Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Bu prosedürün genel amacı, laringeal sinir hasarı modelinde olfaktor ve kılıf hücrelerinin kullanımına dayalı bir hücresel transplantasyon modeli sunmaktır. Bu işlem, öncelikle recurrens laringeal sinirin kesilmesi ve anastomozunun gerçekleştirilmesiyle sağlanır. Ardından, olfaktor mukoza veya olfaktor bulbüllerden elde edilen olfaktor ve kılıf hücreleri transplant edilir.

Ardından, ameliyattan iki ila üç ay sonra hayvanlar laringoskopi ve elektromiyografi ile değerlendirilir. Son olarak, histolojik çalışmalar için n. laryngeus recurrens izole edilir. Nihayetinde, laringoskopi, elektromiyografi ve histolojik ölçümler aracılığıyla olfaktör ve kılıf hücrelerinin n. laryngeus recurrens'in aksonal yeniden büyümesini ve ses tellerinin fonksiyonel iyileşmesini geliştirdiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, aksonal büyümenin ölçülmesini ve iyileşmenin işlevselliğinin nicelleştirilme yeteneğini içeren periferik sinir yaralanması alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, tekrarlayan lal sinir anastomozunun mikrocerrahi beceriler gerektirmesi nedeniyle zorlanacaklardır. Yazılı protokolde belirtildiği gibi, koku soğanlarının (OB) veya koku mukozasının (OM) GFP etiketli primer kültürleri oluşturulduktan sonra, tüm aletleri otoklavlayarak cerrahiye hazırlanın.

Sıçan, ketamin ve klorpromazinle intraperitonal enjeksiyon yoluyla anestezi edildikten sonra, ayak parmağı sıkıştırma testi ile sedasyon düzeyi doğrulanır, cerrahi bölge tıraş edilir ve sıçan dorsal dekubitus pozisyonuna getirilir; cilt, alkol ve Betadine solüsyonu ile ardışık yıkamalarla dezenfekte edilir. Ardından, steril bir cerrahi ortam hazırlanır ve ameliyat boyunca steril prosedürler uygulanır.

İki santimetrelik bir medial servikal kutanöz insizyon yapmak için bir skapel kullanın. Ardından, medial beyaz çizgiyi takip ederek, infra hyoid kaslar arasında bir ortostatik retraktör kullanarak infra hyoid kasların vertikal insizyonunu gerçekleştirin. Larinksi ve ardından rekürent laringeal siniri veya RLN'yi açığa çıkarın.

Ardından, cerrahi bir mikroskop altında, mikro makas kullanarak yedinci trakeal halka seviyesinde siniri tamamen kesin ve 11 T dikişle tek nokta sabitleme yapın. Transplantasyon hemen öncesinde laringesi denerve etmek için anastomoz gerçekleştirin. Kaplardaki OB ve OM hücrelerini uzaklaştırmak için %0,05 trypsin EDTA kullanın.

Ardından sindirimi durdurmak için, hücreleri 432 G'de beş dakika santrifüj ettikten sonra beş mililitre ılık besiyeri ekleyin. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve bu modeldeki hücresel konsantrasyonu 1,2 ile 6 × 10⁶ hücre arasında ayarlayın; 30 µL D-M-E-M-F 12 içinde mikro santrifüj tüpünde kullanılmıştır. Hücreler ile büyüme faktörü ve düşük konsantrasyonlu matrigel için 1:2 oranında bir karışım hazırlayın ve transplantasyondan hemen önce buz üzerine yerleştirin.

Tüpü buzdan çıkarın ve karışımı ısıtmak için elinizde tutun. Bir pipet kullanarak hücre matrigel solüsyonunu anastomoz bölgesine bırakın ve karışımın donduğunda hasarlı sinir üzerinde kendi kendine birleşmesine izin verin. Kasları ve cildi kapatmak için 4-0 sütürler kullanın.

Sıçanı tekli bir kafese yerleştirin ve 24 saat boyunca ısıtıcı lamba altında tutun. Anestezi uyguladıktan sonra, cerrahi işlemden yaklaşık iki ay sonra, sonraki beş gün boyunca analjezikler uygulayın. Bu videonun önceki bölümlerinde açıklandığı şekilde, sedasyonu doğrulamak için ayak parmağı sıkıştırma yöntemini kullanın.

30 derecelik bir video laringoskop yerleştirmeden önce sıçanı sırtüstü pozisyona getirin. Her kayıt için aynı görüntünün elde edilmesini sağlamak amacıyla, laringokoskopu larinksin en iyi görünümünü sağlayacak şekilde ayarlayın. Posterior komissür, sağ vokal kordun OID vokal apofizine eklemlendiği nokta ve sol vokal kordun OID vokal apofizine eklemlendiği nokta gibi anatomik işaretleri belirleyin.

Ardışık üç maksimum abdüksiyon ve maksimum addüksiyon dizisi seçilerek vokal kord hareketlerini kaydedin. Larinks fonksiyonunu analiz etmek için, vokal kordların maksimum abdüksiyon ve maksimum addüksiyon hareketleri arasındaki farkı ölçerek mutlak açısal hareketi belirleyin. Elektromiyografi gerçekleştirmek için hareket genliğini ölçerek dinamik skoru, sinkinezi ve paradoksal hareketleri ölçerek ise fonksiyonel skoru belirleyin.

Rekürren sinir anastomozu için gösterildiği üzere laringi ve trakeayı açtıktan sonra, sıçanın hamstring kasına bir elektrot yerleştirin. Krikotiroid kıkırdağı açığa çıkarın. Ardından, mikro makas kullanarak, posterior krikotiroid veya PCA kasını açığa çıkarmak için krikotiroid kıkırdağını açın.

Hayvan spontan ventilasyon altındayken, kas içine monopolar bir iğne elektrot yerleştirin. PCA kasının elektriksel kas aktivitesini kaydetmek için bir veri toplama sistemi kullanın. Kas aktivitesini, aşağıdaki ölçeği kullanarak sıfırdan üçe kadar kalitatif bir puan atayarak, zenginlik ve solunumla senkronizasyon açısından analiz edin.

Sıfır, inspirasyon sırasında artış göstermeyen denenmemiş bir izlemeye eşittir. Bir, inspirasyonun arttığı ritmik bir izlemeye eşittir; ancak zayıf olan iki, daha zengin aktiviteye sahip ritmik bir izlemeye ve üç ise ritmik bir izlemeye eşittir. Bu, maksimal bilinçli aktiviteye benzer bir girişim deseni oluşturan oldukça zengin bir durumdur.

Ardından, küçük boyutu nedeniyle RLN'ye zarar vermeyi önlemek için vagus sinirini açığa çıkarın, ardından bir elektrot bağlayın ve bu bölgeyi uyarın. PCA kasındaki latans ve potansiyel süresini kaydedin. Son olarak, hayvanı mikroskop altında pentobarbital aşırı dozuyla sakrifiye ettikten sonra anastomozu bulun, RLN'nin anastomoz ile larenks arasındaki distal kısmını sütüre edin ve çıkarın.

Koku mukozası ve koku soğanlarının primer kültürlerinden alınan hücrelerin transplantasyonundan sonra, burada gösterilen metin protokolüne göre histolojik analiz gerçekleştirin; bunlar solunum sırasında PCA kasında elde edilen EMG izlerinin örnekleridir. Kontrol grubundaki hayvanlar, Rerated grubunda görülmeyen ve inspirasyon sırasında artış gösteren zengin bir elektriksel kas aktivitesi sergilemiştir. Bu şekilde, toluidin mavisi boyaması ile RLN'nin histolojik analizleri; normal, yeniden innerve edilmiş ve transplantasyon yapılmış hayvanlardan gelen tipik fiber profillerini göstermektedir.

Bu ölçüm, burada gösterildiği gibi miyelinli fiberlerin sayısının, fiberlerin ortalama boyutunun ve miyelin ortalama kalınlığının kantifikasyonuna olanak tanır. Histolojik analizleri tamamlamak için, siyatik sinire yapılan intra-nervöz transplantasyonun ardından GFP pozitif hücrelerin takibi gerçekleştirildi.

RLN yerine bu bölgenin seçilme nedeni, RLN'nin küçük boyutunun sinir içi transplantasyonu engellemesidir. Geri döner laringeal sinirin uç uca anastomozu, uygun şekilde geliştirildikten sonra 15 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu teknikler, periferik sinir yaralanması alanındaki araştırmacıların hücre transplantasyonunun kullanımını bir sıçan modeli üzerinde keşfetmelerine olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, tekrarlayan sinir yaralanması modelinde hücre naklinin nasıl yapılacağı ve ses tellerinin fonksiyonel iyileşmesinin elektromiyografi, laboratuvar endoskopisi ve histolojik ölçümler aracılığıyla nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.