Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Bu prosedürün genel amacı, proteomik analiz için resmi ve sabit ve parafine gömülü veya FFPE malzemesinden peptitler üretmek ve ön fraksiyone etmektir. Bu, istenen dokunun mikrodiseksiyon ile izole edilmesi ve ardından hücre lizizi ile gerçekleştirilir. İkinci adım, numune işleme ile peptitler üretmektir.

Çoklu enzim sindirim filtresinin kullanılması, numune hazırlamaya yardımcı olur. Peptitler daha sonra tripofan floresansı ölçülerek ölçülür. Son adım, peptit fraksiyonlaması için güçlü bir anyon değiştirici bazlı ayırma tekniği kullanılarak peptitlerin fraksiyonlanmasıdır.

Sonuç olarak, hazırlanan numuneler, çok az miktarda materyalden 10.000 protein derinliğine kadar proteomların analizine izin verir. Bu tekniğin, jel veya çözelti sindirimi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, lazer mikrodiseksiyon hücreleri gibi çok küçük miktarlarda klinik numunelere uygulanabilir olmasıdır. Yöntem, mükemmellik ve saf peptitler içeren numuneler sağlar.

İnsan dokusunun ve hastalıklarının proteomik eksplorasyonunu ne kolaylaştırır? Protokolün tamamı geçmişte geliştirilen ve yayınlanan tekniklerden oluşmaktadır. Bunlar arasında, yüksek geri kazanım faspı, pipet ucu ve triptofan floresansına dayalı peptit içeriği belirleme yer alır ve prosedürün

laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Bayan Catina'nın laboratuvarımızdan bir teknisyen tarafından yerleştirileceğini gösterir. Dilimlerin kalınlığı numuneye bağlıdır. Genellikle mikrodiseksiyon, yedi ila 10 mikrometrelik dilimlerle iyi çalışır.

Membran slaytlarını 45 dakika boyunca UV ışığı ile ışınladıktan sonra, iki saat boyunca 37 santigrat derecede kurutmadan önce bölümleri üzerlerine monte edin. Monte edilmiş bölümleri, iki buçuk dakika ve bir buçuk dakika boyunca ardışık ksilen kavanozlarında art arda iki inkübasyon ile ayırın. Ardından bölümleri art arda yeniden sulandırın.

Mutlak etanolde bir dakikalık inkübasyonlar,% 70 etanol. Ve son olarak, su. Bölümleri Meyer'in Hematini ile 20 saniye boyadıktan sonra.

Bir dakika su ile durulayın ve kurumaya bırakın. Bir lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemi kullanarak ilgilenilen hücre popülasyonunu toplayın. Avuç içi aletini kullanırken, 10 nanolitre mikrodiseksiyon dokusu için üç mikrolitre doku lizis tamponu kullanarak numuneleri yapışkan kapaklarda toplayın.

Tamponu kapaktaki mikro disseke edilmiş malzemeye uygulayın ve tüpü kapatın. Kısa bir santrifüjlemeden sonra süspansiyonu toplayın. Daha sonra, mikro disseke edilmiş dokuyu 99 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda bir saat boyunca çalkalayarak bitleyin.

Ham ekstraktı 10 dakika boyunca 16.000 G ve 18 santigrat derecede santrifüjleme ile berraklaştırın. 50 mikrolitreye kadar arıtılmış lizatı 200 mikrolitre UA çözeltisi ile bir ultra filtrasyon ünitesinde karıştırın. Daha sonra, filtrede 10 mikrolitreden daha az çözelti kalana kadar 14.000 GS'de santrifüjleyin.

Genellikle bu adım 10 ila 15 dakikalık santrifüjleme gerektirir. Ardından, 200 mikrolitre UA solüsyonunu ultra filtrasyon ünitesine ve santrifüje pipetleyin. Daha önce olduğu gibi, 50 mikrolitre I A A solüsyonunu ultra filtrasyon ünitesine pipetlemeden önce toplama tüpünü boşaltın.

600 RPM'de oda sıcaklığında bir termo mikserde bir dakika karıştırın ve santrifüjleyin. Daha önce olduğu gibi, bu videoya eşlik eden metin protokolünde belirtildiği gibi ultra filtrasyon ve santrifüjleme adımlarına devam edin. Daha sonra filtrasyon ünitelerini yeni toplama tüplerine aktarın.

Termo karıştırıcıda 600 RPM'de bir dakika karıştırmadan önce 40 mikrolitre sindirim tamponunu endo proteinaz lic C ile pipetleyin. Üniteleri ıslak bir odada 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. Filtre ünitelerini daha önce yapıldığı gibi santrifüjledikten sonra, 160 mikrolitre DB tamponu ve santrifüj pipetleyin.

Havuzlanan akışın içinden geçen filtre birimleri, endoproteaz lic C tarafından salınan peptitleri içerir.Daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi triptik peptitleri toplar. Protein sindirimlerindeki peptit içeriğinin ölçümü, seyreltilmiş tamponda gerçekleştirilebilir, çünkü triptofan kalıntıları çözücü tarafından iyi bir şekilde erişilebilir durumdadır. Peptitleri ölçmek için önce 0.2 mililitre tahlil tamponu DB'yi kuvars Q vetine pipetleyin.

Ardından Q veterinerini aletlerin qve tutucusuna yerleştirin ve boşluk için emisyon spektrumunu kaydedin. Q vetine triptofan standart çözeltisinin bir mikrolitre alikotunu ekleyerek ve tampon db ile hafifçe karıştırarak 0.1 mikrogramlık adımlarla bir kalibrasyon eğrisi hazırlayın. Q veterinerini temizledikten sonra, numuneyi pipetleyin ve numune spektrumunu kaydedin.

Fraksiyonlamadan önce metin protokolünde açıklandığı gibi protein ve peptit konsantrasyonunu hesaplamaya devam edin. Altı kat EM'yi istifleyerek SAX uç sütununu hazırlayın. İyon zarını ortak bir 0,2 mililitrelik pipet ucuna aktarın. Örnek başına iki SAX uç sütunu oluşturun.

Ardından, üç kat M dört C 18 istifleyerek aşama ucunu hazırlayın. 0,2 mililitrelik bir pipet ucunda, her numune için altı aşamalı uç yapın. Başlamak.

Fraksiyonlama, sindirimle elde edilen peptit çözeltilerini ly C ile 0.2 mililitre BRI ve Robinson evrensel tamponu ile seyreltir. pH 11 benzer şekilde, tripsin ile sindirimle elde edilen peptit çözeltilerini 0.2 mililitre Britain ve Robinson Universal tamponu ile seyreltin. pH beş, SAX uç sütununu yıkamadan önce santrifüj tüp adaptör kapağına monte edin ve SAX uç sütununu ve C 18 aşamasını dengeleyerek elde edin.tage uçlar metin protokolünde belirtildiği gibi.

Ardından, SAX uç sütununu C 18 kademeli uca monte edin. Numune çözeltilerini Dengelenmiş SAX uç sütunlarına yükleyin ve sütunları üç dakika boyunca 5.000 Gs'de santrifüjleyin. Pipet ucu sütunlarını 0,1 mililitre seyreltilmiş numunelerle yıkayın.

5.000 Gs'de santrifüjleme ile akışı kolaylaştırın.SAX uç sütununu bir sonraki C 18 aşamalı uca aktarın ve metin protokolünde açıklandığı gibi peptitleri elüte etmeye devam edin. C 18 aşamalı uçları 0.05 mililitre tampon a ile yıkadıktan sonra, fraksiyonları 0.05 mililitre tampon B ile şişelere boşaltın, daha sonra numunelerin bir kütle spektrometresi temsilcisi ile monte edilmiş bir sıvı kromatografi sistemine enjeksiyonu için kullanılır. Protein ekstraksiyonu ve sindiriminin sonuçları burada gösterilmektedir.

10 mikrometrelik bir dilimden 25 milimetre karelik mikro diseke edilmiş bir alana karşılık gelen 250 nanolitre dokunun parçalanması, endo proteaz dilimi C ve tripsin ile oruç formatında iki aşamalı ardışık sindirimi takiben yaklaşık 45 mikrogram toplam protein ile sonuçlanır toplam proteinin% 50'sinden fazla verim ile sonuçlanır. Burada gösterilen, peptit içeriğinin temsili bir floresan ölçümü, Trytophan standardının spektrumları ve numunenin 350 ila 360 nanometrede maksimum göstermesidir. Floresansın yoğunluğu, tripofan içeriği ile orantılıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, mikrodiseksiyon tekniği, numune işleme ve peptit fraksiyonasyonu kullanılarak proteomik analiz için yüksek dokudan numunelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik üç ila dört saat artı protein hazımsızlığı için gereken bir sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, geliştirildikten sonra taze hazırlanmış doku dilimleri kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, proteomik alanındaki araştırmacıların, sabit ve paren gömülü materyal için arval kullanarak doku ve hücrelerin proteomlarını ve insanlardaki anormallikleri keşfetmelerinin yolunu açtı.