmesindeki esnekliktir.

Bu yöntem, doğal membran ortamındaki bir reseptör LIG kompleksinde etkileşim bölgelerinin haritalanması ve biyo-ortogonal etiketlemeye uygun A-G-P-C-R konumlarının belirlenerek tek moleküllü floresan çalışmalarının kolaylaştırılması dahil olmak üzere, GPCR sinyalizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Üçüncü olarak, bu yöntem G proteini kenetli reseptörlerin moleküler mekanizmasına dair içgörüler sağlayabilir ve ayrıca çeşitli hücresel ve membran proteinleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu deneye başlamadan önce, HEC 2 9 3 T hücrelerini %10 fetal bovin serum ile desteklenmiş KO modifiye eagle besiyerinde, 37 °C'de ve %5 CO2 atmosferinde muhafaza edin.

10 santimetrelik bir plakadaki %60 ila %80 konfluense ulaşmış hücreleri, metin protokolünde açıklandığı şekilde lipectomy plus reaktifi kullanarak G pcr, r CD, NA ile transfekte edin. Ertesi gün, büyüme medyasını %10 FBS ve 0.5 millimolar fee içeren DMEM ile değiştirin. Transfeksiyonun 48 saat sonrası, ekspresyonu metinde açıklandığı şekilde analiz edin.

Bu videonun geri kalanında açıklandığı şekilde fotoğraflandırma, çapraz bağlama veya etiketleme prosedürlerine geçiniz. Transfeksiyondan 48 saat sonra hücrelerdeki medyumu aspire edin ve yerine dört mililitre 1x fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin; hücrelerin plakadan ayrılmaları için 37 °C'de 15 dakika bekletin. Ardından hücreleri 1x PBS ile yeniden süspande edin ve bir Falcon tüpüne aktarıp 1500 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri çöktürmek için süpernatantı aspire edin; ardından hücre peletini, metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan ve doyurucu bağlanma konsantrasyonunda trityumla işaretli ligand içeren 1x Hanks dengeli tuz çözeltisi içerisinde yeniden süspande edin. Reseptör-ligand kompleks oluşumunu sağlamak için peleti, spesifik reseptöre ve liganda bağlı olarak gereken süre boyunca 37 °C'de inkübe edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 24 kuyucuklu veya 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın.

Ardından, numunenin ısınmasını ve hücre lizisini önlemek için plakayı buz üzerinde tutarak, 365 nanometre dalga boyuna sahip bir ultraviyole lamba ile zeto fee'yi 4 °C'de 15 dakika boyunca fotoaktive edin. Fotoaktivasyonun ardından hücreleri bir einor tüpüne aktarın ve hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve analize geçin.

Hücre peletini lizis tamponunda yeniden süspande edin ve hücreleri dört °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, hücre lizatını 16,000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarmadan önce, mühendislik ürünü C terminus 1D dört monoklonal antikor epitopunu kullanarak GPCR'yi immünopurifiye etmek için süpernatanta 1D dört monoklonal antikor modifiyeli SROs iki B reçinesi ekleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, boncukları lizis tamponu ile birkaç kez yıkayın. Numuneleri %1 SDS ile 37 °C'de, çalkalayarak bir saat boyunca elüe edin.

Sintilasyon sıvısı içeren 15 milliliter'lik bir şişeye EENT'nin bir kısmını aktarın ve trityumla işaretlenmiş ligandın reseptöre olan spesifik bağlanma miktarını belirlemek için bir beta sintilasyon sayacı ile sayım yapın. Geriye kalan saflaştırılmış EENT'yi, standart protein merdiveni kullanarak %4 ila %12 SDS jeli ile standart jel elektroforezi ile çözümleyin. Ardından, immün blotting için A-P-V-D-F membrana yarı-kuru transfer gerçekleştirin.

PVDF membranı %0,05 Tween 20 içeren TBS tamponundaki %5 süt ile bloklayın. Tam uzunluktaki reseptör ekspresyonunu doğrulamak için membranı 1D dört monoklonal antikor ile probe edin ve ardından HRP konjuge anti-US IgG sekonder antikor uygulayın. Sonrasında membranı geliştirilmiş kemilüminesans reaktifi ile işleyin.

Bantları görüntülemek için membranı otoradyografi filmine maruz bırakın. Ardından, her bir örnek şeridini ayırmak için membranı bir jiletle kesin ve ardından belirli moleküler ağırlık marker'larından kesin. Membran segmentlerini sintilasyon sıvısı içeren viallere aktarın ve ardından her bir membran segmentindeki trityum miktarını bir beta sintilasyon sayacıyla sayarak miktarını belirleyin.

Trityumun, GPCR ve ligandın toplamına eşit görünen moleküler kütlede saptanmasıyla pozitif foto çapraz bağlanmayı tanımlayın. Hücreleri yıkama ve sayma işlemlerinden sonra, 96 kuyucuklu, yüksek bağlanma kapasiteli, şeffaf tabanlı bir plakayı her kuyucukta 100 µL 10 µg/mL Poly-D-lisin ile ön işlemden geçirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Ardından, havada kurumaya bırakmadan önce 1X PBS ile defalarca yıkayın ve transfekte edilen hücreleri, kuyuk başına 60 ila 80.000 hücre yoğunluğunda 200 µL hacminde 96 kuyucuklu plakaya ekleyin ve %5 CO2 atmosferinde 37 °C'ye geri döndürün. Ertesi gün.

Hücreleri işaretleme için hazırlayın. İz kalıntıları içeren büyüme besiyerini uzaklaştırmak için her kuyucuğa 100 µL XPBS kullanarak hücreleri nazikçe üç kez yıkayın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde, 50 ila 200 µM flag Tri AAL PHOSPHINE işaretleme reaktifi içeren bir tampon hazırlayın.

Her kuyucuğa 60 µL uygulayın. Etiket işlemi ve tampon uygulanmamış bir grup kuyucuk da bulundurun. Ayrıca, zeto beslemeli GPCR varyansı ile karşılaştırmak için yabani tip bir GPCR kontrolü ekleyin.

İnkübasyonun ardından plakayı 30 dakika ile dört saat arasında 37 °C'ye geri döndürün. Reaktif olmayan işaretleyicileri tamamen uzaklaştırmak için hücreleri, kuyuk başına 100 µL bloklama tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra hücrelere kuyuk başına 100 µL %4 paraformaldehit uygulayın.

Hücreleri bloklama tamponu ile üç kez yıkayın. Önce primer antikor ile buz üzerinde 1,5 saat inkübe ederek, işaretli reseptör ve reseptör ekspresyonunu saptamak için standart bir hücre yüzeyi EISA protokolü uygulayın. Bunu, oda sıcaklığında bir saatlik sekonder antikor inkübasyonu ile takip edin.

Ardından, flag peptide epitopunu tespit etmek için 100 µL seyreltilmiş Anti-Flag M iki antikoru ekleyin. Flag. Tri AAL fosfin etiketleme reaktifi. Ayrıca, negatif kontrol olarak etiketleme işlemi uygulanmamış kuyucukları da inceleyin.

Ardından, yabanıl tip veya zeto fee GPCR hücre yüzeyi ekspresyonunu belirlemek için seyreltilmiş anti CCR five 2D seven antikorunu ayrı kuyucuk setlerine ekleyin. Hücreleri bloklama tamponu ile üç kez yıkayın ve 100 µL seyreltilmiş HRP konjuge anti-US IgG antikoru ile inkübe edin.

Hücreleri bloklama tamponu ile beş kez dikkatlice yıkadıktan sonra, 50 µL deteksiyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son olarak, 530 nm eksitasyon dalga boyunda ve 590 nm emisyon dalga boyunda floresans çok kuyucuklu plaka okuyucuda spektral verileri toplayın. Etiketleme prosedürüne, wild type veya zeto fee eksprese eden toplanmış 10 milyon hücreyi lizleyerek başlayın.

Rod opsin, bir mililitre solubilizasyon tamponunda, dört °C'de bir saat boyunca inkübe edilir. Hücre lizatının 15,000 ×g'de 10 dakika santrifüj edilmesinin ardından süpernatan fraksiyon toplanır. Ardından, mühendislik ürünü C termini 1D4 epitopunu kullanarak reseptörü yakalamak için 100 µL 1D4 monoklonal antikor modifiyeli spheros 2B reçinesi eklenir.

Dört santigrat derecede 12 saat inkübe ettikten sonra, reçineyi metin protokolünde açıklandığı şekilde üç kez yıkayın. Ardından, toplam 0,3 ila 0,5 mililitre hacme 0,1 milimolar floresein fosfin ekleyerek immünoafinite matrisine immobilize edilmiş reseptörü etiketleyin; süpernatantı uzaklaştırmadan önce oda sıcaklığında 12 saat inkübe edin ve ardından santrifüjleyin. Reaksiyona girmemiş etiketleri uzaklaştırmak için reçineyi yıkayın ve etiketli reseptörü, 100 mikrolitre Elian tamponu ile buz üzerinde bir saat inkübe ederek elüe edin.

Etiketli örnekleri indirgen koşullar altında SDS-PAGE ile ayırın. Zeto fee ile etiketlemeden önce jelleri kısaca PBS ile yıkayın. Fluorescein ile modifiye edilmiş reseptörü tespit etmek için 488 nanometre dalga boyuna sahip bir lazerle konfokal floresan tarayıcı kullanarak Ingel floresan yöntemiyle GPCR'yi belirleyin.

Amber kodon supresyon teknolojisi kullanılarak, A-G-P-C-R'ye spesifik bölgelerden moleküler problar yerleştirmek için doğal olmayan amino asit mutajenezi metodolojisi kullanılmıştır. Ardından, canlı hücrelerde GPCR ligand komplekslerinin yapısal yönlerini incelemek için foto-çapraz bağlama tekniği kullanılabilir; trityum ile işaretlenmiş radyoaktif küçük moleküllü bir ligand kullanılarak, Ravi Rock aracılığıyla G-P-C-R-C-C-R beş üzerindeki bağlanma bölgesi belirlenmiştir.

Bu örnekte, zeto fee eksprese eden hücrelerin trityumla işaretlenmiş Ravi. Rock ile ön inkübe edildikten sonra UV ışınlamasına maruz bırakılması, ligand üzerindeki hassas radyoaktif etiket kullanılarak tanımlanabilen kovalent olarak çapraz bağlı komplekslerin oluşmasıyla sonuçlanır.

CCR beş üzerindeki birkaç konum arasında, test edilen lösin 28 zeto fee ve triptofan 86 zeto fee, belirgin şekilde daha yüksek sintilasyon sayımları ile gösterildiği üzere, trityumlanmış Ravi Rock ile fototapınma oluşturabildi. Yabanıl tip reseptör, radyoaktif ligand ile herhangi bir çapraz bağlanma göstermedi. Biyoortogonal etiketleme kimyaları, bir zeto feed'i C bölgesi spesifik olarak modifiye etmek için kullanılabilir.

GPCR varyans stratejilerinden biri, canlı hücrelerdeki A-G-P-C-R'nin, konjuge bir peptit etiket olan flag peptit kullanılarak hedeflenmiş epitop etiketlemesini içerir. Bir zeto fee'yi spesifik ve seçici olarak modifiye etmek için Tri AAL PHOSPHINE etiketleme reaktifi kullanılır. Burada gösterilen CCR beş varyansı, flag peptit ile etiketlenmiş konumların belirlenmesi için kullanılan hassas ve çok adımlı bir EISA tespit stratejisinden elde edilen temsili verilerdir.

CCR5 üzerindeki konumlar arasında tüm zeto fee'ler incelenmiştir. CCR5 varyantları hücre yüzeyinde eksprese edilmiş ve yaklaşık yarısı hedefli epitop etiketlemesini başarıyla gerçekleştirmiştir; Anti-Flag sinyalinin yokluğu ile gösterildiği üzere, epitop etiketlemesi için negatif kontrol olarak vahşi tip CCR5 kullanılmıştır. Alternatif bir stratejide, deterjanla çözünür hale getirilen zeto feed G PCR'ları, Spheros 2B reçinesine konjuge edilmiş anti-1D4 monoklonal antikor gibi bir immünoafinite matrisine immobilize edilerek fluoro-4 konjuge etiketle ile işaretlenmiştir.

Ingel floresans görüntüsü, GPCR opsinin beklendiği gibi üç farklı konumda başarılı bir şekilde floresanla işaretlendiğini göstermektedir; yaban tipi opsin, reseptörün beklenen moleküler ağırlığında floresan bir bandın bulunmamasıyla görüldüğü üzere herhangi bir arka plan işaretlemesi göstermemiştir. Bu prosedür uygulanırken, hedef GPCR'nin tam lens ekspresyonunun, geliştirme işleminden sonra set spesifik olarak eklenmiş asit AOL Alanin ile doğrulandığından emin olmak önemlidir.

Bu teknik, reseptör biyolojisi alanındaki araştırmacıların herhangi bir reseptör ligand kompleksini keşfetmelerinin veya bir hedef reseptörü işaretlemelerinin yolunu açacaktır. Reaktif bir prob olarak, bölgeye özgü olarak yerleştirilmiş doğal olmayan amino asit p-zeto fenilalanin kullanılmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, hedeflenmiş fotokrosslinkleme ve biyortogonal işaretleme tekniklerini kullanarak GPCR sinyal komplekslerinin yapısal ve dinamik çalışmalarını kolaylaştırmak amacıyla, bir GPCR'ye moleküler prob yerleştirmek için doğal olmayan amino asit neogenezinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.